博 士 （理 学）高 野直 治
学 位 論 文 題 名 ●
Studies on novel serine protelnaSeSeXpreSSed ●
lnmouSeteStiS
（ マ ウ ス 精 巣 に 発 現 す る 新 規 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ に 関 す る 研 究 ）
学位論文内容の要旨
生体内におけるプロテアーゼの役割は、タンパク質の代謝、分解、また、限定分解によ る他のタンパク質の活性化など多岐にわたり、多くの重要な生理機能を担っている。精巣 においてプロテアーゼは、精細胞から精子への形態変化、ペプチドホルモンの産生と分解、
ECMの分解や種々のタンパク質のプロセシング等で重要な役割を果たすと考えられるが、過 去の研究は主に精子先体に含まれるプロテアーゼと受精の関わりについておこなわれてお り、精子形成過程における役割は明らかとなっていない。本研究では、プロテアーゼの中 でも精子形成過程で発現する新規分子を探索し、その解析を通して精巣機能，特に精子形 成過程の分子機構，に迫ることを目的とした。
本研 究は，マ ウス精 巣に発現 する新規プロテアーゼ2種，TESSP―1及びGranzymeN，に ついて，分子生物学的，生化学的，細胞生物学的解析を進め，これらのプロテアーゼが精 子形成過程に関与することを明らかにした。
第1章GranzymeNのクローニングおよび解析
GranzymeNはGranzymeサブ フ ァ ミリ ー に 属 する 新 規 のプ ロ テ アー ゼ で ある 。 他 の Granzymeとは異なり、脾臓細胞で発現せず、オスの生殖細胞に特異的に発現する。また、
哺乳類培養細胞を用いたりコンビナントタンパク質の解析、む釘tu hybridization、免疫 組織化学染色により、精母細胞、精子細胞において発現する分泌性タンパク質であること を明らかにした。Granzyme一A，B，Cはアポトーシスを引き起こす因子であることが知られ て いたた め、GranzymeNと生殖細胞のアポトーシスの関わりについて解析した。生殖細胞 のアポトーシスの実験モデルとして用いられる熱ストレスを与えた精巣と、停留睾丸実験 マ ウスを 作成し、 これら の精巣に おけるGranzymeNのmRNAおよびタンパク質レベルでの 挙動を調べた。この結果、熱処理により誘導される生殖細胞のアポトーシスにはGranzymeN は 関与し ないことを明らかにした。ヒト精巣で発現するGranzymeB、ラット精巣で発現す るGranzymeKの研究 とあわせ 考察する とGranzymeNは生殖 細胞の精 細管内 腔への移 動に ともなう細胞外基質の分解に関与すると考えられる。
第2章TESSP―1のク ローニン グおよぴ 基本的な解析 ―271−
TESSP―1(Testis specific serine protease―1）cDNAは全長1128bpからなり、322アミ ノ酸残基からなるセリンプ ロテアーゼをコードしていた。また、ヒトにホモログが存在す ることから、TESSP−1は哺 乳類に広く保存されていると予想される。mRNAの発現はノーザ ン解析より精巣特異的であり、1週齢で弱いながらも発現が始まり、その後性成熟にともな い発現量が増加することが わかった。mRNAの精巣内における局在をむsituhybridization で調べたところ、精原細胞 およぴ精母細胞で発現することがわかった。次に、哺乳類培養 細胞で発現させたりコンビ ナントTESSP‑1の解析により 、TESSP―1は42kDaのGPIアンカー タイプの膜タンパク質であり、糖鎖修飾を受けることが分かった。以上のことから、TESSP−1 は細胞膜上にプロテアーゼ ドメインを露出する形で存在し、細胞外の基質に作用すること が考えられた。
第3章TESSP―1の生理機能の研究
精巣内における内在性TESSP−1タンパク質の機能を調べるために、TESSP―1抗体を作成し 研究をおこなった。この 抗体を用いて精巣抽出液をウエスタンブロット解析したところ、
35kDaのTESSP−1の発現が確認された。次に、マウス精巣を用いて免疫組織螢光染色をおこ なぃ、TESSP一1の局在を調べた。TESSP―1のシグナルは精細管の基底膜側における精原細胞 での細胞膜状に広がった シグナルと、精細管内腔側に存在する精母細胞と精子細胞におけ るドット状のシグナルの2つの特徴を示した。それぞれのシグナルの存在様式が何を反映 しているのかを検討したところ、基底膜におけるシグナルはNーcadherinと共局在し、ドッ ト状のシグナルはRab6と共局在することが分かった。N一cadherinは生殖細胞とセルトリ細 胞の間の細胞間接着に働 くことから、その接着においてTESSP―1が機能すると考える。ま た、Rab6のシグナルはゴ ルジ体マーカーであることから、ドット状のTESSP−1はゴルジ体 に存在すると考えられる。しかしながら、精巣の細胞を分散した後に、TESSP―1抗体で免疫 染色をおこなったところ、TESSP−1のドット状のシグナルは観察されなくなった。これは、
TESSP−1のドット状のシ グナルが生殖細胞とセルトリ細胞の接着が形成されている精巣内 でしか観察されないことを表し、TESSP−1がゴルジ体ではなく、その接着部位に局在するこ とを示唆する結果となった。また、TESSP―1の分布の変化は生殖細胞の極性形成に伴うもの と考えられた。
以上、本研究によって，新規プロテアーゼGranzymeN及ぴTESSP―1の特性が明らかにさ れた。さらに、精細管内におけるプロテアーゼと生殖細胞の移動の関わり、また細胞間接 着と生殖細胞の極性形成の関わりも明らかにした。よって本研究は、生殖生物学の発展に 大きく貢献するものである。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主 査 教 授 高 橋 孝 行 副 査 教 授 山 下 正 兼 副 査 助教 授 木村 敦
学位論 文題名
Studies on novel serine proteinases expressed I
in mouse testis
（ マ ウ ス 精 巣 に 発 現 す る 新 規 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ に 関 す る 研 究 ）
生体内におけるプロテアーゼの役割は、タンパク質の代謝、分解、また、限定分解によ る他のタンパク質の活性化など多岐にわたり、多くの重要な生理機能を担っている。精巣 においてプロテアーゼは、精細胞から精子への形態変化、ペプチドホルモンの産生と分解、
ECMの分解や種々のタンパク質のプロセシング等で重要な役割を果たすと考えられるが、過 去の研究は主に精子先体に含まれるプロテアーゼと受精の関わりについておこなわれてお り、精子形成過程における役割は明らかとなっていない。本研究では、プ口テアーゼの中 でも精子形成過程で発現する新規分子を探索し、その解析を通して精巣機能，特に精子形 成過程の分子機構，に迫ることを目的とした。
本 研究は， マウス 精巣に発 現する 新規プロ テアー ゼ2種，TESSPー1及びGranzymeN，に ついて，分子生物学的，生化学的，細胞生物学的解析を進め，これらのプロテアーゼが精 子形成過程に関与することを明らかにした。
第1章GranzymeNのクローニングおよび解析
GranzymeNはGranzymeサ ブフ ァ ミ リー に 属 する 新 規 の プロ テ ア ーゼ で あ る。 他 の Granzymeとは異なり、脾臓細胞で発現せず、オスの生殖細胞に特異的に発現する。また、
哺乳類培養細胞を用いたりコンビナントタンパク質の解析、むsitu hybridization、免疫 組織化学染色により、精母細胞、精子細胞において発現する分泌性タンパク質であること を明らかにした。GranzymeーA，B，Cはアポトーシスを引き起こす因子であることが知られ てい たため、GranzymeNと 生殖細胞のアポトーシスの関わりについて解析した。生殖細胞 のアポトーシスの実験モデルとして用いられる熱ストレスを与えた精巣と、停留睾丸実験 マウ スを作成 し、こ れらの精 巣にお けるGranzymeNのmRNAおよ びタン パク質レ ベルでの 挙動を調べた。この結果、熱処理により誘導される生殖細胞のアポトーシスにはGranzymeN は関 与しない ことを 明らかにした。ヒト精巣で発現するGranzymeB、ラット精巣で発現す
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るGranzymeKの 研究 とあ わ せ考 察す るとGranzymeNは生殖細胞の精細管内腔への移動に と もな う細 胞外 基質 の分 解に 関与 する と考 えら れる 。
第2章TESSP―1のクローニングおよび基本的な解析
TESSP―1(Testis specific serine protease―1）cDNAは全長1128bpからなり、322アミ ノ酸残基からなるセリンプロテアーゼをコードしていた。また、ヒ卜にホモログが存在す ることから、TESSP―1は哺乳類に広く保存されていると予想される。mRNAの発現はノーザ ン解析より精巣特異的であり、1週齢で弱いながらも発現が始まり、その後性成熟にともな い発現量が増加することがわかった。mRNAの精巣内における局在をむsitu hybridization で調べたところ、精原細胞および精母細胞で発現することがわかった。次に、哺乳類培養 細胞で発現させたりコンビナントTESSPー1の解析により、TESSPー1は42kDaのGPエアンカー タイプの膜タンパク質であり、糖鎖修飾を受けることが分かった。以上のことから、TESSP―l は細胞膜上にプロテアーゼドメインを露出する形で存在し、細胞外の基質に作用すること が考えられた。
第3章TESSP−1の生理機能の研究
精巣内における内在性TESSP―1タンパク質の機能を調べるために、TESSP−1抗体を作成し 研究をおこなった 。この抗体を用いて精巣抽出液をウエスタンブロット解析したところ、
35kDaのTESSP―1の発現が確認された。次に、マウス精巣を用いて免疫組織螢光染色をおこ ない、TESSP―1の局在を調べた。TESSP―1のシグナルは精細管の基底膜側における精原細胞 での細胞膜状に広 がったシグナルと、精細管内腔側に存在する精母細胞と精子細胞におけ るドット状のシグ ナルの2つの特徴を示した。 それぞれのシグナルの存在様式が何を反映 しているのかを検 討したところ、基底膜におけるシグナルはN―cadherinと共局在し、ドッ 卜状のシグナルはRab6と共局在することが分かった。Nーcadherinは生殖細胞とセルトリ細 胞の間の細胞間接 着に働くことから、その接着においてTESSP―1が機能すると考える。ま た、Rab6のシグナ ルはゴルジ体マーカーであることから、ドット状のTESSPー1はゴルジ体 に存在すると考え られる。しかしながら、精巣の細胞を分散した後に、TESSP‑1抗体で免疫 染色をおこなったところ、TESSP―1のドット状のシグナルは観察されなくなった。これは、
TESSP―1のドット 状のシグナルが生殖細胞とセルトリ細胞の接着が形成されている精巣内 でしか観察されないことを表し、TESSPー1がゴルジ体ではなく、その接着部位に局在するこ とを示唆する結果となった。また、TESSP―1の分布の変化は生殖細胞の極性形成に伴うもの と考えられた。
以上、本研究によって，新規プロテアーゼGranzymeN及びTESSP―1の特性が明らかにさ れた。さらに、精細管内におけるプロテアーゼと生殖細胞の移動の関わり、また細胞間接 着と生殖細胞の極性形成の関わりも明らかにした。よって本研究は、生殖生物学の発展に 大きく貢献するものである。一部の成果は、すでに国際的学術専門誌に公表されており、
申 請 者 の 研 究 が 世 界 的 レ ベ ル で 評 価 を 受 け て い る こ と は 明 ら か で あ る 。 よって、申請者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認める。
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