水溶性テトラゾリウム塩を用いた微生物増殖アッセイ 塚谷 忠之

福岡県工業技術センター  研究報告 No. 19 (2009)

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水溶性テトラゾリウム塩を用いた微生物増殖アッセイ 

塚谷 忠之

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Colorimetric Cell Proliferation Assay for Microorganisms in Microtiter Plate Using Water-soluble Tetrazolium Salts

Tadayuki Tsukatani* ¹ , Hikaru Suenaga* ¹ , Tomoko Higuchi* ¹ , Tetsuyuki Akao* ¹ , Munetaka Ishiyama* ² , Takatoshi Ezoe* ² and Kiyoshi Matsumoto* ³

本研究では，微生物によるメディエータ代謝活性を利用した水溶性テトラゾリウム塩還元法による微生物 簡 易検出法の開発を試みた。発酵微生物 5 種類及び食中毒菌 6 種類を検出対象として，これらの微生物を培養した 標準培地に電子メディエータ（ベンゾキノン類，ナフトキノン類，アントラキノン類，フェナジン類）及び水溶 性テトラゾリウム塩（WST-1，4，5，8，9，XTT）を添加し，一定時間反応後，マイクロプレートリーダで吸光 度を測定した。検討の結果，微生物によるメディエータの代謝活性，電子メディエータとテトラゾリウム塩との 反応性，培地成分の影響を考慮して，2-methyl-1,4-naphthoquinone(NQ)及び WST-8 の組み合わせが最適であった。

2-Methyl-1,4-NQ/WST-8 系を用いた手法により各種微生物を定量的に検出することができた。 

1  はじめに 

薬剤感受性試験や抗菌性物質スクリーニング，食中 毒菌検査など微生物の生存率測定は様々な分野で注目 されている技術である。微生物の生存率測定は一般的 にコロニー形成能で目視評価されるが，長い時間がか かったり操作に熟練を要したりと煩雑な点が多い。そ こで，微生物の生存率を迅速かつ簡便に測定すること を目的として，水溶性テトラゾリウム塩を用いた微生 物検出法を開発し，各種微生物の増殖アッセイへ適用 した。 

2  研究，実験方法  2-1  測定原理 

NADH(NADPH)はエネルギー代謝活動に関与する補酵 素であり，生命体の活動をつかさどっている。微生物 はこの補酵素を利用することで外部から供給されたキ ノン化合物を還元し，ヒドロキノンを生成することが できる。ここへ還元発色試薬である水溶性テトラゾリ ウム塩が共存すると，生成したヒドロキノンにより還 元を受けてホルマザン色素が生成する（図１）。この 一連の反応は微生物の代謝反応を介して起こることか ら，生成した色素量は微生物の代謝活性に比例する。 

2-2  増殖アッセイ 

各種微生物を最適な培地，温度で18時間培養し，標

準培地を用いて種々の菌体密度の菌懸濁液を作製した。

次に96ウェルマイクロプレートに各密度の菌液を190 μlずつ分注した。さらに各ウェルへ検出試薬10μlを 添加し，吸光マイクロプレートリーダで460nmにおけ る吸光度を15分おきに24時間まで経時的に測定した。 

N NN N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O N a

N N HN N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O

NADH, NADPH

NAD⁺, NADP⁺

Microbial cell

WST-8 WST-8 formazan

Orange color (λmax 460nm) Meadiator

(Red.)

Meadiator (Ox.) N NN

N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O N a

N NN N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O N a

N N HN N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O N N HN

N

N O2 N O2 S O₃ O₃S

H3C O

NADH, NADPH

NAD⁺, NADP⁺

Microbial cell

WST-8 WST-8 formazan

Orange color (λmax 460nm) WST-8 formazan Orange color (λmax 460nm) Meadiator

(Red.)

Meadiator (Ox.)

図１  測定原理 

3  結果及び考察  3-1  最適条件の確立 

図 1 の測定原理を利用した微生物検出法の最適化を 行った。最適化については，①様々な微生物をオール ラウンドに検出できること，②感度良く微生物を検出 できること，③培地成分の影響を受けないことを考慮 して最適な電子メディエータと水溶性テトラゾリウム 塩の組み合わせの選抜を行った。 

まず，電子メディエータの選抜については，様々な 微生物をオールラウンドに検出できることを考慮して 検討を行った。キノン類及びフェナジン類の誘導体27

*1  生物食品研究所、  *2  ㈱同仁化学研究所 

*3  九州大学 

福岡県工業技術センター  研究報告 No. 19 (2009)

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種類の電子メディエータに対する各種微生物（発酵微 生物5種類及び食中毒菌6種類）の代謝活性を比較した ところ，2-methyl-1,4-NQにおいてすべての微生物に 良好な代謝がみられた。 

水溶性テトラゾリウム塩の選抜については，感度と 精度の両面を考慮して検討を行った。水溶性テトラゾ リウム塩としては同仁化学研究所製のWST-1,4,5,8,9 及び市販品であるXTTを検討に用いた。感度について は電子メディエータ2-methyl-1,4-NQとの反応性が高 いことを指標に，精度については培地成分による非特 異的な水溶性テトラゾリウム塩の還元，すなわちバッ クグラウンドの上昇が抑えられることを考慮して選抜 を行った。清酒酵母（真菌），サルモネラ菌（グラム 陰性菌）及び黄色ブドウ球菌（グラム陽性菌）を用い，

各種水溶性テトラゾリウム塩による発色度を比較した ところ，WST-8及びXTTが高い発色を示すことがわかっ た（図2）。次に水溶性テトラゾリウム塩としてWST-8 及びXTTを用いて各種培地成分や種々の市販培地の影 響を検討したところ，XTTではいくつかの培地成分や 市販培地においてバックグラウンドの上昇が見られた。

特にペプトンと糖類から生成するメイラード反応物が XTT の 非 特 異 的 還 元 に 大 き く 関 与 し て い た 。 一 方 ， WST-8では培地の共存成分による非特異的還元は低く 抑えられた。 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Microorganism

Ab so rb a n c e

WST-1 WST-4 WST-5 WST-8 WST-9 XTT

Saccharomyces cerevisiae

Salmonella enteritidis

Bacillus cereus

  図2  水溶性テトラゾリウム塩の比較（代謝効率） 

以上の結果より，電子メディエータ2-methyl-1,4- NQと水溶性テトラゾリウム塩WST-8を用いる検出系が 微生物検出に対する汎用性，感度及び精度の面から最 適であることがわかった。 

3-2  各種微生物の増殖アッセイ 

本法を酵母3種類，グラム陽性菌9種類，グラム陰性 菌10種類の検出へ適用した。表1は1時間あるいは4時 間のインキュベーションで吸光度変化0.5を示すに必 要な菌体密度を比較したものである。グラム陽性菌は グラム陰性菌に比べて１桁高い検出感度を示した。ま た，すべての菌種において検出時間と菌体密度の間に 直線関係が得られ，本法による定量性が確認された。 

電 子 メ デ ィ エ ー タ と し て2-Methyl-1,4-NQ ， 水 溶 性 テトラゾリウム塩としてWST-8を用いた測定法により，

培地の影響を受けることなく，感度良く各種微生物を 定量的に検出することができた。本法は迅速な薬剤感 受性試験や抗菌性物質のスクリーニングへ適用可能で あると考えられる。 

表1  各種微生物に対する検出感度 

1h 4h

Yeast

Candida utilis NBRC0626 5.53×10

6.18×10

Saccharomyces cerevisiae NBRC2347 8.70×10

2.65×10

Zygosaccharomyces rouxii NBRC0505 1.65×10

2.47×10

Gram-positive bacteria

Bacillus cereus NBRC13494 6.70×10

6.77×10

Bacillus subtilis JCM1465 2.45×10

6.71×10

Corynebacterium glutamicum NBRC12168 1.69×10

2.47×10

Enterococcus faecalis JCM5803 5.18×10

1.76×10

Lactobacillus casei NBRC15883 8.40×10

2.34×10

Listeria monocytogenes ATCC15313 5.07×10

6.46×10

Micrococcus luteus NBRC13867 8.29×10

1.29×10

Staphylococcus aureus NBRC12732 5.30×10

5.43×10

Staphylococcus epidermidis NBRC12993 5.53×10

1.12×10

Gram-negative bacteria

Acetobacter sp. NBRC3283 2.53×10

7.39×10

Escherichia coli NBRC3972 1.31×10

2.86×10

Klebsiella pneumoniae NBRC3512 1.76×10

5.59×10

Proteus mirabilis NBRC13300 7.42×10

1.35×10

Pseudomonas aeruginosa NBRC13275 1.76×10

1.78×10

Salmonella enteritidis NBRC3313 2.55×10

1.06×10

Salmonella typhimurium NBRC12529 1.73×10

2.60×10

Serratia marcescens NBRC102204 7.15×10

5.08×10

Vibrio parahaemolyticus NBRC12711 2.90×10

1.03×10

Yersinia enterocolitica JCM7577 1.92×10

5.46×10

a

Viable cell density that gives the absorbance change of 0.5 during the reaction time of 1 and 4 h.

Microorganism Cell density(CFU/ml)

5  掲載論文 

Journal of Microbiological Methods, Vol.75, 109–116

(2008).