博 士 （ 農 学 ） 大 塚 大 輔
学 位 論 文 題 名
バキュロウイルス耐性カイコ作出に関する基盤研究 学 位 論 文 内 容 の 要旨
ノくキュ口ウイノレス科に属するBombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) はカイコに 核 多角 体病を引き起こす病原ウイルスである。BmNPV は古来よルカイコの飼育 におい て最も深刻な被害をあたえるもののひとっであり、核多角体病は現在の養蚕業において も重要な問題のひとっである。
近年、lsobe eta ん(2004) はRNA polymerase II (pol1 ｜）系のプロモーターを利用して BmNPV の必須遺伝子で あるlef‑l に対する二本鎖RNA (dsRNA) を発現するような トラン スジェニックカイコを作出した。この卜ランスジェニックカイコにおいては、ウイルス の経口摂取後96 時 間においてもウイルスの増殖は顕著に抑制されたが、致死率の劇的 な改善は認められなかった。さらに、Kanginakudru et ロ∴(2007) によってもpol ｜｜系のプ ロ モー ター を用 いて BmNPV の必 須遺伝子艪ユに対 するdsRNA を発現するトラン スジェ ニ ック カイコが作製されたが、やはり十分なBmNPV 耐性をカイコに付与するこ とがで きなかった。
この ように、これまでのところ実用レベルでの BmNPV 耐性カイコの作出には 至って い ない 。耐性カイコの作出に至らなかった原因と してはdsRNA の発現が組織特 異的発 現 制御 を受 けて しま いdsRNA の 十分な発現が確保 できなかった可能性や、BmNPV が引 き起こす宿主遺伝 子の発現抑制(shut off) によって、dsRNA の発現が継続しなかった可 能性が挙げられる。一般的にpol lI プロモーターは生体内において組織特異的制御を受 けることから、このようなプロモ一夕ーを用いたトランスジェニックカイコにおいては、
特定の組織においてトランスジーンの発現が不十分である場合がある。この問題を解決 するため、一般に組織特異性が低いとされるRNA polymerase Iii (pol lIl) 系のプロモータ ーであるカイコU6 プ口モーターを利用し、small‑hairpin RNA (shRNA) 発現ユニットを作 製 した 。ま ず、 U6 プ ロモ 一夕 ーを 利用したshRNA 発現ユニット(U6‑shRNA 発現 ユニツ ト）を持っプラス ミドを用いてレポーター遺伝子に対する発現抑制効果を評価した結 果 、U6‑shRNA 発現ユニットはカイコBmN 細胞において効果的にレポーター遺伝 子の発 ●
現 を抑 制で きる こと が半 l 亅明 した。次に、この U6‑shRNA 発現ユニットが BmN 細胞に BmNPV 抵抗性を付与できるのかを調査した。即 ち、U6 ―shRNA 発現ユニツ卜を有するプ ラ スミ ドを 用い てBmNPV の 必須 遺伝 子艪 ユを 標的 とし た shRNA を一過的に BmN 細胞で 発現させ（トランスフェクション効率は約50 ％）、ウイルスの増殖抑制効果を調査した。
そ の結 果、shRNA を発 現させた細胞ではウイルス感染48 時間後における培養上 清中の
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ウ イ ル ス 量 がshRNAを 発 現 し な い コ ン ト ロ ー ル の 細 胞 と 比 較 し て 約70％ 程 度 抑 制 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、U6‑shRNA発 現 ユ ニ ツ 卜 が カ イ コ の 細 胞 に お い て 効 果 的 にRNAi を 誘 導 す る こ と が で き る ツ ー ル で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
次 に 、BmNPV感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のshut offに 関 す る 問 題 の 解 決 を 試 み た 。 バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のshut offは 転 写 レ ベ ル で の 制 御 で あ る こ と が 考 え ら れ て い る が 、 そ の 機 構 に つ い て は 明 ら か で は な ぃ 。 し か し 、 興 味 深 い こ と に ウ イ ル ス の 遺 伝 子 発 現 は 抑 制 さ れ な い 。 こ の こ と は ウ イ ル ス 自 身 の 遺 伝 子 発 現 に はBmNPV感 染 に よ るshut offを 回 避 で き る 機 構 が 存 在 し て い る こ と が 考 え ら れ る 。 と こ ろ で 、BmNPVゲ ノ ム に 散 在 す る シ ス エ レ メ ン ト で あ るhrは 多 様 な ウ イ ル ス 遺 伝 子 の 発 現 を 活 性 化 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、hrがshut offを 回 避 す る の に 関 わ っ て い る の で は な い か と 考 え 、 検 証 実 験 を 行 っ た 。 ま ず 、hr5を 付 加 し たEGFP発 現 ユ ニ ッ ト をBmN細 胞 の ゲ ノ ム に 挿 入 し た 組 換 え 細 胞 （rBmN‐A3EGFP／hr52） を 作 製 し た 。 次 に 、 こ の 組 換 え 細 胞 に BmNPVを 感 染 さ せ た と こ ろ 、 宿 主 細 胞 の 内 在 性 遺 伝 子 で あ るGAPDH遺 伝 子 の 発 現 は 減 少 し た が 、EGFP遺 伝 子 の 発 現 は 減 少 せ ず 、 む し ろ 増 加 し た 。 こ の こ と か ら 、 カr5は 宿 主 ゲ ノ ム 上 に shuto仟 を 回 避 で き る 領 域 を 作 る こ と が で き る と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、BmNPVの 艪 ユ を 標 的 と し たshRNAを 発 現 す るU6‐shRNA発 現 ユ ニ ツ 卜 と 宀r5 を 利 用 し て 組 換 え 細 胞 を 作 製 し 、 そ の ウ イ ル ス 増 殖 抑 制 効 果 を 調 査 し た 。 そ の 結 果 、 組 換 え 細 胞 に お い て は8mNPVの 増 殖 抑 制 が 認 め ら れ 、 最 も 増 殖 抑 制 効 果 の 高 か っ た 細 胞
（B10） に お い て は コ ン 卜 ロ ー ル の 非 組 換 え 細 胞 と 比 較 し て ウ イ ル ス の 増 殖 が1％ 以 下 に ま で 抑 制 さ れ た 。
最 後 にBmNPV感 染 に よ るshut off機 構 に つ い て 考 察 し た 。 ま ず 、 本 研 究 に お い て BmNPV感 染 に よ るshut off機 構 は 細 胞 ゲ ノ ム 上 の 遺 伝 子 に は 影 響 す る が プ ラ ス ミ ド ト の 遺 伝 子 に は 影 響 し な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 細 胞 ゲ ノ ム の 一 部 の 遺 伝 子 を 除 く 大 部 分 の 遺 伝 子 発 現 が 抑 制 さ れ る 現 象 と し て 熱 シ ョ ッ ク(Heat shock: HS)応 答 を 挙 げ る こ と が で き る 。 そ こ でHSに よ り 発 現 誘 導 さ れ る 遺 伝 子(samui)に つ い て 解 析 し た と こ ろ 、BmNPV 感 染 に よ っ て も 発 現 が 誘 導 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 こ の こ と か らBmNPV感 染 に よ り 起 こ る 細 胞 の 反 応 はHSに よ っ て 起 こ る 反 応 と 類 似 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ し て 、 興 味 深 い こ と に こ のHSに よ る 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 はhr5を 用 い て 回 避 で き る こ と が 明 ら か と な っ た 。 さ ら に 、BmNPV感 染 に よ り 発 現 が 抑 制 さ れ た 遺 伝 子 で はHSに よ る 発 現 抑 制 と 同 様 に ヌ ク レ オ ソ ー ム の 安 定 性 が 増 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 BmNPV感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のshuto仟 はHSに よ り 起 こ る 細 胞 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 と 同 様 な 機 構 で 起 こ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主 査 副 査 副 査 副 査
教 授 伴 教 授 増 准教授 浅 講 師 佐
戸 久 徳 田 税 野眞一郎 原 健
学 位 論 文 題 名
バキュロウイルス耐性カイコ作出に関する基盤研究
本 論 文 は72頁 、 図 表20か ら な り 、 参 考 論 文1編 が 付 さ れ て い る 。 バ キ ュ 口 ウ イ ル ス 科 に 属 す るBombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV)は カ イコ に 核 多 角 体病 を 弓1き 起こ す 病 原 ウ イ ル ス で あ る 。BmNPVは 古 来 よ り カ イ コ の 飼 育 に お い て 最 も 深 刻 な 被 害 を あ た え る も の の ひ と つ で あ り 、 核 多 角 体 病 の 発 生 予 防 は 現 在 も 世 界 の 養 蚕 業 に お い て 最 も 重 要 な 課 題の ひ と つ で ある 。 近 年 、BmNPV耐性 カ イ コ の 作出 を 目的 として 、lsobe et甜 ．（2004)はRNA polymerase ll (pol‖） 系 の プ 口 モ ー タ ー を 用 い てBmNPVの 必 須 遺 伝 子 で あ るlef‑lこ 対 す る 二 本 鎖RNA (dsRNA)を 発 現 す る よ う な ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク カ イ コ を 作 製 し た 。 こ の ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク カイ コ に お い ては 、 ウ イ ル ス の 経 口 摂 取 後96時 間 に お い て も ウ イ ル ス 増 殖 の 顕 著 な 抑 制 が 観 察さ れ た が 、 致死 率 の 劇 的 な 改善 は 認 め ら れな か っ た 。 さら に 、Kanginakudru et馴，(2007)によ ってもpol lI系の プロモ ー タ ー を 用 い てBmNPVの 必 須 遺 伝 子ielに 対 す るdsRNAを 発 現 す る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク カ イ コ が 作 製 さ れ た が 、 や は り 顕 著 なBmNPV耐 性 を カ イ コ に 付 与 す る こ と が で き な か っ た 。 こ の よ う に 、 こ れ ま で の と こ ろ 実 用 レ ベ ル で のBmNPV耐 性 カ イ コ の 作 出 に は 至 っ て い な い 。
耐 性 カ イ コ の 作 出 に 至 ら な か っ た 原 因 と し て はdsRNAの 発 現 が 組 織 特 異 的 発 現 制 御 を 受 け て し ま いdsRNAの 十 分 な 発 現 が 確 保 で き な か っ た 可 能 性 、 お よ びBmNPVが 引 き 起 こ す 宿 主 遺 伝 子 の 発現 抑 制(shut off)に よ って 、dsRNAの 発 現 が 継続 し な か っ た可 能 性 が 挙 げら れ る 。 本 研究 は 、 よ り 強 カ なBmNPV耐 性 を カ イ コ に 付 与 す る た め の 基 盤 研 究 と し て 、 ト ラ ン ス ジ ー ン(dsRNA発 現 遺 伝 子 ） の 発 現 を 妨 げ る こ れ ら の 問 題 を 解 決 す る た め の 研 究 を 行 っ た も の で あ る 。
一 般 的 にpol lIプ 口 モ ータ ー は 生 体 内に お い て 組 織 特異 的 制 御 を 受け る こ と か ら、 こ の よ う な プ ロ モ ー タ ー を 用 い た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク カ イ コ に お い て は 、 特 定 の 組 織 に お いて ト ラ ン ス ジ ー ン の 発 現 が 不 十 分 で あ る 場 合 が あ る 。 こ の 問 題 を 解 決 す る た め 、 一 般 に 組 織 特異 性 が 低 い と さ れ るRNA polymerase lIl (pol川 ） 系 の プ ロ モ 一 夕 ー で ある カ イ コU6プ ロ モ ー 夕 一を 利 用 し 、 small‑hairpin RNA (shRNA)発 現 ユ ニ ッ トを 作 製 し た 。ま ず 、U6プ口 モ ー タ ー を利 用 し たshRNA発 現 ユ ニ ッ ト(U6‑shRNA発 現 ユ ニ ッ ト ） を 持 っ プ ラ ス ミ ド を 用 い て レ ポ 一 夕 ー 遺 伝 子 に 対 す る 発 現 抑 制 効 果 を 評 価 し た 結 果 、U6‑shRNA発 現 ユ ニ ッ ト は カ イ コBmN細 胞 に お い て 効 果 的 に レ ポ
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一 夕 ー 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 で き る こ と が 判 明 し た 。 次 に 、 こ のU6‑shRNA発 現 ユ ニ ッ ト がBmN 細 胞 にBmNPV抵 抗 性 を 付 与 で き る の か を 調 査 し た 。 即 ち 、U6‑shRNA発 現 ユ ニ ッ ト を 有 す る プ ラ ス ミ ド を 用 い てBmNPVの 必 須 遺 伝 子ielを 標 的 と し たshRNAを 一 過 的 にBmN細 胞 で 発 現 さ せ
（ ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン効 率 は 約50％ ） 、 ウ イ ルス の 増 殖 抑 制効 果 を 調 査 した 。 そ の 結 果、shRNA を 発 現 さ せ た 細 胞 で は ウ イ ル ス 感 染48時 間 後 に お け る 培 養 上 清 中 の ウ イ ル ス 量 がshRNAを 発 現 し な い コ ン ト ロ ー ル の 細 胞 と 比 較 し て 約70％ 程 度 抑 制 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、U6‑shRNA発 現 ユ ニ ッ ト が カ イ コ の 細 胞 に お い て 効 果 的 にRNAiを 誘 導 す る こ と が で き る ツ ー ル であ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
次 に 、BmNPV感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のshut offに 関 す る 問 題 の 解決 を 試 み た 。バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のshut offは 転 写 レ ベ ルで の 制 御 で ある こ と が 考 え られ て い る が 、そ の 機 構 に つ い て は 明 ら か で は な し ゝ 。 し か し 、 興 味深 い こ と に ウイ ル ス の 遺 伝子 発 現 は 抑 制 され な い 。 こ の こ と は ウ イ ル ス 自 身 の 遺 伝 子 発 現 に はBmNPV感 染 に よ るshut offを 回 避 で き る 機 構 が 存 在 し て い る こ と が 考 え ら れ る 。 と こ ろ で 、BmNPVゲ ノ ム に 散 在 す る シ ス エ レ メ ン ト で あ るhr は 多 様 な ウ イ ル ス 遺 伝 子 の 発 現 を 活 性 化 す る こ とが 知 ら れ て いる 。 そ こ で 、hrがshut offを 回 避 す る の に 関 わ っ て い る の で は な い か と 考 え 、 検 証 実 験 を 行 っ た 。 ま ず 、hr5を 付 加 し たEGFP発 現 ユ ニ ッ ト をBmN細胞 の ゲ ノ ム に挿 入 し た 組 換え 細 胞 （r8mN‐A3EGFツhr5 ） を 作製 し た 。 次 に 、 こ の 組 換 え 細 胞 に8mNPVを 感 染 さ せ た と こ ろ 、 宿 主 細 胞 の 内 在 性 遺 伝 子 で あ るGAPDH遺 伝 子 の 発 現 は 減 少 し た が 、EGFP遺 伝子 の 発 現 は 減少 せ ず 、 む しろ 増 加 し た 。 この こ と か ら 、カ ′5は 宿 主 ゲ ノ ム 上 にshut0仟 を 回 避 で き る 領 域 を 作 る こ と が で き る と 考 え られ た 。 そ こ で 、BmNPVのf酊 を 標 的 と し たshRNAを 発 現 す るU6．shRNA発 現 ユ ニ ッ ト とhr5を 利 用 し て 組 換 え 細 胞 を 作 製 し 、 そ の ウ イ ル ス 増 殖 抑 制 効 果 を 調 査 し た 。 そ の 結 果 、 組 換 え 細 胞 に お い て はBmNPVの 増 殖 抑 制 が 認 め ら れ 、 最 も 増 殖 抑 制 効 果 の 高 か っ た 細 胞 （B10） に お い て は コ ン ト 口ー ル の 非 組 換え 細 胞 と 比 較 し て ウ イ ル ス の 増 殖 が1％ 以 下 に ま で 抑 制 さ れ た 。
最 後 にBmNPV感 染 に よ るshut off機 構 に つ い て 考 察 し て い る 。 ま ず 、 本 研 究 に お い てBmNPV 感 染 に よ るshut off機 構 は 細 胞 ゲ ノ ム 上 の 遺 伝 子に は 影 響 す る がプ ラ ス ミ ド 上の 遺 伝 子 に は影 響 し な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 細 胞 ゲ ノ ム の 一 部 の 遺 伝 子 を 除 く 大 部 分 の 遺 伝 子 発 現 が 抑 制 され る 現 象 と し て 熱 シ ョ ッ ク(Heat shock: HS)応 答 を 挙 げ る こ と が で き る 。 そ こ でHSに よ り 発現 誘 導 さ れ る 遺 伝 子(somui)に つ い て 解 析 し た と こ ろ 、BmNPV感 染 に よ っ て も 発 現 が 誘 導 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 こ の こ と か らBmNPV感 染 に よ り 起 こ る 細 胞 の 反 応 はHSに よ っ て 起 こ る 反 応 と 類 似 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ し て 、BmNPV感 染 に よ り 発 現 が 抑 制 さ れ た 遺 伝 子 で はHS に よ る 発 現 抑 制 と 同 様 に ヌ ク レ オ ソ ー ム の 安 定 性 が 増 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に、 興 味 深 い こ と に こ のHSに よ る 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 はhr5を 用 い て 回 避 で き るこ と が 明 ら かと な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、BmNPV感 染 に よ る 宿 主 遺 伝 子 のShutoffはHSに よ り 起 こ る 細 胞 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 と 同 様 な 機 構 で 起 こ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 こ の よ う に 本 研 究 で は 、 強 カ な BmNPV耐 性 を カ イ コ に 付 与 す る た め の 極 め て 有 効 な 要 素 技 術 を 確 立 す ると と も に 、 これ ま で 不 明 で あ っ た バ キ ュ 口 ウ イ ル ス の 宿 主 遺 伝 子 発 現 抑 制 機 構 に 関 し て 重 要 な 知 見 を 得 た 。
よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、 大 塚 大 輔 が 博 士 （ 農 学 ） の 学位 を 受 け る のに 十 分 な 資 格を 有 す る も の と 認 め た 。
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