九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

RFLP(制限酵素DNA断片長多型)を利用したイネの連鎖 地図作成に関する研究

出田, 収

九州大学農学研究科遺伝子資源工学専攻

https://doi.org/10.11501/3110821

出版情報：Kyushu University, 1995, 博士（農学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

摘 要

イ ネ の 連 鎖 地 図 を 一 層 充 実 さ せ る た め に ， 九 州 大 学 農 学 部 育 種 学 教 室 で 作 成 さ れ て き た 従 来 の 連 鎖 地 図(Iwataet al.  1984， 1989a， 1989b)とSaito et  al.  (1991 )のRFLP連 鎖 地 図 と の 統 合 を 試 み ， 以 下 の 実 験 を 行 な っ た .

(1 ) イネの12の 染 色 体 とRFLP連 鎖 群 と の 対 応 関 係 を 明 ら か に す る た め に ， 日 本 型 品 種 目 本 晴 の ト リ ソ ミ ツ ク シ リ ー ズ に イ ン ド 型 品 種IR24を 交 配 し て 得 ら れ た 日 印 交 雑 ト リ ソ ミ ッ クFlの シ リ ー ズ を 用 い た 分 析 を 行 な っ た . 日 印 交 雑トリソミックFlのDNAをRFLPク ロ ー ン を プ ロ ー ブ と し た サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イゼーションに供し， ト リ ソ ミ ッ ク ス の 過 剰 染 色 体 に 起 因 す る 遺 伝 子 量 効 果 を検出してRFLPク ロ ー ン の 座 乗 染 色 体 を 決 定 し た . そ の 結 果 ， 染 色 体1，

5

， 

7

， 8， 9お よ び10に 対 応 す るRFLP連 鎖 群 が 新 た に 判 明 し ， 染 色 体2，

3

， 4， 

6

，  11および12に対応するRFLP連 鎖 群 の 再 確 認 を す る こ と が で き た .

(2)  過 剰 染 色 体 の 構 造 が 不 明 の ト リ ソ ミ ッ ク ス に つ い て ， RFLP連鎖、地図に位 置づけられているDNAク ロ ー ン を プ ロ ー プ と し て サ ザ ン 分 析 を 行 な い ， 遺 伝 子 量 効 果 を 検 出 し て そ の 過 剰 染 色 体 の 構 造 を 推 定 し た . そ の 結 果 ， 染 色 体8に 関 す る 二 次 ト リ ソ ミ ッ ク ス 様 植 物 ， な ら び に ， 染 色 体 11に 関 す る こ 次 ト リ ソ

ミックス様植物と 2種 類 の ア ク ロ ト リ ソ ミ ッ ク ス 様 あ る い は テ ロ ト リ ソ ミ ッ ク ス 様 植 物 と を 見 出 し た . た だ し ， 染 色 体11に関する2種 類 の ア ク ロ ト リ ソ ミ ッ ク ス 様 あ る い は テ ロ ト リ ソ ミ ッ ク ス 様 植 物 の 過 剰 染 色 体 の 構 造 の 差 違 は 検 出 できなかった.

(3 ) イ ン ド 型 品 種IR24と 日 本 型 標 識 遺 伝 子 系 統 と の 交 雑F2あ る い は わ 集 団 を 用い ， 以 下 の 標 識 遺 伝 子 に つ い てRFLPマ ー カ ー と の 配 列 関 係 を 明 ら か に し た .

68 

染色体 1: fs・2(かすり縞・2，) d・18(小丈玉錦型倭性)， d・2(夷型倭性)， rl‑2(捲 葉・2)，spl・

6 (

病 斑 葉‑6)，eg(過剰穎)

染色体 2: tri (三角籾)， bl‑1(褐 斑 葉‑1)，spl‑2(病 斑 葉 ‑2)

染色体3: chl‑1(黄 緑 葉‑1)，fc‑1(細秤ー1，) st(t)(CM120)(縦縞)， dl(垂れ葉)，

spl・3(病斑葉ー3)

染色体4:d・11(信金愛国型倭性)， Ph(フェノール反応)， 19 (無 葉 舌 )

染色体5:d‑1(大黒型倭性)， st(t)(CM37)(縦縞)， spl‑7(病 斑 葉‑7)，nl‑1(穂、首 若葉・

1 )

染色体 6: dp‑1(内 穎 発 育 不 全‑1，) spl・4(病 斑 葉‑4)，Cl(小 穂 叢 生 )

染色体7: d‑6(短稗白笹型媛性)， g‑l(長 護 穎‑1)，splづ(病斑葉‑5)，ν‑11 (緑変 白苗 ‑11) 

染色体8: s ug (甘味脹乳)， ν‑8(緑 変 白 苗‑8)

染色体9:1・Bf(穎縦筋褐色抑制)， dp‑2(内 穎 発 育 不 全‑2)，drp‑2(濡 れ 葉‑2)， Dn・1(密穂‑1) 

染色体10: spl‑10(病 斑 葉‑10)，pgl(淡 緑 葉 ) 染色体

1 1: 

z・

2 (

ゼ ブ ラ 斑 葉

‑ 2 )

，

ν ‑ 9 (

緑 変 白 百

‑ 9 )

染色体12: spl‑1(病 斑 葉‑1)，rl‑1(捲葉‑1 ) 

こ れ に よ り ， イ ネ の12の 染 色 体 す べ て に わ た っ て ， 従 来 の 連 鎖 地 図 とRFLP 連 鎖 地 図 と の 対 応 関 係 が 明 ら か に な っ た .

(4)  従 来 ， 染 色 体4の 連 鎖 群 に 属 す る と さ れ て き たd‑2は， RFLPマ ー カ ー と の 連鎖関係 に よ り ， 染 色 体 1に 座 位 が 明 ら か と な っ た . ま た ， 染 色 体9のI‑Bfと dp ‑2 ‑drp‑2 ‑Dn・1群との配列関係も， RFLPマ ー カ ー を 介 し て ，I‑Bf‑dp‑2 

‑drp‑2 ‑Dn‑1で あ る こ と が 明 ら か と な っ た .

6 9  

(5)  染 色 体2のtriお よ びspl‑2， 染 色 体3のchl‑1，染 色 体4の19，染 色 体6のdp‑1 およびspl^・4， 染 色 体7のd・6，g‑l， spl^・5お よ びv‑11， 染 色 体8のsugお よ びv・8 はいずれもRFLP連 鎖 地 図 の 末 端 よ り も 外 側 に 座 位 が あ り ， RFLP連 鎖 地 図 は 飽 和 し て い な い と 考 え ら れ た .

(6)  染 色 体 1のfs‑2‑XNpb216‑XNpb96‑d^・18‑X "'pb269 ‑X Npb35 9‑d^・2 の 領 域 ， 染 色 体2のbl‑1‑X N pb57‑X N pb42の 領 域 ， 染 色 体3のXNpb164‑

XNpb249‑fc‑1‑st(t)(CM120)‑XNpb51‑XNpb15‑‑XNpb182の 領 域 ， 染 色 体6のXNpb165‑1，染 色 体11のXNpb389‑XNpb78‑z^・2‑gmZ410の 領 域 お よ

び染色体12のrl‑1‑XNpb148‑XNpb198の 領 域 で は 日 本 型 の 遺 伝 子 型 の 分 離 比 が 有 意 に 減 少 し て い た . 染 色 体2で 見 出 さ れ た 分 離 の 歪 み は こ れ ま で に 報 告 のない新たなものである.

(7 ) 本 研 究 に よ り ， 従 来 の 連 鎖 地 図 とRFLP連 鎖 地 図 と の 対 応 関 係 は 明 ら か に な っ た が ， 今 後 ， 連 鎖 地 図 な ら び に こ れ に 位 置 づ け ら れ て い る 遺 伝 マ ー カ ー を 基 礎 的 ・ 応 用 的 に 利 用 す る に はRFLP連 鎖 地 図 の 一 層 の 拡 充 が 必 要 で あ る . そ の た め に は ， こ れ ま で 多 型 が 得 ら れ ず 連 鎖 地 図 作 成 に 用 い ら れ て こ な か ったDNAク ロ ー ン を 用 い る た め の 交 雑 組 合 せ の 多 様 化 や 新 た なDNAマ ー カ ー の 利 用 に つ い て も 検 討 す べ き で あ る と 考 え た .

70 

謝 辞

本 研 究 の 遂 行 に 当 た り ， 九 州 大 学 農 学 部 育 種 学 教 室 の 岩 田 伸 夫 教 授 な ら び に吉村 淳 助 教 授 に は 終 始 暖 か い 御 指 導 と 御 鞭 援 と を 賜 っ た . ま た ， 本 論 文 の と り ま と め に 際 し て は ， 九 州 大 学 農 学 部 附 属 遺 伝 子 資 源 研 究 セ ン タ ー 植 物 遺伝子部門の佐藤 光 教 授 に 懇 切 な る 御 校 閲 と 御 助 言 と を 賜 っ た . こ こ に 深 甚の謝意を表明する.

また，貴重な材料を分与下さった農研センター(現在九州農業試験場)の小川 紹文博士ならびにそのDNAを 抽 出 し て 下 さ っ た 農 業 生 物 資 源 研 究 所 ( 現 在 四 国 農 業 試 験 場 ) の 河 瀬 真 琴 博 士 ， ラ ジ オ ア イ ソ ト ー プ の 使 用 に 御 厚 意 を 賜 っ た 農 業生物資源研究所(現在九州農業試験場)の斎藤 彰 博 士 な ら び に 核 外 遺 伝 子 研 究 室 の 諸 賢 ， 組 換 価 の 算 出 に 御 尽 力 を 賜 っ た 九 州 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科 遺 伝 子制御学講座の久原 哲 教 授 ， 以 上 の 方 々 に 深 謝 の 意 を 表 す .

最 後 に ， 安 井 秀 助 手 を は じ め と す る 育 種 学 教 室 の 皆 様 に は 不 断 の 適 切 な 御 教 示 ， 御 協 力 を 戴 い た . こ こ に 厚 く 御 礼 を 申 し 上 げ る .

71 

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o .  

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77 

Studies on the construction of a linkage map using RFLP  (Restriction Fragmen七 Leng七h Polymorphism)  in  rice 

O. 工deta

(Summary) 

工n order  to construct  a more detailed  linkage map  of rice

， 

the  st udy  for工ntegrat工on of  the  classical  linkage  map  and  the  RFLP linkage map was  carr^工ed out.  The  results  are as  follows. 

(1)  The rela七エonship between RFLP  1工nkage groups  and their 

respective  chromosomes  was  established  v工a RFLP  gene  dosage  analysis  of  hybrid  primary  trisomics.  These  hybrid 七risomics were developed  by  crossing be七ween Nipponbare primary七risomics (a  Japonica  cultivar)  and  1R24  (an 工nd工ca cul七ivar).  1n  this  study

， 

six  RFLP  linkage  groups  corresponding七o the  chromosomes  1

， 

5

， 

7

， 

⁸

， 

⁹ and  10  were  found  ou七. The previous  assignmen七 of six RFLP  linkage groups  to  chromosomes  2

， 

3

， 

4

， 

6

， 

11  and  12  by  chromosome specific marker genes were confirmed. 

(2)  A secondary一七risomic like plants  for chromosome  8

， 

and 

another  secondary一七risomic like  plants  and  two  七ypes of  acrotrisomic  like  plan七s for  chromosome  11  were  iden七ified through  detection  of  duplication  or  deficiency  of  extra  chromosomes  via RFLP  gene dosage analysis. 

78 

(3)  Forty  classical rnarkers  and  83  RFLP  rnarkers  were  mapped 七oge七her of  all  the  12  chromosomes  in  rice  through  observing  17  F2  populations  and  one F3  population derived  from  the  crosses between  an  Indica  variety  IR24  and Japonica  lines  with  differen七 classical markers.  The  mar}くer genes  mapped  in  this study were  as  follows. 

chromosome 1 

fs‑2  (fine  stripe‑2)

， 

d‑18 (Kotaketamanishiki  dwarf)

， 

d‑2 (Ebisu 

dwarf)

， 

rl‑2  (rolled  leaf‑2)

， 

spl‑6  (spot"ヒed leaf‑6)  and  eg  (extra glurne) . 

chromo s ome  2 

tri  (triangular  hull)

， 

bl‑1  (brown  leaf  spot‑1)  and  spl‑2  (spot七edleaf‑2) . 

chromo s ome  3 

chl‑1  (chlorina‑1)

， 

fc‑1  (fine  culm‑1)

， 

st (七)(CM120)  (stripe)

， 

dl  (drooping leaf)  and spl‑3 (spotted leaf‑3) 

chromosorne 4 

d‑11  (Shinkane‑aikoku  dwarf)

， 

Ph(Phenol  staining)  and  19  (liguleless) . 

chromosome  5 

d‑1  (Daikoku  dwarf)

， 

st (七)(CM37)  (stripe)

， 

spl‑7  (spotted  leaf‑

7 9  

7)  and nl‑1  (neck 1.eaf‑1) . 

chromosome 6 

dp‑l  (depressed  pa1.ea‑1)

， 

spl‑4  (spot七ed 1.eaf‑4)  and  Cl  (Clustered spike1.ets) . 

chromosome 7 

g‑l  ( 1. 0 n g s t e r i 1. e 1. emma s ‑1)

， 

d ‑6  ( T a n k an s h工rasasa dwarf)

， 

spl‑

5 (spot七ed1.eaf‑5)  and v‑11  (virescent‑11). 

chromosome 8 

v‑8  (virescen七‑8) and sug (sugary endosperm) . 

chromosome 9 

I‑Bf  (Inhibi七or for  brown  furrows of  hu1.1) 

， 

dp‑2  (depressed  palea‑2)

， 

drp‑2  (dripping‑wet  1.eaf‑2)  and Dn‑1  (Dense  panicle‑

1) . 

chromosome 10 

spl‑10 (spo七七ed leaf‑10)  and pgl (pale  green  leaf). 

chromosome  11 

2‑2  (zebra‑2) and v‑9 (virescent‑9). 

chromo s ome  12 

spl‑1  (spotted  leaf‑10)  and rl‑l  (rolled  leaf‑1). 

80 

(4)  The gene d‑2

， 

which had been  belonged to  linkage group  4

， 

was  found to be located on  chrornosorne  1 through  the detec七ion of  linkages  between  d‑2  and  several  RFLP  rnarkers  rnapped  on  chrornosorne  1.  The  locus  of unlocated gene I‑Bf was determined  and the  liner order of  class工cal rnarker  genes I‑Bf‑dp‑2‑drp‑2‑

Dn‑1 on chrornosorne  9 was established. 

(5)  Genes tri

， 

spl‑2 (chrornosorne  2)

， 

chl‑1  (chrornosorne  3)

， 

19  (chromosorne  4)

， 

dp‑l

， 

spl‑4  (chrornosorne  6)

， 

d‑6

， 

g‑l

， 

spl‑5  (chromosome 7)

， 

sug and v‑8  (chromosome  8)  were  es七工ma七ed七o be  located beyond  the  terrninal  ends  of  the  RFLP  linkage  map.  The  RFLP linkage rnap  was  revealed no七 七o be satu:rated. 

(6)  The  segregation  distortions  were  detected  on  five  regions. 工n the  regions  of fs‑2‑XNpb216‑XNpb96‑d‑18‑XNpb269‑

XNpb359‑d‑2 on  chrornosome  1

， 

bl‑1‑XNpb57‑XNpb42 on  chromosome  2

， 

XNpb164‑XNpb249‑fc‑l‑st(七)(CM120) ‑X~pb51-XNpb15‑XNpb182  on chromosorne  3

， 

XNpb165‑1 on  chrornosome  6

， 

XNpb389‑XNpb78‑z‑2 

‑gmZ410  on  chrornosome  11  and  r]‑1‑XNpb148‑XNpb198  on  chrornosome  12， 七he Japonica/Japonica  allele  frequencies  of  bo七h classical and  RFLP  markers  showed  significantly  less 七han 七he norrnal  frequency  of  25宅 On the  segregation  distortion newly  found on chromosome 2

， 

more  investigation  is  needed. 

(7)  The relationship  between七he classical  linkage  map and  the RFLP  1 inkage rnap  was es七ablished. This info工ma七ion is  useful 

81 

to  es七imate linkages  between  classical marker  genes  and  RFLP  markers ・ Bu七 only a more  fully  saturated linkage  map of rice  can  offer  opportunities  for  applica七lons 工n genetics  and  breeding.  More  various  cross  combinations  for  employing  DNA  clones  which ha ve no^七 been used for  previous  mapping  efforts  and  new  kinds  of  DNA  markers  would  be  useful  to  construct  a more  highly detailed  linkage map. 

82 

ヱ

^{2  3  4  5  6  7  8}  9  10  1 1   1 2   fs‑2 

‑ t ‑

d‑29 -I- ch~- .1 寸ト d- .1.1 寸ト n~-2

= 1 =  

dp‑l wx  d‑6  d‑51 g‑.1  d‑27 

tri  sug  drp‑2 fg~ ^na~-2

d‑18  目

ch~-3

d‑1  ur‑2  dp‑2  rk‑2  r~-l

Pn  ^{‑.‑bc‑3}  ‑‑‑t‑ ^{Pr  sp~-5 v‑8} _{z‑4  sp~-10} ^pg~

l 

^{~a sp~-1}

fc‑1 

+ 

^st‑1 

= 1 ト ヱ 2 1

b~-1

•

^{Ph  一}

^ι

^v‑4

I  ‑ t ‑

^{v‑1  S 日}

f ^{…‑‑1‑}

^rfs 

r~-2

~g v‑10 

I 2 8  

gh‑3 

bc‑1  ^bg~

A 

P~

sp~-7 ‑ 1 ‑

^C~

。

。

_{w  す ch~-6}

I  _~n~-~

^「

^ι

^v‑9

a~-2

v‑2  一

ι

z‑1

•

d‑32 

d‑10  I  一

ι

D‑53

z‑3 

spiaix‑6

・

E

^sp~-3

^{I l 0}cM 

eg 

t

^供一2

v‑6 

sp~-2

Appendix  1.  Rice classical linkage map  (Iwa七a et al.  1984

， 

1989a

， 

1989b). 

ヱ ^{2  3  4  5  6  7  8  9  1 0   1 1   1 2}  

212  22575 0  chl‑1  22043 7 

292  209  Rc  rDNA  32  ート198

381  3596 7  3 181 

356  328  c1m2W8 X  31  89 

239‑2  32~ ²⁹⁶  30  85‑1  95  89‑2  é~-2

216 107  B~ 244‑1  ^{I H二i 396} 208  165‑1 ^{27  338}  36 ³¹⁵  376 

ー ・ ‑

148 

96  303 

73  237  146  333 

98  341 

164  H9  33 

269  204  60 

57  194  20  gmZ410 

359  242  229  71 

200 

i 5

^{2  B2  Sdh‑1} 

PEPC  265  48  187  402 

231  ~S3 ^{387  290} 106  126  ¹⁰³  37  ^{220  307‑1} 

U o   232  337  273  160  257  307‑2 

311  358  47  133  254  ~81 二i

89‑1 

事

^{4267  271 399  Est‑2  2989 7  401  202  248} 

317  192  304‑3 

H g  

249  309  a工k 117  339  44 

7~6

272  66  161  385 

252  253 45  PHYT C‑2  151  260  398  400  291  261 88 

H o   Ì8~ ^{112  154} 

165‑2  378  21311  

~~i ^{379  239‑1} 

364  299  35  123  i U  

Bl‑2 

3s2o p 

301  ìð~ ^{68‑2  41  207} 

132  282  246  268  404  323‑1  179  R3U1B9 s s 

377  321 

58  114  CHT‑2  294  22  38  183  316 

137  233  2 108  205 

368  21  331  366  330 

270  353  362  ALD‑1  95  c1m1A5 DH  124‑1 

172  222  127 

243  GLU  162  C‑13 

LHCP‑1  163  284  293  274 

。

。

ム E J 3 2 5  121  ~ !_8.，~ _d‑30  ³³² 40  ¹⁰² 120  310 ¹²²  68‑1  ¹⁸⁰ 280  I 3 3 5  

~M ³⁵⁷ 227  ¹⁴⁴ 51  ^{221  81  288}  H !  

278  189  193 

372  i~5 ^{255  142} 

374  Ph  12 

B 8  

119  267  25 

118  394  386 

B i   87  24 

206  Lap  ~~6 ¹⁶⁹ 

201  74  19  52 

LHCP‑2  188  344 

136  285  ^J  ":lっ。

B1‑1  ~~7

343 

[231 

393  223 

147 

十 ^{i j j}

92  H~-2

370 354 

J H   ~;r1 ^Il0CM 

UÕ~l ₃₉₂ 

B 4   256 

373 

~~o ^244‑2 

ALD‑2  ~ì8

113  184 

350  H~

U l  

279 345 

Ioo 173 

Appendix 2.  Rice RFLP  linkage map  (Saito  et al.  199ユ). 

〉可H UD

パ ドωω

叶ぷ

μ

ロ パ

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川ザ

ω ω μ   ω 

ω

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85 

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86 

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8 7  

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88 

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89 

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91 

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93 

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川刊しHの 3H U

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EH oz

96 

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( 同 句 叶 )

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叶ω叶U叶口伺ハ凶Xの叶﹂[lωHU叶口伺ハ凶

υ{ Uω

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口ω凸

9 7  

Normal  (+ ) 

ぺ14

↑ ﹂

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1‑

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74 

ω b  

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a  1ム e  a  ム

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S︿

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e r p e d 

ex七raglume  (eg) 

long sterile lemmas‑l  (q‑l ) 

98 

Inhibitor  for brown  furrows  of hull  ( I‑Bf) 

(+ ) 

・ 、 ^{1 1 1}

' ・ 、 ￨

、 ・ ，

(Ph) 

可1 4

h  u  ︑ 上

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a .

i  

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u

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n a 

‑l

r   

↑ ﹂

control  s七ained

Phenol  s七aining (Ph) 

Normal  (+ ) 

m r e p 

c u   O M刷e引

y 

r 

a 

q u 

qu  

9 9