ミトコンドリアカルシウムユニポーターの

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ミトコンドリアカルシウムユニポーターのコイルドコイルドメインの構造機能解析

2020

大園瑞音

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第 1 章序論

1-1 ミトコンドリアのCa²⁺取込機構

ミトコンドリアの Ca ホメオスタシスは、真核生物における細胞の生存と好気的な代謝において重要な役割を果たしている[1-3]。ミトコンドリアにおける Ca²⁺の過剰な蓄積は、ミトコンドリア内膜の透過性を亢進させることが知られており、この現象は透過性遷移と呼ばれている。透過性遷移はアポトーシスやネクローシスを引き起こし[4-6]、様々な種類の疾患に関与している[7,8]。そのため、ミトコンドリアへの Ca²⁺の取込機構を解明することが、それらの疾患の治療に繋がると期待される。ミトコンドリアカルシウムユニポーターは、ミトコンドリアのマトリクス内にCa²⁺を取り込む、高い選択性を持つイオンチャネルである[9-11]。

カルシウムユニポーターの活性は 1960 年代に発見され、当初はミトコンドリア内膜を介した膜電位に依存してCa²⁺を取り込むことや、その機能に他のイオンを必要としないことが示されていた

[9,11]。カルシウムユニポーターは複数のサブユニットから成る複合体であり、この10年でその構

成分子が次々に発見された。現在、カルシウムユニポーターは、mitochondrial calcium uniporter

（MCU）[12,13]、mitochondrial calcium uptake 1, 2, 3（MICU1, MICU2, MICU3）[14,15]、

mitochondrial calcium uniporter regulator 1（MCUR1）[16]、MCUb[17]、essential MCU regulator（EMRE）[18]の 7 つのサブユニットから成ることが明らかになっている（Fig.1-2）。MCU は二箇所の膜貫通領域を持ち、オリゴマー化することでカルシウムユニポーターのチャネル孔を形成するサブユニットである[12,13]。また、MICUのアイソフォームはMCUオリゴマーによるCa²⁺

の取込みの調節因子として協同的に機能し[19-21]、MICU1は見かけ上のイオン選択性にも寄与 カルシウムユニポーター

内膜 膜間領域 マトリクス 外膜

Fig.1-1 ミトコンドリアにおけるCa²⁺の輸送機構

カルシウムユニポーターはミトコンドリアの内膜に存在するCa²⁺取込機構である。

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している[22]。MCUR1はMCUとEMREの複合体の安定性および、Ca²⁺の取込みが起こる閾値の調節に必要であると考えられている[23,24]。哺乳類のミトコンドリアにおいて、EMRE は MCU による Ca²⁺の取込みに必須の因子であるが[18,25,26]、その取込機構における機能的な役割は未だに不明である。

1-2 MCU（mitochondrial calcium uniporter）

MCUは、広く保存された複数のドメイン構造を持っている[27]。MCUはN 末端にミトコンドリア移行シグナル（MTS）と、それに続くN末端ドメイン（NTD）を有する（Fig.1-3）。一方で、MCUのC 末端領域は二箇所の膜貫通領域（TM1およびTM2）、二箇所のコイルドコイルドメイン（CC1およびCC2）、TM1とTM2の間に位置する高度に保存されたWDxxEPモチーフを有する。WDxxEP モチーフは、ミトコンドリア内膜の膜間領域側に位置する[28]。過去に行われた研究で、WDxxEP モチーフにおけるアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基がカルシウムユニポーターによる Ca²⁺

の取込みに重要であり、このモチーフが Ca²⁺選択性フィルターを形成することが示された[12,13]。これまでに、MCUの立体構造について様々な研究が行われてきた。はじめに、LeeらがヒトMCU のNTDのX線結晶構造を明らかにした。この実験により、NTDのセリン残基のリン酸化がミトコンドリアのCa²⁺取込機能を活性化することが示された[29]。その後NMR と cryo-EM を用いて、

OxenoidらがNTDを欠損したCaenorhabditis elegansのMCUの構造を明らかにした。この実験で得られた立体構造モデルでは、MCUは五量体を形成していた[30]。また、最近4つの独立したグループがNTDを含むfungiおよびzebrafishのMCUの構造を明らかにしたが、これらの実験で得られたMCUの構造は五量体ではなく四量体を形成していた[31-34]。MCU四量体モデルにおけるいくつかの機能的ドメインの構造は、MCU の五量体モデルにおける構造とは異なってい

内膜マトリクス膜間領域

MCU EMRE MCUb

MCUR1 MICU1 MICU2 MICU3

Fig.1-2 ミトコンドリアのカルシウムユニポーターを構成するサブユニット

現在同定されているカルシウムユニポーターの 7 種類のサブユニットを示す。これまでに、

MCU、MICU1, 2, 3、MCUR1、MCUb、EMREが発見されている。

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3

た。MCU の立体構造と、過去の生物学的な突然変異研究の知見を組み合わせることで、

WDxxEPモチーフがどのようにチャネル孔の入り口を形成し、Ca²⁺選択性フィルターとして機能す

るのか理解することができる。一方で、Ca²⁺取込機能におけるMCUのWDxxEPモチーフ以外の領域の役割は、分かっていない。したがって、Ca²⁺が MCU の膜間領域側に位置する WDxxEP モチーフによる選択性フィルターを通過した後、どのようにして内膜およびマトリクスに位置するドメインを通ってマトリクスに輸送されるのかは不明である。

1-3 目的

カルシウムユニポーターの複合体は幅広い生物種で保存されているが、酵母 S.cerevisiae は哺乳類のカルシウムユニポーターを構成するサブユニットのオルソログを持たない[27]。実際に、

酵母のミトコンドリアはCa²⁺取込機能を完全に欠損している[35,36]。したがって、酵母発現系を利用することで、哺乳類のカルシウムユニポーターを構成する特定のサブユニットを発現させた酵母ミトコンドリアを、容易に作製することが可能になる。このミトコンドリアを利用することで、特定のサブユニットの構造と機能を選択的に解析することが出来る[25,37]。当研究室ではこれまでに、野生型のマウスのカルシウムユニポーターの酵母発現系を確立した。この発現系を利用することで、

酵母ミトコンドリアに、哺乳類のカルシウムユニポーター複合体の特性を正確に再構成することが出来る[26]。本研究ではこの酵母再構成系を利用して、マウス MCU の様々な領域における構造

内膜マトリクス膜間領域

WDxxEP

TM1 TM2

NTD

CC1 CC2

Fig.1-3 mitochondrial calcium uniporter（MCU）の構造

MCU は二箇所の膜貫通領域（TM1、TM2）を持つ二回膜貫通型のタンパク質であり、TM1 と TM2に挟まれた領域にWDxxEPモチーフが存在する。N末端の領域をNTD、高度に保存された二箇所のコイルドコイルドメインをCC1およびCC2として図示する。

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4 と機能の関係性を解析した。

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第 2 章 Ca

²⁺

取込機能に重要な MCU の領域

2-1 緒言

ミトコンドリアのカルシウムユニポーターは、高い選択性を持つカルシウムイオンチャネル複合体である。カルシウムユニポーターのサブユニットとしてこれまでに、MCU、MICU1, 2, 3、

MCUR1、MCUb、EMREが同定されている。そのなかでも、MCUは二箇所の膜貫通領域を持ち、

オリゴマー化することでカルシウムユニポーターのチャネル孔を形成するサブユニットである[1-3]。

過去の解析で、MCU が持つ WDxxEP モチーフが Ca²⁺選択性フィルターを形成し、Ca²⁺の取込みに重要であることが示された。しかし、カルシウムユニポーターの Ca²⁺取込機能における、

MCU の WDxxEP モチーフ以外の領域の役割は、まだ十分に研究されていない。本研究では酵

母再構成系を利用して、マウスMCUの様々な領域の構造と機能の関係性を解析した。

2-2 結果

2-2-1 マウスMCU変異体（欠損体）の構築

マウスの MCU は 350 アミノ酸残基から成る、二回膜貫通型のタンパク質である。マウスの MCUには様々な機能を有するモチーフやドメインが存在し、Met1-Thr49のMTS、Val74-Arg164 の NTD、Ile191-Arg220（CC1）と Arg310-Gln338（CC2）の二箇所のコイルドコイルドメイン、

Trp259-Pro264 の WDxxEP モチーフ、Leu233-Glu256（TM1）とVal265-Val282（TM2）の二箇所の膜貫通領域があげられる。過去の解析では、WDxxEPモチーフにおけるアミノ酸残基の変異がカルシウムユニポーターの機能の喪失を引き起こすことが示された[4,5]。今回の実験では、

WDxxEPモチーフ以外のCa²⁺取込機能に重要な領域を調べるために、まずMCUの様々な領域

を欠損させた変異体を構築した。構築したマウスMCU の変異体はC 末端に FLAG タグがついた Δ51-100（ ΔHis51-Leu100）、 Δ101-150（ ΔLys101-Leu150）、 Δ151-190（ ΔVal151- Cys190）、Δ191-220（ΔIle191-Arg220）、Δ310-350（ΔArg310-Glu350）の5つである（Fig.2-

1）。また、共発現させる EMREのC末端には MYCタグを付加した。次に、変異を導入していな

い全長のマウスMCUまたは各MCU変異体の酵母発現用プラスミドとEMREの酵母発現用プラスミドを、共に野生型酵母株W303-1Bに導入した。

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続いて、酵母のミトコンドリアにおける各MCUおよびEMREの発現レベルを確認するために、

各酵母発現用プラスミドを導入した酵母株からミトコンドリアを単離した。このミトコンドリアをSDS- PAGEに供した後、抗FLAG抗体と抗MYC抗体を用いたWestern blottingを行った（Fig.2-2）。

実験の結果、抗FLAG抗体を用いた場合では、変異を導入していないMCUおよび各MCU変異体全てにおいて、それらの分子量に相当するバンドと、その下にもう 1 本バンドが検出された。

組織のミトコンドリアを使った解析から、変異を導入していない MCU においては上側のバンドが変異を導入していない全長のMCU、下側のバンドが、MTSが切断された成熟体のMCUであると考えられる（data not shown）。このことから、各MCU変異体の結果についても、2本のバンドのうち低分子量側のバンドが成熟体のMCU変異体であると考えられる。また、抗MYC抗体を用いた場合では、いずれの酵母ミトコンドリアにおいても EMRE の分子量に相当するバンドが検出された。ミトコンドリアのマーカータンパク質であるリン酸キャリア（PiC）に対する抗体を用いた場合では、全てのレーンにおいて同等のシグナル強度のバンドが検出されたことから、等量のミトコンドリアが実験に供されたことが確認された。

これらの結果から、それぞれのミトコンドリアにおいて各 MCU 変異体が変異を導入していない全長のMCUと同等のタンパク質レベルで発現していることが確認された。

Fig.2-1 全長のマウスMCUと構築したマウスMCUの変異体

変異を導入していない全長のマウスMCU と、本研究で構築したマウス MCU 変異体（欠損体）

を示す。図中に Met1-Thr49 の MTS、Val74-Arg164 の NTD、Ile191-Arg220 および Arg310- Gln338 のコイルドコイルドメイン（それぞれ CC1 およびCC2）、Leu233-Glu256 およびVal265- Val282の膜貫通領域（それぞれTM1およびTM2）を示し、TM1とTM2の間に位置する Trp259- Pro264の領域にはWDxxEPモチーフが存在する。

1 50 100 150 200 250 300 350

MCU 全長

Δ51-100 Δ101-150 Δ151-190 Δ191-220 Δ310-350

TM1

MTS NTD CC1 TM2 CC2

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2-2-2 マウスMCU変異体（欠損体）におけるCa²⁺取込機能

続いて、マウス MCU に導入した変異がミトコンドリアの Ca²⁺取込機能に及ぼす影響を調べるために、全長のMCUまたは各 MCU 変異体およびEMREを共発現させた酵母ミトコンドリアにおける Ca²⁺の取込みを測定した（Fig.2-3）。測定には、Ca²⁺と結合することで蛍光を発する蛍光指示薬であるCalcium Green-5Nを使用した。Calcium Green-5Nはミトコンドリア内膜を通過できないため、マトリクス内のCa²⁺とは結合できない。そのため、ミトコンドリアが Ca²⁺を取り込む場合は蛍光の値が小さくなり、ミトコンドリアがCa²⁺を取り込まない場合は蛍光の値が大きくなる。

ネガティブコントロールとして空ベクターを導入した酵母のミトコンドリアは Ca²⁺取込機能を持たないため、Ca²⁺を添加してもミトコンドリアへの取込みは起こらず、蛍光の値は変化しない。一方で、変異を導入していない全長のMCU とEMREを共発現させた酵母のミトコンドリアは Ca²⁺取込機能を有するため、Ca²⁺を添加した際に速やかな Ca²⁺の取込みが起こり、それに伴い蛍光の値が減少する。続いて、各 MCU 変異体と EMRE を共発現させた酵母のミトコンドリアにおける Ca²⁺の取込みを測定した。その結果、Δ51-100のMCU変異体では、全長のMCUよりもわずかに低いCa²⁺取込活性を示した。一方、Δ101-150、Δ151-190のMCU変異体を発現させた酵母ミトコンドリアでは、全長のMCUと比べてCa²⁺取込活性が50%低下した。また、Δ191-220および

Δ310-350のMCU変異体は、Ca²⁺取込機能を完全に喪失していた。これらの結果から、MCUの

lle191-Arg220 および Arg310-Glu350 の領域がカルシウムユニポーターの Ca²⁺取込機能に重 Fig.2-2 酵母のミトコンドリアにおけるマウスMCU変異体の発現確認

変異を導入していない全長のマウスMCUあるいは各マウスMCU変異体とEMREを共発現させた酵母株のミトコンドリアを単離し、1 レーンにつきタンパク質 20 µg 分を、SDS-PAGE に供した。Control は空ベクターを導入した酵母のミトコンドリアを示す。続いて、分離したタンパク質を抗 FLAG抗体、抗MYC抗体、抗PiC抗体を用いたWestern blottingに供した。

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12 要であることが示唆された。

2-2-3 Ca²⁺取込機能を持たないMCU変異体の細胞内における局在

マウス MCU の lle191-Arg220 または Arg310-Glu350 の欠損体においてミトコンドリアへの Ca²⁺取込機能が喪失する原因として、タンパク質のミトコンドリアへの移行に不具合が生じている可能性が考えられる。そこで、各 MCU 変異体の細胞内における局在を調べた。まず、C 末端に EGFP（高感度緑色蛍光タンパク質）が融合した全長のマウス MCU または各 MCU 変異体を酵母ミトコンドリアに発現させ、各酵母細胞における蛍光を蛍光顕微鏡で観察した（Fig.2-4）。ミトコンドリアの染色は、膜電位に依存してミトコンドリアに蓄積するMitoTracker Redを用いて行った。

実験の結果、どちらのMCU変異体も全長のMCUと同様にミトコンドリアに局在していたことから、

これらのMCU変異体におけるCa²⁺取込機能の喪失は、少なくともミトコンドリアへの移行の不具合によるものではないことが示された。

Fig.2-3 マウスMCU変異体（欠損体）におけるCa²⁺取込機能

（左）変異を導入していない全長のマウスMCUあるいは各MCU変異体（欠損体）とEMREを共発現させた酵母株のミトコンドリアを単離し、Ca²⁺の取込みを測定した。（右）各酵母のミトコンドリアにおける相対的な Ca²⁺の取込量を示す。全長のマウス MCUと EMREを共発現させた野生型酵母のミトコンドリアにおける取込量を1として、蛍光強度の変化から算出した。

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13 2-2-4 マウスMCUにおけるコイルドコイル構造の形成

マウスMCUのlle191-Arg220およびArg310-Glu350の領域には、様々な生物種のMCUにおいて保存されているコイルドコイルドメインが存在していると予想される[6]。そこで、これらの領域の詳細な分析を行うために、COILS というコイルドコイルの推定ソフトウェアを用いて、マウス MCUのアミノ酸配列全長について解析を行った（Fig.2-5）[7]。解析の結果、マウスのMCUは、コイルドコイルドメインを含む二箇所の領域を持つことが示唆された。アミノ酸配列を 14、21、28 残基ごとに探索する 3 種類のウィンドウを使用した解析を行ったところ、Fig.2-5 に示すように、

Glu199-Val219およびTyr316-Pro336の領域において高いScoreが検出された。このScoreが高いほど、コイルドコイル構造を形成している確率が高いことを示している。Glu199-Val219 およびTyr316-Pro336 の領域は、それぞれCC1（Ile191-Arg220）および CC2（Arg310-Gln338）に含まれており、Ca²⁺取込機能を喪失したMCU変異体で欠損させた領域と一致している。このことから、MCUの機能の喪失がコイルドコイル構造に起因する可能性が示唆された。

Fig.2-4 酵母細胞内におけるマウスMCU変異体（欠損体）の局在

Ca²⁺取込機能を有さない2種類のマウスMCU変異体（Δ191-220、Δ310-350）の、酵母細胞内局在を確認した。全長のマウスMCUおよび各変異体のC末端にはEGFPを付加しており、ミトコンドリアの染色はMitoTracker Redを用いて行った。

(20)

14

2-2-5 Ca²⁺取込機能におけるコイルドコイル構造の重要性

COILSによる解析で見出された二箇所の領域におけるコイルドコイル構造の形成が、ミトコンド

リアの Ca²⁺取込機能に必要であるのかを調べるために、それぞれの領域におけるコイルドコイル構造の形成を阻害するような変異を導入したマウスMCU点変異体を構築し、Ca²⁺取込機能に与える影響を調べた。

コイルドコイル構造は、2本のαヘリックス鎖から成る超らせん構造であり、特徴的な7アミノ酸残基（abcdefg）の繰り返し配列を持つ[5,6]。aとdの位置にはLeuやIleのような疎水性アミノ酸残基が、eとgの位置には親水性アミノ酸残基がそれぞれ存在することが多く、2本のαヘリック

Fig.2-5 予測されるコイルドコイル構造の形成領域

COILSによって予測された、マウスMCUにおけるコイルドコイル構造の形成確率を示す。全長のマウスMCUの図において赤色で表示された領域は、欠損させることでCa²⁺取込機能が喪失した領域を示す。（上段）横軸にアミノ酸番号、縦軸に解析によって得られたScore値をプロットしており、このScore値が大きいほどコイルドコイル構造を形成している確率が高くなる。すなわち、グラフのピークがコイルドコイル構造を形成している確率が高い領域を表している。解析に利用した 14、21、28アミノ酸残基の3種類のウィンドウによる解析結果はそれぞれ緑、青、赤で表示されている。（下段）解析で得られたアミノ酸残基ごとのScore値（9が100%に相当）を記しており、コイルドコイル構造を形成していると予測された領域をCC1、CC2と示す。Heptadはコイルドコイル構造の特徴的な7アミノ酸残基の繰り返し配列をabcdefgの7つのアルファベットで示したものである。また、helixはαヘリックスの構造をとっている可能性が高い領域を示す。

1 50 100 150 200 250 300 350

MCU 全長 MTS NTD TM1 TM2

(21)

15

ス鎖はaとdのアミノ酸残基の間における疎水性相互作用と、eと gのアミノ酸残基の間における静電的相互作用によってコイルドコイル構造を安定化させていると考えられる。今回の解析では、Fig.2-5 で示したように少なくとも CC1内では LEDLKQQ（206-212）、LAPLEKV（213-219）

の2回、CC2内ではYNQLKDA（316-322）、IAQAEMD（323-329）、LKRLRDP（330-336）の3 回の繰り返し配列がそれぞれ認められた。

先程も述べたように、各7アミノ酸残基の繰り返し配列のうち、aとdの疎水性アミノ酸残基がコイルドコイル構造における相互作用に重要であることが知られている[7,8]。この2 つのアミノ酸残基を特にかさ高い側鎖を持つ疎水性アミノ酸である Phe に置換すると、αへリックスの形成には大きな影響を与えることなく、2 本のαヘリックス間の相互作用を弱めることでコイルドコイル構造の形成を阻害することが出来る[8-10]。そこで、COILS による解析でコイルドコイル構造を形成していることが予測された領域における繰り返し配列について、a と d のアミノ酸残基を Phe（F）に置換した5種類のMCU点変異体（L206F,L209F、L213F,L216F、Y316F,L319F、I323F,A326F、

L330F,L333F）を構築し、EMREと共に酵母に導入した（Fig.2-6）。

まず、各酵母株のミトコンドリアにおけるそれぞれの MCU点変異体とEMREの発現を確認するために、各酵母株から単離したミトコンドリアをWestern blottingに供した（Fig.2-7）。MCU欠損体と同様、各MCU点変異体のC末端にはFLAGタグが、EMREのC末端にはMYCタグが付

Fig.2-6 コイルドコイル構造の形成を阻害するような点変異を導入した

マウスMCUの変異体

Ca²⁺取込機能に影響を与える二箇所の領域においてコイルドコイル構造を形成すると推定される配列を、abcdefgの7アミノ酸残基の繰り返し単位ごとに示している。アスタリスク（*）は予測された繰り返し配列のうち、変異を導入したaとdの位置のアミノ酸残基を示す。

IEQHQLNKERELVERLEDLKQQLAPLEKVR

RFDLEKYNQLKDAIAQAEMDLKRLRDPLQ

191

310

209

333

206 213 216 219

323 319

316 326 330 336

abcdefgabcdefgabcdefg abcdefgabcdefg

L206F, L209F

L330F, L333F I323F, A326F Y316F, L319F L213F, L216F

*

* *

*

* *

*

変異体名アミノ酸配列変異の導入箇所

a,d a,d

a,d a,d a,d 191-220

（CC1）

310-338

（CC1）

領域

(22)

16

加されている。実験の結果、各酵母株のミトコンドリアにおいてMCUとEMREが良好に共発現しており、全てのMCU点変異体は全長のMCUと同等のタンパク質レベルで発現していた。また、

全てのレーンにおいてミトコンドリアのマーカータンパク質である PiC のバンドがほぼ同等のシグナル強度で検出されたことから、等量のミトコンドリアが実験に用いられたことが確認できた。

続いて、マウス MCU に導入した点変異がミトコンドリアの Ca²⁺取込機能に及ぼす影響を調べるために、変異を導入していない全長のMCUまたは各MCU点変異体およびEMREを共発現させた酵母ミトコンドリアにおけるCa²⁺の取込みを測定した（Fig.2-8）。

ネガティブコントロールである空ベクターを導入した酵母のミトコンドリアでは Ca²⁺を添加してもミトコンドリアへの取込みは起こらなかった。一方、変異を導入していないMCU と EMRE を共発現させた酵母のミトコンドリアにおいては、Ca²⁺の取込みが起こることが確認された。次に、各 MCU点変異体とEMREを共発現させた酵母のミトコンドリアにおけるCa²⁺の取込みを観察した。

その結果、MCU(L330F,L333F)のように僅かな取込活性を示す変異体も認められたものの、総じてCa²⁺取込活性が顕著に低下することが明らかになった。

Fig.2-7 酵母のミトコンドリアにおけるマウスMCU変異体（点変異体）の発現確認

変異を導入していない全長のマウスMCUあるいは各マウスMCU点変異体とEMREを共発現させた酵母株のミトコンドリアを単離し、1レーンにつきタンパク質20 µg分を、SDS-PAGEに供した。Control は空ベクターを導入した酵母のミトコンドリアを示す。続いて、分離したタンパク質を抗 FLAG抗体、抗MYC抗体、抗PiC抗体を用いたWestern blottingに供した。

(23)

17

これらの実験から、MCUのCC1およびCC2におけるコイルドコイル構造の形成がカルシウムユニポーターの Ca²⁺取込機能において重要な役割を果たしていることが示唆された。しかしこの結果だけでは、CC1 および CC2 とコイルドコイル構造を形成しているパートナーである分子を特定することは出来なかった。

Fig.2-8 マウスMCU変異体（点変異体）におけるCa²⁺取込機能

（A）変異を導入していない全長のマウスMCUあるいは各MCU変異体（点変異体）とEMREを共発現させた酵母株のミトコンドリアを単離し、ミトコンドリアへのCa²⁺の取込みを測定した。矢印で示した時間に30 µMのCaCl2を添加した。（B）各酵母のミトコンドリアにおける相対的なCa²⁺の取込量を示す。全長のマウスMCUとEMREを共発現させた野生型酵母のミトコンドリアにおける取込量を1として、蛍光強度の変化から算出した。

(24)

18 2-3 考察

MCUは多くの生物種間で保存されており、すべてのMCUでは二箇所のコイルドコイルドメイン

が WDxxEP モチーフと同様保存されている。これまでにカルシウムユニポーターの Ca²⁺取込機

能におけるMCUのWDxxEPモチーフの機能的な役割は十分に調べられてきたものの[11,12]、

コイルドコイルドメインの機能的な役割は研究されていない。

本研究では、マウスMCUにおいてCC1とCC2がどちらもカルシウムユニポーターのCa²⁺取込機能に重要な役割を果たすことを明らかにした。また、点変異体を用いた解析は、CC1 と CC2 がそれぞれコイルドコイル構造を形成することが重要であることを示唆した。

また、MCUではNTDも同様に保存されており、マウスのMCUではVal74-Arg164の配列に位置する。本研究はNTDを含むアミノ酸領域（His51-Leu100, Lys101-Leu150, Val151-Cys190）

の欠損がCa²⁺取込活性の低下を引き起こすことを明らかにした。これはNTDもまたCa²⁺取込機能の調節に関与することを示している。Leeらによって明らかにされたNTDのX線結晶構造と、

哺乳類の細胞株を利用して得られたさらなる知見によって、リン酸化が誘導する NTD の構造変化がCa²⁺取込機能を調節することが示唆されている[13]。NTDに関与するこの調節メカニズムの詳細を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

(25)

19 2-4 実験方法

2-4-1 試薬

プライマー：FASMAC

制限酵素：New England Biolabs Japan、TOYOBO Prime Star：Takara

Bacto Agar：Difco Laboratories

Yeast nitrogen base w/o amino acid：Difco Laboratories MitoTracker Red：Invitrogen

Zymolyase 20T：生化学工業 Protease inhibitor： SIGMA BCA Protein Assay Kit：Thermo ECL：GEヘルスケア、Bio rad X線フィルム：フジフィルム

Calcium Green-5N：Life Technologies

Yeast strain W303-1B（MATα, ade2-1, his3-11,15, leu2-3,112, ura3-1, trp1-1, can1-100）：Dr.

Shigeomi Shimizuより

Yeast shuttle vector pYO326（multi-copy vector, reported as pSQ326[14]）：Dr. Akihiko

Nakanoより。酵母発現用ベクターの構築の際は、マーカー遺伝子としてURA3（あるいはLEU2）、

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（TDH）プロモーターを有する pYO326/TDHp

（URA3 [or LEU2])を使用した[15]。

その他は市販の特級試薬を使用した。

2-4-2 FLAG融合マウスMCU変異体（欠損体）の酵母発現用プラスミドベクターの構築はじめに、マウスの骨格筋の cDNAを鋳型として GE2351および GE2356を用いたPCRを行い、得られたDNA断片をpUC19δTに組み込むことで MCU/pUC19δTを作製した。次に、

MCU/pUC19δTを鋳型としてGE2350およびGE2366を用いたPCR を行い、得られたDNA 断片を Ndelと Hincll で消化した。この断片を、Hincll と BamHl で消化した MCU/pUC19δT、

XholとNdelで消化したTDH3pと共に、XholとBamHlで消化したpYO326-FLAGに組み込んだ。続いて、マウス MCU のコドンを酵母での発現に最適化するために、先程構築した MCU/pYO326-TDH3p-FLAGをSmalとBamHlで消化した。この断片を、GE2373とGE2376 をアニーリングした断片、GE2374とGE2375をアニーリングした断片、NdelとBamHlで消化し

た pRS314-yA2P-FLAG ベクターをライゲーションすることで、酵母発現用に最適化した MCU

（optimized）を構築した。これをさらにNdelとBamHlで消化し、XholとNdelで消化したTDH3p と共に Xhol と BamHl で消化した pYO326-TDH3p-FLAG に組み込むことで、MCU（opti.）

/pYO326-TDH3p-FLAGとした（Fig.2-9）。今回の操作で使用したプライマーをTable 2-1に示す。

(26)

20

MCU/pUC19δT

MCU MCU

GE2350

GE2366

MCU/pUC19δT Hincll BamHl

Hincll、BamHl digestion Ndel、Hincll

digestion

Ndel Hincll Hincll BamHl

BamHl

Xhol Ndel Xhol

pYO326-FLAG

MCU

MCU/pYO326-TDH3p-FLAG Ndel Smal BamHl

GE2374

GE2375

GE2373

GE2376 pRS314-yA2P-FLAG

Ndel BamHl

Smal、BamHl digestion BamHl Smal

MCU(optimized)/pRS314-yA2P-FLAG

Ndel、BamHl digestion MCU

Ndel BamHl

BamHl Xhol

pYO326-FLAG

Xhol Ndel

MCU(optimized)/pYO326-TDH3p-FLAG MCU

TDH3p

Fig.2-9 酵母発現用に最適化したマウスMCUの構築手順

マウスMCU（opti.）の構築手順を示す。Fig上の赤色のボックスはTDH3プロモーターの領域

（TDH3p）を、緑色のボックスはFLAGタグを発現する領域を示す。

(27)

21

続いて、作製したMCU（opti.）/pYO326-TDH3p-FLAGを鋳型として、各forwardプライマー（F プライマー）と reverse プライマー（R プライマー）、F’プライマーと R’プライマーの組み合わせで PCR を行い、欠損させたい領域を除いたMCU のORFを含む領域を増幅させた。次に、得られた2種類のDNA断片を鋳型として、各FプライマーとR’プライマーを用いたPCRを行った。得られたDNA 断片をNdelと BamHlで消化後、XholとNdelで消化した TDH3pと共にXholと BamHl で消化した pYO326-FLAG に組み込んだ。MCU（Δ310-350）については他の変異体とは異なり、MCU（opti.）を鋳型として GE2435 とGE3143 を用いてPCR を行い、得られたDNA 断片をNdelとBamHlで消化した後、XholとNdelで消化したTDH3pと共に、XholとBamHlで

消化したpYO326-FLAGに組み込んだ。最後にDNAシーケンサーCEQ8000にてDNAの塩基

配列を読み取り、変異が入っていないことを確認した。今回の操作で使用したプライマーを Table2-2に示す。また、ベクターの構築手順をFig.2-10に示す。

F R' R F' R F' R F' R F' R

5'-TACACCACACTGTGCATTGAAATTAGCAGAAAAGCAGAGAAGAGG-3' 5'-TTGGATCCTGACTTTTTGGCTCCTTTATGG-3'

配列

MCU(Δ310-350)

プライマー

5'-CAAACAAACATATGGCTGCTGCTGC-3' 5'-GTAATACGACTCACTATAG-3' 5'-TGCCGTCCGGTGCTGCTGG-3'

5'-CAGCACCGGACGGCAAAGCCTATCTCTGACTCAGTCG-3' 5'-GAGTGTGAATTGGCAGCGCTCG-3'

GE3142 GE3143 GE3137 GE3138 GE3139 GE3140 GE3141

5'-TGCCAATTCACACTCGTCATTAATGACTTAACATACCACGTACGG-3' 5'-AAGCTTAAAGTCATCGAGGAGCAGGAGG-3'

5'-GATGACTTTAAGCTTATTGAGCAGCATCAGCTTAACAAACAG-3' 5'-GCACAGTGTGGTGTACAGCTG-3'

MCU(Δ191-220)

GE2435 GE2046 GE3135 GE3136 共通

MCU(Δ51-100)

MCU(Δ101-150)

MCU(Δ151-190)

Table 2-1 酵母発現用に最適化したマウスMCUの構築に用いたプライマー

FとRはそれぞれforwardプライマーとreverseプライマーを示す。

Table 2-2 マウスMCU変異体（欠損体）の構築に用いたプライマー

F R F R F F R R

5'-TGGTGGTGGTCGTCCTGGTGGTTGTGGTGCTTTGAGGCTGGTTGTTTCCCTG-3' 5'-AGGGAAACAACCAGCAGTCAAAGCACCACAACCACCAGCACCACCACC-3'

配列プライマー

5'-ACCACCTCTAGAACACAACAACAACAACAAAGATCTACCAGCAGCAGCAGCCA-3' GE2350

GE2351 GE2356 GE2366 GE2373 GE2374 GE2375 GE2376

5'-CCAGTTGACATATGGCGGCCGCCGCAGG-3' 5'-GGGATTCACGGTCATCTCGGATCCTTCC-3' 5'-CAGCGCCGTTTCCAGTTGACATATG-3' 5'-GACAAGCTTAAAGTCATCGAGGAGC-3'

5'-TATGGCTGCTCCTGCTCGTAGATCTTTGTTGTTGTTGTTGTGTTCTAGAGG-3'

(28)

22

2-4-3 FLAG融合マウスMCU点変異体の酵母発現用プラスミドベクターの構築

はじめに、2-4-2で作製した MCU（opti.）を鋳型として、各Fプライマーと Rプライマー、F’プラ

イマーとR’プライマーの組み合わせでPCRを行った。次に、得られた2種類のDNA断片を鋳型

として、各 F プライマーと R’プライマーを用いた PCR を行った。得られた DNA 断片を Ndel と BamHlで消化した後、XholとNdelで消化したTDH3pと共にXholとBamHlで消化したpYO326- FLAGに組み込んだ。最後に、DNAシーケンサーCEQ8000にてDNAの塩基配列を読み取り、

変異が入っていないことを確認した。今回の操作で使用したプライマーをTable2-3に示す。また、

ベクターの構築手順をMCU変異体（欠損体）と同様にFig.2-10に示す。

F R' F' R' F' R' F' R' F' R' F' R'

5'-GAAATGGATTTCAAGAGATTCAGAGACCCATTAC-3' 5'-GTAATGGGTCTCTGAATCTCTTGAAATCCATTTC-3' 5'-CAGCAGTTCGCCCCCTTCGAGAAG-3'

5'-CTTCTCGAAGGGGGCGAACTGCTG-3' 5'-CCTAGAGAAATTCAATCAGTTCAAGGATG-3' 5'-CATCCTTGAACTGATTGAATTTCTCTAGG-3' 5'-CAAGGATGCATTTGCTCAGTTCGAAATGG-3' 5'-CCATTTCGAACTGAGCAAATGCATCCTTG-3'

プライマー配列

5'-GACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTG-3' 5'-GTAATACGACTCACTATAG-3'

5'-GTGGAGAGGTTCGAGGACTTCAAGCAG-3' 5'-CTGCTTGAAGTCCTCGAACCTCTCCAC-3'

GE3481 GE3482 GE3483 GE3484 GE3485 GE3486 GE3383 GE2046 GE3477 GE3478 GE3479 GE3480 共通

MCU(L206F,L209F)

MCU(L213F,L216F)

MCU(Y316F,L319F)

MCU(I323F,A326F)

MCU(L330F,L333F)

Table 2-3 マウス変異体（点変異体）の構築に用いたプライマー

(29)

23 MCU(optimized)/pYO326-TDH3p-FLAG

MCU Fprimer

Rprimer R’primer

F’primer

MCU(optimized)/pYO326-TDH3p-FLAG MCU

1st PCR

Fprimer

R’primer

1st PCR

2nd PCR

Ndel、BamHl digestion

BamHl Ndel

BamHl Xhol

pYO326-FLAG

Xhol Ndel

TDH3p

MCU変異体/pYO326-TDH3pFLAG MCU変異体

MCU変異体

Fig.2-10 MCU変異体の酵母発現用ベクターの構築手順

マウスMCU変異体（欠損体）およびマウスMCU変異体（点変異体）の酵母発現用ベクターの構築手順を示す。Fig上の赤色のボックスはTDH3pを、緑色のボックスはFLAGタグを発現する領域を示す。また、1st PCR産物におけるオレンジ色のボックスは、2つのDNA断片同士が overlapする領域を示す。

(30)

24

2-4-4 酵母細胞におけるEGFPを付加したMCU変異体のイメージング

C 末端に EGFPタグを付加した MCU を、pYO326-TDH3pのNdel、BamHl サイトに組み込み、2-4-6 に示す方法で野生型酵母株に導入した。ミトコンドリアの染色は MitoTracker Red

（Invitrogen）を用いて行った。AMG 社の蛍光顕微鏡を使って細胞の観察を行い、EVOS FL cell imaging systemを利用して画像編集を行った。

2-4-5 酵母の培養条件

出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは、炭素源としてgalactoseもしくはglucoseを最終濃度が2%になるように添加したYP培地（1% yeast extract、2% polypeptone）を用いて、30℃の定温条件下で振盪培養した。また、形質転換体の選択には、SD 培地（0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid、2% galactose）に必要な栄養源を所定濃度添加したものを用いた。これらの培地を寒天培地として使用する際は、液体培地に最終濃度が 2%になるように Bacto Agar を添加して固定化した。

2-4-6 酵母の形質転換

構築した酵母発現用プラスミドを用いた酵母の形質転換は、酢酸リチウム法を利用して行った

[16]。まず、野生型の酵母細胞を2%のglucoseを含むYP培地を用いて、30℃の定温条件下で

OD600 が 0.3~0.5 になるまで振盪培養した。次に、培養液を遠心することで酵母細胞を集菌した

後、TE溶液（10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA（pH 7.4））を用いて洗浄した。続いて酢酸リチウム溶液（100 mM 酢酸リチウム（pH 7.4）、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA（pH8.0））

に懸濁し、30℃の定温条件下で振盪培養することで、酵母のコンピテントセルを調製した。この酵母のコンピテントセルと導入する DNA を含む溶液（100 mM 酢酸リチウム（pH7.4）、4 mg/mL salmon testis DNA）およびPEG溶液（40% PEG4000、10 mM 酢酸リチウム（pH 7.4）、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA（pH 8.0））を混合し、2分間ボルテックスを行った。得られた混合

液を30℃の定温条件下で30分間振盪培養した後、42℃の定温条件下で15分間熱処理を行っ

た。この酵母細胞を遠心により集菌し、TE 溶液で洗浄した後、選択培地に塗布して 30℃の定温条件下で2日間培養した。選択培地として、必要な栄養源を所定濃度添加したSD寒天培地を用いた。

2-4-7 酵母ミトコンドリアの単離

Ca²⁺取込活性の測定やWestern blottingに使用する酵母ミトコンドリアは、いずれも以前の報告と同様の方法で単離した[17]。まず、必要な栄養源を所定濃度添加した SD 培地を用いて、酵母細胞の前培養を行った。得られた培養液を2%のgalactoseを含むYP培地に添加し、30℃の

(31)

25

定温条件下でOD600が2.0程度になるまで振盪培養した。次に、遠心により集菌した酵母細胞を、

DTTを含む溶液（10 mM DTT、0.1 M Tris-SO4（pH 8.0））で処理した後、Zymolyase 20Tを含む KPi medium（1.2 M sorbitol、20 mM potassium phosphate（pH 7.4）、2 mM EDTA）で処理することでスフェロプラストとした。このスフェロプラストをymt単離液（600 mM mannitol、10 mM Tris- HCl（pH 7.4）、2 mM EDTA（pH 8.0）、0.1% BSA（bovine serum albumin））に懸濁し、1150 rpm で 7 ストロークホモジナイズすることで酵母細胞を破砕した。ymt 単離液には必要に応じて Protease Inhibitorを添加した。続いて、この破砕液を2500 rpmで5分間遠心し、回収した上清を更に2500 rpmで5分間遠心した。回収した上清を7500 rpmで10分間遠心し、得られた沈殿を、EDTA を含まない ymt 単離液で懸濁したものをミトコンドリア画分とした。ミトコンドリア画分のタンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準物質としたBCA protein Assay Kitを用いて測定した。

2-4-8 Ca²⁺取込活性の測定

単離した酵母ミトコンドリアを用いたCa²⁺取込活性の測定は、Pi medium（300 mM mannitol、

0.5 mg/mL BSA、10 mM K-Pi、2 mM NADH、pH 7.4）中で行った。まず、1 µM Calcium Green-

5Nを含むPi mediumに、140 µg/µLになるように酵母ミトコンドリアを懸濁し、そこに最終濃度が

30 µMになるようにCaCl2を加え、その後の蛍光強度の変化を観察した。測定にはHITACHIの

Fluorescence Spectrophotometer F-2700（excitation = 506nm, emission = 532 nm）を使用した。

2-4-9 SDS-PAGEおよびWestern blotting

酵母ミトコンドリアを用いた SDS-PAGE は、Laemmliらの方法に[18]、Western blottingは定法[19]に準じてそれぞれ行った。まず、サンプルと1% SDS および1% DTT を含むバッファーを混合し、これを泳動サンプルとして SDS-PAGE を行った。使用したポリアクリルアミドゲルの濃度は、FLAGタグを用いたMCUの発現確認およびPiCの検出では10%、MYCタグを用いたEMRE の発現確認では 17.5 %である。次に、ゲル中のタンパク質を、セミドライ式のブロッティング装置を用いてニトロセルロースメンブレン（NCF）に転写した。このNCF を、TS溶液（150 mM NaCl、

20 mM NaPi（pH 7.4）、0.05% Tween20）にスキムミルクを添加したSTS溶液に浸し、室温で1 時間振盪することでブロッキングを行った。続いて、一次抗体を添加したSTS溶液中にNCFを浸し1時間振盪した後、TS溶液を用いて3回washを行った。その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼを付加した二次抗体を TS 溶液に添加し、その中に NCF を浸して 1 時間振盪した。この NCFをTS溶液で5回washした後、最後にECLによって抗体に結合したペルオキシダーゼの活性化を行い、生じた化学発光をX線フィルムで検出した。Western blottingの条件をTable2-4 に示す。

(32)

26 使用した抗体

MCUの検出

一次抗体：ANTI FLAG produced in Rabbit, affinity isolated antibody （SIGMA,F7425）

二次抗体：Anti Rabbit IgG HRP-Linked Whole Ab Donkey （GEヘルスケア,NA934）

EMREの検出

一次抗体：Myc-Tag Mouse mAb （Cell Signalling,9B11）

二次抗体：Anti Mouse IgG (Whole molecule)-Peroxidase antibody produced in Rabbit （SIGMA,A9044）

PiCの検出

一次抗体：当研究室保有の抗体（GMVGSFKQIIAGEGAGALLCを検出[20]）

二次抗体：Anti Rabbit IgG HRP-Linked Whole Ab Donkey （GEヘルスケア,NA934）

Table 2-4 Western blottingの実験条件使用した抗体

検出対象抗体の希釈倍率

3.0% 3000倍 3000倍

1.0% 3000倍 3000倍

一次抗体二次抗体

1.0% 4000倍 4000倍

STSの濃度

MCU EMRE

PiC

抗FLAG抗体抗MYC抗体抗PiC抗体

(33)

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第 3 章 MCU のコイルドコイル構造と他のサブユニットの関係性

3-1 緒言

全てのMCUでは、二箇所のコイルドコイルドメインがWDxxEPモチーフと同様に保存されている。第2章では、マウスのMCUにおいてCC1とCC2がそれぞれコイルドコイル構造を形成していることが、カルシウムユニポーターの Ca²⁺取込機能に重要であることが示唆された。第 3 章では、この Ca²⁺取込機能におけるコイルドコイル構造の重要性と、MCU と相互作用していることが報告されているMCUR1およびEMREの関係性を調べた。

ミトコンドリアカルシウムユニポーターの