機 能性核酸の創製を指向した

博 士 （ 薬 学 ） 兒 玉 哲 也

学 位 論 文 題 名

機 能性核酸の創製を指向した 1 ・修飾ヌクレオシド合成法の開発

学 位論文内容の要旨

【序論】

1 ・修飾ヌクレオシドの効率的合成法は少なく、多様な1 ‐修飾核酸の合成は困難である。その ため1 ‐修飾核酸についての研究は少ない。1．‐修飾ヌクレオシドから新たな機能性核酸を創製 するためには 、様々な1 一修飾核酸を系 統立てて合成しその基本的性質を再検討する必要があ ると筆者は考 えた。本研究ではまず、よ り多様な1 ー修飾ヌクレオシドを合成可能な新しい合 成法を開発し た。さらtこ、様々な1 ‐ 修飾核酸の合成が可能と考えられるヌクレオシドユニッ トのオリゴデオキシヌクレオチドヘの導入を検討した。

【結果】

！：2'‑jb立り221'‑*jヱル立ムエ2乏二ヒc高立佳選抵的7)1/ピニ2k反応

    アルド ール反応は炭素―炭素結合形 成反応のなかでも最も汎用 性のある反応のーつである。

筆者はヌク レオシド1 ‐位でアルドール反応を行うことができれば極めて有用な1 ・炭素置換ヌ クレオシドの合成法になると考え、その開発を行った。

    まず、3 ‑N‑ベンジルオキシメチル(BOM)ー1 ‐フェニルセレネニル‐2 ‐ケ卜ウリジン誘導体を THF中 ―78℃で 、2.1当 量の ヨウ 化 サマ リウ ムで 処理 し たと ころ 、フ ェニルセレネニル 基が還 元 的に 脱離 し、 ウ リジ ン1 − サマ リウ ムエ ノラート(I)が 生成した。―78℃でIをアル デヒド 処理すると、立体選択的に1 −位がS配置の1 弭炭素置換‐2 ‐ケトウリジン誘導体（シン付加体）

を 与え た。 例え ば 、3等量のべ ンズアルデヒドとの反応では76%の収率で1 a‐ベンジル アルコ ー ル 体 を 与 え た 。 一 方 、 −78℃ で 調 製 し たIに5当 量 のア ルデ ヒ ドを 加え たの ち0℃付 近に 昇 温す る とTishchenko反 応が 効率 的に 進行 し 、ベ ンズ アル デヒ ド との 反応 では74%、ア セト アルデヒド との反応では83%の収率で1 ‐〇‐アシルーアラピノシルウラシル誘導体をほぼ単一の 生成物として与えた。

    本 反応 遷移 状 態に おい ては 、 嵩高 いBOM―ウラシル部 とアルデヒド側鎖の立体反発 がフラ ノ ース 環と アル デ ヒド 側鎖 の立 体 反発 より も大 きく な る。 結果 とし て相対的に立体反 発の小 さ い、 アル デヒ ド 側鎖 がフ ラノ ー ス環 内に 位置 する 遷 移状 態を 経て アルドール反応が 進行し た と 考 え ら れ 、 本 反 応 で 立 体 選 択 的 に シ ン 付 加 体 が 得 ら れ た こ と を 説 明 で き る 。     なお、 アルドール成績体については2 ―カルボニル基の還元を 経て対応するりボ体へ、ま たTishchenko成 績 体 は 保 護 基 を 除 去 す る 事 で ア ラ ピ ノ 体 へ と 変 換 す る こ と に 成 功し た。

2：3： ，5'‑TIPDS‑1 ‐ ヒ ピ 旦 主2甚 王 座Z乏 ピ22腹 立 乏2止(II塑 宝 田 的 金 成 法Q囲 発     1 ― 修飾 ウル ジンの重要 な合成中間体であるnの実用 的合成法の開発を行った。ウ リジン 1 − リチ ウム エノ ラート（In）のTHF溶液にホルムアルデ ヒドを通じた後、水素化トリ アセト キ シホ ウ素 ナト リ ウム によ る還 元 、さ らに アン モニ ア 処理 を途 中シ リカゲルカラム精 製する こ とな く 連続 して 行う こ とで 、IIを収 率62u/oで合 成 でき る（ ウル ジン か ら通 算収 率40%)。 量：i'‑2Lレ室璽墨2ヒ耋2ピ遜謹佳Q合成班究

    フ ルオ 口ヌ ク レオ シド は生 化 学的 、医 薬化 学的 に 重要 な性 質を 示すことから、そ の合成 研究が盛ん に行われてきた。しかし、1 ‐フルオ口ヌクレオシドの研究報告は一例もない。1 − フ ルオ ロヌ クレ オ シド は極 めて 不 安定 であ るこ とが 予 想さ れる が、 なんらかの方法で 安定化 し 単離 可能 にな る なら ば、 その 生 物活 性に は非 常に 興 味が ある ため 、その合成を検討 した。

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    ま ず 、mとNFSIの 反 応を 検討 した 。 その 結果 、THF中 ー78℃の 反 応で は収 率87%で1 ― フル オ 口2 −ケ ト 体(IV)が 生成 することが分かった。 溶媒効果について検討したと ころ、多 くの 溶 媒中 では 望み とし な いpー フ ルオ 口体IVbが主 生成 物と し て得 られ るが 、DMFを用いた 時に の み目 的のa‐ フル オ口 体IVaが 主生 成物 と して 得ら れる こ とが 分か った 。目 的のIVaに つい て は、 その2 ‐カ ルボ ニル 基 をDIBAL‑Hで 還元 後、 生じた水酸基をアセチル化 すること で1 a− フ ル オ 口 ア ラ ピ ノ 体 と り ボ 体(arabino:ribo＝ 4:1） へ と 変 換 し た 。     っ ぎに、1 −フェニル セレネニル卜リアセチルウリ ジン(V)の脱フ工二ルセレネ ニル化一 フ ッ 素 化 を 検 討 し た 。 は じ め に 、VをDASTNBSで 処 理 し た と こ ろ 、 収率70%で1 ―フ ル オ ロト リ アセ チル ウリ ジン(VI)が 生成した。反応条件を種 々検討したが、多くの場合 で2 ．ア セ チ ル 基 の 隣 接 基関 与で 生成 す ると 考え られ るpフル オロ 体Vlbが 立 体選 択的 に生 成し た 。 一 方 、 塩 化 メ チ レン 中MS3A存 在 下キ セノ ンジ フル オ リド(XeF2)で 処 理す ると 、わ ずか に 目 的のa‐フルオ口体Vlaを優先して与えた（収率43%，Vla:Vlb＝ 2:1）。

    1 ‐フルオ口ヌクレオシド誘導体を安定に得るには少なくとも2 ‐位に電子吸引基の必要性 が示 唆 され た。 そこ でヌ ク レオ シド の構 造お よ び性 質を 大きく変化させることなく 強い電子 吸引性を示すフッ素原子を2 −位にも持つ1 ．2 ‐ジフルオロウリジン誘導体VIIを新たな合成標 的とした。3 ，5 ‑DTBS‑1 ，2 ‐不飽和ウリジン誘導体(vIn)の塩化メチレン溶液をMS3A存在下 2.0当 量 のXeF2で 処 理 す る と 、 フ ッ 素 分 子 が 付 加 し た 望 み のvnが46%の 収率 で得 られ た 。 光照 射 や加 熱、 ルイ ス酸 の 添加 は、 原料 の消 費 を促 進す るが反応を複雑化し、収率 を低下さ せた。溶媒は1，1，1，3，3，3‐ヘキサフルオ口イソプ口パノールが適当で、収率85%でVIIを与えた。

最後にVIIのシリル基をTBAF―酢酸で除去することで1 ，2 −ジフルオロ‐2―デオキシウリジン を約80010の収率で 得ることに成功した。これは 保護基のない1 −フルオ口ヌクレオシド誘導体 を得た初めての例である。

生！：＝籃飾立り22童盒塑耋リゴ乏室主2墨2ヒ耋2ピ(ODN) cD合成

    核 酸構 造上 の一 定部 位 に多 様な 置換 基を 簡 便か つ同 一の方法論で導入する事は 、導入し た置 換 基が 核酸 の性 質に 与 える 影響 を系 統的 に 解明 する 有効な手段であり、機能性 核酸の創 製に重要である。筆 者は、1 ‐メ卜キシカルボ ニル‐2 ‐デオキシウリジ ン(IX)をDNA自動合 成機 でODNに 導入 後 、ODNの 樹脂 から の切 り出 し と同 時に 官能 基 変換 をす るこ とで1 ‐修飾 ウリ ジ ンを 含むODNを合 成す るポ ス ト合 成法 の確 立を 計 画し た。 本研 究で は 方法論 の確立を 目的として1 ‐位 にカルポキシル基(ODN‑a)、 カルパモイル基(ODN―b）、 およびメ卜キシカル ボ ニ ル 基(ODN‑c)を 持 つODNを 合 成 し 、 そ の 基 本 的 性 質 を 検 討 す る こと にし た。 また 小 さ な 疎 水 性 残 基 と し て メ チ ル 基 を 持 つODN‑dを 別 途 合 成 し 、 そ の 性 質 を 比 較 し た 。     ま ずIXの ア ミ ダ イ ト ユ ニ ッ 卜 用 い てIXを 含 むODNをCPG樹 脂 に 担 持 さ れ た 状 態 で 合 成 し た 。 こ のCPG樹 脂 に 担 持 さ れ たIXを 含 むODNは 、 室 温 下 、 水 酸 化カ リウ ム水 溶液 で 処 理す る 事で 樹脂 から 切り 出 され 、同 時にODN‑aに 変換 さ れた 。同 様に 、無 水 条件下 飽和アン モニ ア メタ ノー ルで 処理 す る事 でODN‑b、炭酸カリウム メタノール溶液で処理する事 でODNーc を 得 る こ と が 出 来 た 。 次 に 、 合 成 し たODNの 二 本 鎖 高 次 構 造 の 熱 的 安定 性をL値 で評 価 し た。 そ の結 果、1 ‐修 飾体 を一 残 基持 っす べて の二 本 鎖ODNは 天然 型ODNの みから なる二本 鎖DNAと 比 較 し 熱 的 に 不 安 定 に な っ た 。 わ ず か 一 残 基 導 入 す る こ と でL値を 約23℃低 下 さ せた1 ‐カ ルポ キ シル 体は 興味 深 い。 次に 、ExoIに よ るODNの加水分解速度を比較 した。た と え ば 、ODN‑uが30分 以 内 に ほ ぼ 全 て 分 解 さ れ た 条 件 下 、ODN‑aやODN‑bは 修 飾 体 の 導 入 さ れ た 位 置 でExol耐 性 を 示 し た 。120分 後 に お い て 完 全 に 分 解 さ れ たODNは6%以 下で あ っ た 。 ま た 、 合 成 し たODNの ウ ラ シ ル‑DNAグ リ コ シ ラ ー ゼ(UNG)阻 害 剤 と し て の 性 質 を 検 討 し た 。 そ の 結 果、ODN‑dはUNGのウ ラシ ル除 去活 性 を競 合阻 害す る こと を明 らか にし た 。

【結語】

1）ヌクレオシド1 ‐位を求核種とした1 一位でのはじめての炭素‐炭素結合形成反応としてウル ジン1 ‐サマリウムェノラートを用いるアルドール反応を開発した。211 ‐ヒド口キシメチルア ラピノシルウラシル誘導体の実用的合成法を確立した。3)1 ，2 −ジフルオ口ウリジンを設計し、

保護基のない1 ‐フルオロヌクレオシドの初めての合成に成功した。4）1 −メトキシカルポニルー 2 ・デオキシウリ ジンを用いた、1 ．修飾ヌクレオシドを含むODNの新しい合成法を確立した。

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学位論文審査の要旨

主 査   教 授   松 田   彰 副 査   教 授   橋 本 俊 一

副査   助教授   中島 副査   助教授   周東

学 位 論 文 題 名

誠 智

機能性核酸の創製を指向した 1 ・修飾ヌクレオシド合成法の開発

    1 ―修飾ヌクレオシドの効率的合成法は余り知られていない。そのため1 ― 修飾核 酸につい ての研究 は少ない 。1t ―修飾 ヌクレオシドから新たな機能性核酸 を創製 するため には、様 々な1 一修飾核酸を系統立的に合成しその基本的性質を 調べる 必要があ る。本研 究ではまず、より多様な1 一修飾ヌクレオシドを合成可 能な新 しい合成 法を開発 した。さらに、様々な1 ―修飾核酸の合成が可能と考え られる ヌクレオ シドユニ ットをオ リゴデオ キシヌクレ オチドヘ導入し，その性質 を検討した。

1 ． 2 − ケ ト ウ リ ジ ン1 ― サ マリ ウ ム エノ ラ ート の 高 立体 選 択的 ア ル ドー ル 反応     3‑N‑ ベンジルオキシメチル(BOM) ―1 −フェニルセレネニル―2 ―ケトウリジ ン 誘 導 体 を THF 中 一 78 ℃ で 、 2.1 当 量 の ヨ ウ 化 サ マリ ウ ム で処 理 した と こ ろ、

フェニル セレネニ ル基が還 元的に脱離し、ウリジン1 ―サマリウムエノラート(I) が生 成 し た。 ― 78 ℃ で I を アル デ ヒド処理す ると、立 体選択的 に1 ―位 がS 配置 の1 伐―炭素置換―2 ―ケトウリジン誘導体（シン付加体）を与えた。ー方、‑78 ℃ で 調 製 し た I に 5 当 量 の ア ル デ ヒ ド を 加 え た の ち O ℃ 付 近 に 昇 温 す る と Tishchenko 反応が進 行し、高 収率で1 ―くトア シルーアラピノシルウラシル誘導 体をほぼ 単一の生 成物とし て与えた 。アルドー ル成績体については2 一カルボニ ル基 の 還 元を 経 て対 応 す るり ボ 体へ 、 ま た Tishchenko 成績 体 は保護基 を除去す る事でアラピノ体へと変換した。

2 ． 3 ， 5 ―TIPDS −1 −ヒドロ キシメチ ルアラピノ シルウラ シル(II) の実 用 的合 成法の開 発

    1 一 修飾ウリ ジンの重 要な合成中 間体であるII の実用的合成法の開発を行っ た 。 ウリ ジ ン1 ― ル チ ウム エ ノラ ー ト aii) のTHF 溶液 にホルム アルデヒ ドガス を通 じた後、 水素化．トリアセトキシホウ素ナトリウムによる還元、さらにアンモ ニア 処理を途 中シリカ ゲルカラム 精製する ことなく 連続して 行うこと で、II を収 率62 ％ で合成で きること を明らかに した。

3 ． 1 ― フ ル オ ロ ヌ ク レ オ シ ド 誘 導 体 の 合 成 研 究

     ま ず 、 III と NFSI の 反応 を 検討 し た 。そ の 結果 、 THF 中ー 78 ℃の 反 応で は

収率87％で1，−フルオロー2，−ケ卜体(IV)が生成することが分かった。化合物IV の2，−カルボニル基を還元後、生じた水酸基をアセチル化することでroc‑フルオ ロアラビノ体とリボ体へと変換した。つぎに、 '一フェニルセレネニルトリアセチ ルウリジン(V)の脱フエニルセレネニル化一フッ素化を検討した。はじめに、v をDAST‑NBSで処理したところ、収率70%でr‑フルオロトリアセチルウリジン (VI)が得られた。

r‑フルオロヌクレオシド誘導体を安定に得るには2'‑位に電子吸引基の存在が 必要であることが示唆された。そこでヌクレオシドの構造および性質を大きく変化 させることなく強い電子吸引性を示すフッ素原子を2，−位に持つ1¥2'‑ジフルオロウ リジン誘導体ⅥIを新たな合成標的とした。3¥5'‑DTBS‑l¥2'‑不飽和ウリジン誘導 体(VIII)の1,1,1,3,3,3‑ヘキサフルオロイソプロパノール溶液をMS3A存在下2.0当 量のXeF,で処理すると、フッ素分子が付加した望みのⅥIが85%の収率で得られ た。最後にⅥIのシリル基をTBAF‑酢酸で除去することでr,2'‑ジフルオロ‑2'‑デオ キシウリジンを約80％の収率で得ることに成功した。これは保護基のないr‑フル オロヌクレオシド誘導体を得た初めての例である。

4.1,‑修飾ウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオシH(ODN)の合成

DNA上の決められた位置に多様な置換基を簡便かつ同一の方法で導入する事 ができれば、導入した置換基の核酸の性質に与える影響を系統的に調べることがで きる。1，−メトキシカルボール‑2,‑デオキシウリジン（Ⅸ）をDNA自動合成機でODN に導入後、ODNの樹脂からの切り出しと同時に官能基変換をすることでV‑修飾ウ

リジンを含むODNを合成するポスト合成法を計画した。本研究では1'‑位にカルボ キシル基(ODN‑a)、カルバモイル基(ODN‑b)、およびメトキシカルボール基 (ODN‑c)を持つODNを合成し、その基本的性質を検討した。また小さな疎水性残

基としてメチル基を持つODN‑dを別途合成し、その性質を比較した。

まずⅨを含むODNをCPG樹脂に担持された状態で合成した。このCPG樹 脂に担持されたⅨ‑ODNは、室温下、KOH水溶液で処理する事で樹脂から切り出

で処理する事でODN‑bを、炭酸力1jウムメタノール溶液で処理する事でODN‑cを 得ることが出来た。合成したODNの二本鎖高次構造の熱的安定性をZ､値で評価し た。その結果、r‑修飾体を一残基持つすべての二本鎖ODNは天然型ODNのみか らなる二本鎖DNAより熱的に不安定になった。わずか一残基導入することでZn値 を約23℃低下させたr‑カルボキシル体は興味深い。次に、ExolによるODNの加 水分解速度を比較した。たとえば、未修飾のODNが30分以内にほぼ全て分解され た条件下、ODN‑aやODN‑bは修飾体の導入された位置でExol耐 性を示した。120 分後において完全に分解されたODN‑a,‑bは6%以下であった。また、合成したODN のウラシル‑DNAグリコシラーゼ(UNO)阻害剤としての性質を検討した。その結 果、ODN‑dはUNGのウラシル除去活性を競合阻害することを明らかにした。

以上のように，本研究では，1）ヌクレオシド1，−位を求核種とした1，−位で のはじめての炭素‑炭素結合形成反応としてウリジン1'一サマリウムエノラートを用 いるアルドール反応を開発したこと，2）1，−上Fロキシメチルアラビノシルウラシ ル誘導体の実用的合成法を確立したこと，3）1，，2，−ジフルオロウリジンを設計し、

保護基のない1，−フルオロヌクレオシドの初めての合成に成功したこと，4）1，−メ トキシカルボニルー2'一デオキシウリジンを用いた、1，−修飾デオキシウリジンを含 むODNの新しい合成法を確立したことから、博士（薬学）の学位を授与するに足 る内容を持つものと認定した。

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