質量分析法を用いるホルモンドーピング検査法に関する研究
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(2) 目次 緒 論 ............................................................................................................................... 1 日 本 人 に お け る テ ス ト ス テ ロ ン ド ー ピ ン グ 検 査 の 妥 当 性 検 証 と 改 良 ........... 7. 第１章 1.1. 序 論 ................................................................................................................... 7. 1.2. 実 験 の 部 ........................................................................................................... 10. 1.2.1. 試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 10. 1.2.2. GC–MS に よ る 尿 中 の steroid profile の 分 析 .................................................. 11. 1.2.3. GC–IRMS に よ る 尿 中 ス テ ロ イ ド の 炭 素 同 位 体 比 測 定 ................................. 12. 1.2.4. UGT2B17 遺 伝 子 解 析 ..................................................................................... 13. 1.2.5. 統 計 解 析 ........................................................................................................ 14. 1.2.6. ヒ ト 試 料 ........................................................................................................ 14. 1.2.6.1. 日 本 人 競 技 者 .............................................................................................. 15. 1.2.6.2. Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験 .............................. 15. 1.3. 結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 15. 1.3.1. UGT2B17 遺 伝 子 解 析 ..................................................................................... 15. 1.3.2. Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル ................................................ 18. 1.3.3. Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験 ................................. 25. 1.3.3.1. Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル ............................................. 25. 1.3.3.2. Testosterone 関 連 代 謝 物 の 炭 素 同 位 体 比 ..................................................... 32. 1.4. 小 括 .................................................................................................................. 39 成 長 ホ ル モ ン 分 泌 刺 激 製 剤 GHRP-2 の UPLC–MS/MS を 用 い た ド ー ピ ン グ 検. 第２章. 査 法 の 開 発 ................................................................................................................... 40 2.1. 序 論 .................................................................................................................. 40. 2.2. 実 験 の 部 ........................................................................................................... 42. 2.2.1. 試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 42. 2.2.2. Calibrator の 調 製 ............................................................................................ 43. 2.2.3. ヒ ト 尿 試 料 の 前 処 理 方 法 ............................................................................... 43. 2.2.4. 精 密 質 量 分 析 ................................................................................................. 43. 2.2.5. UPLC–MS/MS ................................................................................................ 43. 2.2.6. UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン ................................................ 45. 2.2.6.1. 妨 害 物 質 の 確 認 .......................................................................................... 45. 2.2.6.2. 直 線 性 ......................................................................................................... 45. 2.2.6.3. 回 収 率 ......................................................................................................... 45. 2.2.6.4. 検 出 下 限 ..................................................................................................... 45. 2.2.6.5. 日 内 再 現 性 お よ び 日 間 再 現 性 ..................................................................... 45. 2.2.6.6. イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン ............................................................................... 46.
(3) 2.2.6.7. キ ャ リ ー オ ー バ ー ....................................................................................... 46. 2.2.7. GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定 ......... 46. 2.2.8. ヒ ト 試 料 ........................................................................................................ 47. 2.2.8.1. 日 本 人 健 常 男 性 （ 非 競 技 者 ） ..................................................................... 47. 2.2.8.2. rhGH の 単 回 皮 下 投 与 試 験 .......................................................................... 47. 2.2.8.3. GHRP-2 の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験 .................................................................. 47. 2.2.8.4. rhGH と GHRP-2 の 併 用 投 与 試 験 ............................................................... 47. 2.2.9 2.3. 統 計 解 析 ........................................................................................................ 48 結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 48. 2.3.1. GH isoform differential immunoassay に よ る 血 清 中 GH 同 族 体 の 測 定 ........... 48. 2.3.2. GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発 ................ 55. 2.3.3. 尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 の 同 定 ................................................................ 63. 2.3.4. UPLC–MS/MS に よ る 尿 中 GHRP-2 と そ の 代 謝 物 AA-3 の 定 量 ................... 64. 2.4. 小 括 .................................................................................................................. 67. 第 ３ 章 エ リ ス ロ ポ エ チ ン 製 剤 ダ ル ベ ポ エ チ ン ア ル フ ァ の UPLC–MS/MS を 用 い た ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 .................................................................................................... 68 3.1. 序 論 .................................................................................................................. 68. 3.2. 実 験 の 部 ........................................................................................................... 69. 3.2.1. 試 薬 お よ び 材 料 ............................................................................................. 69. 3.2.2. Immunopurification ......................................................................................... 70. 3.2.3. V8-プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 消 化 ......................................................................... 71. 3.2.4. TOF–MS に よ る ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ ............................................................. 71. 3.2.5. UPLC−MS/MS ................................................................................................ 71. 3.2.6. デ ー タ ベ ー ス 検 索 ......................................................................................... 72. 3.2.7. UPLC–MS/MS 法 の メ ソ ッ ド バ リ デ ー シ ョ ン ................................................ 72. 3.2.7.1. 妨 害 物 質 の 確 認 .......................................................................................... 72. 3.2.7.2. 直 線 性 ......................................................................................................... 72. 3.2.7.3. 回 収 率 ......................................................................................................... 73. 3.2.7.4. 検 出 下 限 ..................................................................................................... 73. 3.2.7.5. 日 内 再 現 性 お よ び 日 間 再 現 性 ..................................................................... 73. 3.2.7.6. イ オ ン サ プ レ ッ シ ョ ン ............................................................................... 73. 3.2.7.7. 定 性 分 析 ..................................................................................................... 74. 3.2.7.8. キ ャ リ ー オ ー バ ー ....................................................................................... 74. 3.2.8. Darbepoetin alfa の 単 回 静 脈 内 投 与 試 験 ......................................................... 74. 3.2.9. IEF–PAGE、 ダ ブ ル ブ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び 化 学 発 光 検 出 .............................. 74. 3.3 3.3.1. 結 果 お よ び 考 察 ................................................................................................ 75 ペ プ チ ド 分 析 対 象 ペ プ チ ド の 決 定 ................................................................ 75.
(4) 3.3.2. デ ー タ ベ ー ス 検 索 ......................................................................................... 80. 3.3.3. Darbepoetin alfa の UPLC–MS/MS に よ る 分 析 法 の 開 発 ................................. 80. 3.3.4. 尿 中 Darbepoetin alfa の 分 析 .......................................................................... 86. 3.4. 小 括 .................................................................................................................. 89. 総 括 .............................................................................................................................. 90 謝 辞 .............................................................................................................................. 93 研 究 結 果 の 掲 載 誌 ........................................................................................................ 94 引 用 文 献 ....................................................................................................................... 95.
(5) 略語 ア ミ ノ 酸 の 表 記 は 、 International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry and Molecular Biology - IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ JCBN） の 提 唱 し た １ 文 字 も し く は ３ 文 字 記 号 を 使 用 し た 。 AAF. : Adverse analytical finding. ABP. : Athlete biological passport. BMI. : Body mass index. CE. : Collision energy. CID. : Collision-induced dissociation. CIR. : Carbon isotope ratio. CV. : Cone voltage. EI. : Electron ionization. EPO. : Erythropoietin. ESI. : Electrospray ionization. GC–IRMS. : Gas chromatography isotope ratio mass spectrometry. GC–MS. : Gas chromatography mass spectrometry. GH. : Growth hormone. GHRH. : Growth hormone releasing hormone. GHRP. : Growth hormone releasing peptide. GHS. : Growth hormone secretagogue. HPLC. : High performance liquid chromatography. IEF–PAGE. : Isoelectric focusing–polyacrylamide gel electrophoresis. IGF-1. : Insulin-like growth factor-1. I.S.. : Internal standard. LC–MS. : Liquid chromatography mass spectrometry. LOD. : Limit-of-detection. LOQ. : Limit-of-quantification. MRM. : Multiple reaction monitoring. MS/MS. : Tandem mass spectrometry. MW. : Molecular weight. PBS. : Phosphate buffered saline. PCR. : Polymerase chain reaction. rEPO. : Recombinant erythropoietin. rhGH. : Recombinant human growth hormone. SDS–PAGE. : Sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis.
(6) SIM. : Selected ion monitoring. T/E. : Testosterone to Epitestosterone ratio. TFA. : Trifluoroacetic acid. TOF–MS. : Time-of-flight mass spectrometry. tR. : Retention time. UGT. : Uridine diphospho-glucuronosyltransferase. UPLC. : Ultra performance liquid chromatography. WADA. : World Anti-Doping Agency.
(7) 緒論 人類の歴史が始まって以来、薬物は疾病の治療、診断、予防、健康の維持に使用さ れ、人類の健康に大きく貢献している。一方で、ストレスからの解放のようなレクリ エーション目的での薬物乱用は、大麻・覚せい剤等に代表されるように世界的な広が りを見せ、一般社会においても深刻な問題となっている。さらに、スポーツにおける 競 技 力 向 上 を 意 図 し た 競 技 者 に よ る 薬 物 不 正 使 用 、い わ ゆ る ド ー ピ ン グ（ Doping）は 、 勝利至上主義、名誉、金銭的な報酬などと相まって、近年では、トップアスリートに まで広がりを見せている。ドーピング問題は一般青少年への拡大も懸念されるなど、 今やパブリックヘルスにおける大きな社会問題の一つとなっている。ドーピングは、 オリンピック精神の真髄でもある倫理観やフェアプレーといったスポーツ精神に根本 的に反するものである. 1). 。. ド ー プ（ Dope）と い う 言 葉 の 語 源 は 、ア フ リ カ 東 南 部 の 原 住 民 カ フ ィ ー ル 族 が 祭 礼 の 際 に 飲 む 強 い 酒 で あ る 。Dope と い う 単 語 が 初 め て 辞 書 に 載 っ た の は 1889 年 で あ る 。 競走馬に与えられるアヘンと麻薬の混合物と記載されているように、ドーピングは、 当 初 は 、競 走 馬 や 競 争 犬 に 対 す る 薬 物 使 用 で あ っ た 。19 世 紀 後 半 に な る と ド ー ピ ン グ は人間におけるスポーツ界にも広まった. 2). 。1865 年 の ア ム ス テ ル ダ ム 運 河 に お け る 水. 泳 競 技 者 の 薬 物 使 用 が 競 技 ス ポ ー ツ に お け る 最 初 と さ れ て い る 。1879 年 の 自 転 車 競 技 で は 、カ フ ェ イ ン や ニ ト ロ グ リ セ リ ン が 使 用 さ れ た 。そ の 後 、1886 年 の 自 転 車 競 技 で は、ドーピングにより競技中に競技者が死亡する事故が発生した。このような事態を 憂 慮 し た 医 師 た ち が 、医 学 的 、道 徳 的 立 場 か ら ド ー ピ ン グ 反 対 の 声 明 を 1933 年 に 出 す に 至 っ た 。1965 年 に は 、フ ラ ン ス 、ベ ル ギ ー 、イ タ リ ア な ど 欧 州 諸 国 で ド ー ピ ン グ 防 止法が整備され、スポーツにおけるドーピング検査の必要性が高まった。ドーピング を 防 止 す る 活 動 は 、 ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 活 動 （ Anti-doping Movement） と 呼 ば れ 、 そ の目標は、スポーツ固有の価値を保護することである。ここ十数年のアンチ・ドーピ ン グ 活 動 の 変 遷 を Table 1 に 示 し た 。 Table 1. Recent anti-doping activities Year. Event. 1999. World Anti-Doping Agency (WADA) founded. 2001. Japan Anti-Doping Agency (JADA) founded. 2003. World Anti-Doping Code (WADC) issued. 2005. The International Convention against Doping in Sport adopted by the UNESCO. 2006. Japanese government ratified the UNESCO International Convention. 2009. Sports pharmacist system implemented by JADA. 2011. Basic Sport Law came into effect. 1.
(8) 20 世 紀 ま で は 、 競 技 団 体 や 国 に よ り ド ー ピ ン グ 対 策 や ル ー ル が 異 な っ て い た が 、 1999 年 に 、国 際 レ ベ ル の あ ら ゆ る ス ポ ー ツ に お け る ア ン チ・ド ー ピ ン グ 活 動 を 促 進 し 、 調 整 す る こ と を 目 的 と し て 、世 界 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 機 構（ World Anti-Doping Agency: WADA）が 設 立 さ れ た 。2001 年 に は 、日 本 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 機 構（ Japan Anti-Doping Agency: JADA）が 設 立 さ れ 、日 本 国 内 の ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 体 制 が 整 備 さ れ た 。2003 年 に 、世 界 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 規 程（ World Anti-Doping Code: WADC）が 制 定 さ れ. 1). 、. ドーピング防止に関する世界統一の規程の下、調和したアンチ・ドーピング活動が開 始 さ れ る に 至 っ た 。 さ ら に 、 2005 年 に 、 第 33 回 国 際 連 合 教 育 科 学 文 化 機 関 （ ユ ネ ス コ ）総 会 に お い て 、 「 ス ポ ー ツ に お け る ド ー ピ ン グ 防 止 に 関 す る 国 際 規 約 」が 採 択 さ れ 、 ア ン チ・ド ー ピ ン グ 活 動 は 各 国 政 府 の 責 務 と さ れ た 。2006 年 に は 、日 本 国 政 府 も 同 規 約 を 締 結 し た 。2011 年 に 、ス ポ ー ツ 基 本 法 が 制 定 さ れ 、そ の 中 で 、ス ポ ー ツ は 世 界 共 通の人類の文化であると位置づけられ、ドーピング検査、アンチ・ドーピングに関す る教育および啓発、その他のアンチ・ドーピング活動の実施に係る施策の推進は、国 の責務であることが明記されるに至った。 競技者の尿試料もしくは血液試料からのドーピング禁止物質の検出、いわゆるドー ピング検査における検体分析は、アンチ・ドーピング活動の中で重要な位置を占めて い る 。オ リ ン ピ ッ ク に お い て は 、1968 年 の グ ル ノ ー ブ ル 大 会 か ら ド ー ピ ン グ 防 止 規 則 が適用され、ドーピング検査が開始された。当時の禁止物質は、アンフェタミンやス トリキニーネといった興奮剤、モルヒネなどの麻薬、ジエチルエーテルなどであった が 、 2014 年 に は 、 約 300 種 類 以 上 の 禁 止 物 質 が 指 定 さ れ て い る （ Table 2） 3) 。 WADC で は 、 禁 止 物 質 は 、 1)競 技 力 向 上 、 2)健 康 上 の 危 険 性 、 3)ス ポ ー ツ 精 神 に 反 す る 、 と いう 3 つの要件のうち 2 つを満たすと判断された場合に収載され、リストは毎年更新 されている。. 2.
(9) Table 2. 2014 WADA prohibited list（ extract） 3) Prohibited substances Substances prohibited at all times S0. Non-Approved Substances S1. Anabolic Agents 1. Anabolic Androgenic Steroids (AAS) a. Exogenous AAS b. Endogenous AAS when administered exogenously 2. Other Anabolic Agents S2. Peptide Hormones, Growth Factors and Related Substances Chorionic Gonadotrophin (CG) and Luteinizing Hormone (LH) and their releasing factors, in males Corticotrophins and their releasing factors Growth Hormone (GH) and its releasing factors and Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) Growth factors S3. Beta-2 Agonists S4. Hormone and Metabolic Modulators 1. Aromatase inhibitors 2. Selective estrogen receptor modulators (SERMs) 3. Other anti-estrogenic substances 4. Agents modifying myostatin function 5. Metabolic modulators Insulins Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ (PPARδ) agonists (e.g. GW 1516), PPARδ-AMP-activated protein kinase (AMPK) axis agonists (e.g. AICAR) S5. Diuretics and Other Masking Agents Substances prohibited in-competition S6. Stimulants a: Non-Specified Stimulants b: Specified Stimulants S7. Narcotics S8. Cannabinoids S9. Glucocortisteroids Substances Prohibited In Particular Sports P1. Alcohol P2. Beta-Blockers Prohibited methods M1. Manipulation of Blood and Blood Components 1. The administration or reintroduction of any quantity of autologous, allogenic (homologous) or heterologous blood or red blood cell products of any origin into the circulatory system. 2. Artificially enhancing the uptake, transport or delivery of oxygen, including, but not limited to, perfluorochemicals, efaproxiral (RSR13) and modified haemoglobin products (e.g. haemoglobin-based blood substitutes, microencapsulated haemoglobin products), excluding supplemental oxygen. 3. Any form of intravascular manipulation of the blood or blood components by physical or chemical means. M2. Chemical and Physical Manipulation 1. Tampering, or attempting to tamper, in order to alter the integrity and validity of Samples collected during Doping Control. These include but are not limited to urine substitution and/or adulteration (e.g. proteases). 2. Intravenous infusions and/or injections of more than 50 mL per 6 hour period except for those legitimately received in the course of hospital admissions or clinical investigations. M3. Gene Doping 1. The transfer of polymers of nucleic acids or nucleic acid analogues 2. The use of normal or genetically modified cells.. 3.
(10) 禁 止 物 質 の 分 析 は 、世 界 32 箇 所（ 2014 年 1 月 現 在 ）の WADA 認 定 試 験 所 で の み 実 施 さ れ る 。日 本 国 内 に お い て は 、著 者 の 所 属 す る 三 菱 化 学 メ デ ィ エ ン ス 株 式 会 社（ 2014 年 4 月 よ り 株 式 会 社 LSI メ デ ィ エ ン ス に 社 名 変 更 , WADA Tokyo laboratory） が 唯 一 の WADA 認 定 試 験 所 で あ り 、1985 年 以 来 、国 内 外 の ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る 検 体 分 析 を 担 っ て い る 。 Figure 1 に は 、 WADA Tokyo laboratory で 実 施 し て い る ド ー ピ ン グ 検 査 に おける検体分析法を示した. 4). 。ドーピング検査においては、最も信頼性の高い分析法. として質量分析を用いているが、質量分析法が確立されていないタンパク質・ペプチ ドホルモン類に関しては、イムノアッセイなどを用いている。. Urine solid phase extraction. Blood immunoaffinity digestion. hydrolysis. digestion. liquid-liquid extraction HPLC purification derivatization. derivatization. GC-IRMS. GC-MS/MS. LC-MS/MS. stimulants, narcotics. ELISA, IEF-PAGE, SDS-PAGE EPO, hCG, LH. Insulin. anabolic, diuretics. LC-MS/MS O2 carrier. Flowcyotmetry. Blood parameters. GH. testosterone beta-blockers corticosteroids. Figure 1. Analytical procedure for sports doping test 4 ) .. 2008 年 か ら 2012 年 の WADA の 統 計. 5). によると、ドーピング検査における検出物質. の 50.6− 64.9%は 、 タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン で あ り 、 筋 肉 増 強 効 果 を 期 待 す るドーピングが最も多い。創薬の分野では、遺伝子組換え、クローニングおよび化学 合成などを用いたタンパク質・ペプチド製剤の開発の進歩は目覚しいものがある。し かし、それらが大きく医療に貢献する一方、競技者によるドーピング目的による使用 も 懸 念 さ れ る 。ペ プ チ ド ホ ル モ ン の 検 出 例 は 、2008 年 か ら 2012 年 の WADA の 統 計 に よ る と 、1.6− 4.0%で あ る が 、こ れ は 使 用 例 が 少 な い と い う よ り も 検 査 体 制 が い ま だ 不 十分ともいえる。実際、自転車競技のような持久力系競技において、酸素運搬能の向 上 を 期 待 す る エ リ ス ロ ポ エ チ ン（ Erythropoietin: EPO）の 使 用 は 、マ ス コ ミ で も 大 き く 取りあげられるなど大きな社会問題となっている。 ドーピング検査においては、元来生体内には存在しない興奮薬や利尿薬などは、検 出されたことをもってドーピングと判定することが可能である。筋肉増強作用を有す 4.
(11) る タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン 、 成 長 ホ ル モ ン （ Growth hormone: GH） に 代 表 さ れる成長促進因子および持久力向上を期待する造血ホルモンの使用を検出することは 困難を伴う。その最大の理由としては、ホルモン製剤の場合は単に検出するだけでは なく、生体内にあるホルモンと摂取されたホルモン製剤とを識別する必要があること が 挙 げ ら れ る 。実 際 、2012 年 の タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 検 出 例 の 中 で も テ ス ト ス テ ロ ン （ 17β-Hydroxy-4-androsten-3-one: Testosterone） が 依 然 と し て 最 も 多 い の は. 5). 、検出された場合に、競技者側が裁判などを通じて言い逃れる可能性があること. を熟知しているためと考えられる。 こうした背景を踏まえ、著者は 3 つのホルモンドーピングすなわち、タンパク同化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン 、 GH お よ び 造 血 ホ ル モ ン に 焦 点 を 当 て 、 そ の ド ー ピ ン グ 検 査 を 有効なものとするべく研究を行った。 第 1 章 で は 、 タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 一 つ で あ る Testosterone 製 剤 の ド ーピング検査における妥当性について検討した。競技者による筋肉増強効果を意図し たタンパク同化ステロイドホルモン製剤の不正使用は、数十年来スポーツにおける重 大な懸案事項となっている。タンパク同化ステロイドホルモンによるドーピング検査 に お け る 課 題 は 、Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 の 、外 因 性 と 内 因 性 の 異 同 識 別 で あ る 。 Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ を 検 知 す る た め に 、 WADA は 一 次 ス ク リ ー ニ ング検査における世界共通の判断基準（閾値）を設けているが、内因性ステロイドホ ルモン等の尿中排泄については、黄色人種（モンゴロイド）と白色人種（コーカソイ ド）とでは大きく異なる可能性があり、その基準を見直すべきであるとの議論がなさ れてきた。そこで、日本人競技者に対して、より実効性あるドーピング検査を実施す る た め に 、 日 本 人 ス ポ ー ツ 競 技 者 の Testosterone の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 関 与 す る 遺 伝 子多型および内因性ステロイドホルモンの尿プロファイルの検討を行った。さらに、 こ れ ま で 実 施 例 が ほ と ん ど 無 か っ た 女 性 に 対 す る Testosterone 製 剤 の 投 与 試 験 を 実 施 し た 。投 与 前 後 の 尿 試 料 を 現 行 の WADA 承 認 試 験 法 に よ り 分 析 し 、そ の 妥 当 性 を 検 討 した。 第 2 章 で は 、 GH 放 出 ペ プ チ ド -2（ Growth hormone releasing peptide-2: GHRP-2） の ド ー ピ ン グ 検 査 法 を 開 発 す る こ と を 主 目 的 と し た 。 GHRP-2 は GH 分 泌 不 全 症 の 診 断 薬として日本国内で使用されている. 6 ,7 ). 。一 方 、イ ン タ ー ネ ッ ト 上 で は GHRP-2 を 含 有. するサプリメントが販売されており、誰もが容易に入手可能な状態になっている. 8,9). 。. 故 に 、 競 技 者 に よ り GHRP-2 が 乱 用 さ れ て い る 可 能 性 が 懸 念 さ れ る 。 ま ず 、 遺 伝 子 組 換 え GH（ Recombinant human GH: rhGH）の 投 与 試 験 を 実 施 し 、WADA が 承 認 し た rhGH の ド ー ピ ン グ 検 査 法 「 GH isoform differential immunoassay」 の 妥 当 性 を 検 討 し た 。 次 に 、 GHRP-2 の 投 与 試 験 を 行 い 、「 GH isoform differential immunoassay」 に よ る 検 出 可 否 に つ い て 検 討 し た 。 ま た 、 GHRP-2 と rhGH の 併 用 使 用 が 、「 GH isoform differential immunoassay」法 へ ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す か に つ い て も 検 討 し た 。さ ら に 、ヒ ト 尿 中 GHRP-2 お よ び そ の 代 謝 物 を 、質 量 分 析 に よ り 直 接 的 に 検 出 す る 手 法 の 開 発 を 行 っ た 。 5.
(12) 第 3 章 で は 、 造 血 ホ ル モ ン の 一 つ で あ る EPO 製 剤 ダ ル ベ ポ エ チ ン ア ル フ ァ （ Darbepoetin alfa） の 質 量 分 析 に よ る ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 を 行 っ た 。 1989 年 に 、 Amgen（ Thousand Oaks, CA, USA） が 遺 伝 子 組 換 え 技 術 に よ り EPO 製 剤 を 開 発 し た こ とは、腎性貧血治療の領域に大きな貢献となった。一方で、スポーツ競技の世界にお いて、酸素運搬能を向上させる目的で長距離自転車競技者によるドーピング行為へと つ な が る 結 果 と な っ た 。 Table 3 に 、 WADA 認 定 試 験 所 で の EPO 関 連 物 質 の 検 出 数 を 示した. 5). 。 Table 3. The number of analytical findings of EPOs 5 ) Year. Epoetins. Darbepoetin alfa. PEG-EPO (Mircera). 2002. －. 3. －. 2003. 51. 7. －. 2004. 38. 0. －. 2005. 15. 1. －. 2006. 17. 1. －. 2007. 22. 2. －. 2008. 51. 2. 5. 2009. 56. 4. 8. 2010. 36. 8. 1. 2011. 43. 5. －. こ の よ う に 、EPO 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ は 、後 を 絶 た た な い 状 況 で あ る 。現 在 、WADA が 承 認 し た EPO ド ー ピ ン グ を 直 接 的 に 検 出 す る 方 法 は 、 電 気 泳 動 法 で あ り. 10 ). 、熟練. し た 手 技 が 必 要 で 、検 査 に は 3 日 間 の 工 程 を 要 す る 。ド ー ピ ン グ 検 査 や 法 医 鑑 定 で は 、 最 も 信 頼 性 の 高 い 分 析 法 は 質 量 分 析 で あ る 。し か し な が ら 、EPO 製 剤 の 質 量 分 析 に よ るドーピング検査法はいまだ開発されていない。そこで、本章では、タンパク質の酵 素 消 化 後 に 得 ら れ る ペ プ チ ド 断 片 を 測 定 す る Bottom-up 法 に よ り 、天 然 型 EPO の 構 造 を 改 変 し た EPO 製 剤 Darbepoetin alfa の 質 量 分 析 法 の 開 発 を 行 っ た 。. 6.
(13) 第１章. 日本人におけるテストステロンドーピング検査の妥当性検証と改. 良 1.1. 序論. Testosterone 製 剤 は 、男 子 性 腺 機 能 不 全 や 再 生 不 良 性 貧 血 の 治 療 の た め に 、広 く 臨 床 で使用されている医薬品である。しかしながら、スポーツ競技者による筋肉増強効果 を意図した乱用は、数十年間スポーツにおける重大な問題になっている。 1979 年 に 、 Baba ら は 免 疫 放 射 定 量 法 （ immunoradiometric assay: IRMA） に か わ り 、 安 定 同 位 体 希 釈 法 を 用 い た ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 質 量 分 析 法 （ gas chromatography mass spectrometry: GC–MS） に よ り 血 漿 お よ び 尿 中 の 微 量 Testosterone を 選 択 的 に 測 定 す る こ と を 可 能 と し 、 Testosterone 製 剤 の 薬 物 動 態 研 究 に 画 期 的 な 進 歩 を も た ら し た 11, 12 ). 。 一 方 、 内 因 性 の Testosterone と 医 薬 品 製 剤 由 来 の Testosterone は 、 そ の 分 子 量. （ molecular weight: MW）と 分 子 組 成 は 同 一 で あ る（ C 1 9 H 28 O 2 , MW = 288.4）。そ の た め 、 両 者 の 由 来 を GC–MS に よ る 質 量 ス ペ ク ト ル を も と に 識 別 す る こ と は 困 難 で あ る 。 Donike ら は 、 Testosterone 製 剤 の 投 与 に よ り 尿 中 の Testosterone 濃 度 が 上 昇 し 、 逆 に 、 そ の 異 性 体 エ ピ テ ス ト ス テ ロ ン（ 17α-Hydroxy-4-androsten-3-one, Epitestosterone）が 抑 制 さ れ る こ と に 着 目 し 、 尿 中 の Testosterone の グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 体 （ glucuronide） と Epitestosterone の glucuronide の ア グ リ コ ン 比 率 （ Testosterone to Epitestosterone ratio: T/E） を GC–MS に よ り 測 定 し 、 T/E の 上 昇 を 捉 え る こ と で Testosterone 製 剤 に よ る ド ーピングが検知可能であることを報告した. 13 ). 。国 際 オ リ ン ピ ッ ク 委 員 会（ International. Olympic Committee: IOC）は 、1982 年 に Donike ら に よ っ て 統 計 学 的 に 算 出 さ れ た T/E>6 を Testosterone ド ー ピ ン グ の 判 定 閾 値 に 設 定 し た 。 そ の 後 、 先 天 的 に 高 い T/E を 有 し た競技者が存在する事例が報告されるようになった. 14 -17 ). 。そ の た め 、ド ー ピ ン グ 検 査. に お い て T/E が 高 値 を 示 し た 場 合 に は 、 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果 （ adverse analytical finding: AAF）と 判 定 す る 前 に 、そ れ が 生 理 的 も し く は 病 的 な も の に 起 因 し て い る 可 能 性についての追跡調査を行うことが必要となった。 1994 年 に は 、 Becchi ら が 、 尿 中 Testosterone の 起 源 を 識 別 可 能 と す る ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 同 位 体 比 質 量 分 析 法 （ gas chromatography isotope ratio mass spectrometry: GC–IRMS） に よ る 革 新 的 な 技 術 を 開 発 し た. 18 ). 。炭素の天然同位体比. 12. C:. 13. C は、お. よ そ 99:1 で あ り 、海 水 中 炭 酸 や 空 気 中 炭 酸 ガ ス の そ れ ら は ほ ぼ 一 定 の 値 を 示 す 。し か し、陸上の固体成分では食物連鎖や炭酸同化作用の過程に起こる同位体効果により、 由 来 ご と に 特 徴 的 な 炭 素 同 位 体 比 （ carbon isotope ratio: CIR） を 示 す. 19 ). 。 CIR は 、 国. 際 標 準 物 質 （ 米 国 南 カ ロ ラ イ ナ 州 の Pee Dee 層 か ら 産 出 し た ベ レ ム ナ イ ト 化 石 : PDB） からの. 13. C 含 量 の 千 分 率 偏 差 （ δ 1 3 C ‰)で 表 さ れ る 。 生 体 内 で 合 成 さ れ た Testosterone. と 化 学 合 成 さ れ た Testosterone 製 剤 で は 、 炭 素 源 が 異 な り 、 同 位 体 分 別 （ isotopic fractionation） に よ り 両 者 の CIR は 異 な る 。 す な わ ち 、 医 薬 品 等 の 化 学 合 成 し た 7.
(14) Testosterone 製 剤 の 原 料 は 植 物 ス テ ロ ー ル で あ り 、 そ の δ 1 3 C 値 は –30‰ 近 辺 で あ る の に 対 し 、生 体 内 の そ れ は –20‰ 近 辺 を 示 す 。GC–IRMS 分 析 に よ り 、尿 試 料 中 の Testosterone お よ び そ の 代 謝 関 連 ス テ ロ イ ド の CIR を 測 定 す る こ と に よ り 、 Testosterone 製 剤 に よ るドーピングを直接的に検知することが可能である。しかし、この技術は分析に時間 を要し、高コストであることから、ドーピング検査において多数の尿試料を測定する こ と は 難 し い の が 現 状 で あ る 。 WADA は 2005 年 に 、 Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ の 検 出 率 を 改 善 す る た め に 、T/E の 閾 値 を 6 か ら 4 に 引 き 下 げ た 。現 在 、WADA は 、 T/E > 4 を 示 し た 場 合 に は 、 追 跡 調 査 も し く は WADA 認 定 試 験 所 に よ る GC–IRMS 分 析 の実施を必須と規定している. 20 ). 。 ま た 、 T/E に よ る ア プ ロ ー チ に 加 え て 、 尿 中 ス テ ロ. イ ド の glucuronide の 濃 度 、す な わ ち 、Testosterone お よ び Epitestosterone > 200 ng/mL、 Androsterone（ A） > 10000 ng/mL、 Etiocholanolone（ Et） > 10000 ng/mL お よ び Dehydroepiandrosterone（ DHEA）>100 ng/mL の 閾 値 を 超 え た 場 合 に も 、GC–IRMS 分 析 を実施することと規定されている. 20 ). 。. ア ジ ア 圏 の 競 技 者 の 尿 中 の T/E は 、 欧 米 圏 の コ ー カ サ ス 人 種 の そ れ よ り も 顕 著 に 低 値であることが報告された. 21 -24 ). 。す な わ ち 、尿 中 の T/E は 人 種 に よ り 差 が あ る こ と が. 示 唆 さ れ た 。 ヒ ト に お い て 、 Testosterone お よ び そ の 第 I 相 代 謝 物 は 、 uridine diphospho-glucuronosyltransferase（ UGT）に よ っ て グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 を 受 け 、尿 中 に 第 II 相 代 謝 物 と し て 排 泄 さ れ る. 25 ,2 6). 。 代 謝 経 路 を Figure 1-1 に 示 し た よ う に 、 グ ル ク ロ. ン 酸 抱 合 に は 、UGT 遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー の う ち フ ァ ミ リ ー 2（ UGT2）に 属 す る 酵 素 が 関 与 し て お り 、Testosterone は 、主 に UGT2B17、わ ず か に UGT2B15 に よ り 抱 合 を 受 け る 27). 。そ れ に 対 し て 、Epitestosterone は 、主 に UGT2B7 に よ り 、抱 合 を 受 け る. ら は 、 UGT2B17 遺 伝 子 多 型 （ gene polymorphism） に つ い て 報 告 し た. 31 ). 28 -30 ). 。Wilson. 。 UGT2B17 に. は 一 塩 基 多 型 が あ り 、 ホ モ 接 合 型 挿 入 （ homozygous insertion: ins/ins）、 ホ モ 接 合 型 欠 失 （ homozygous deletion: del/del） お よ び ヘ テ ロ 型 （ heterozygous: del/ins） が あ り 、 ア フリカ系アメリカ人とコーカサス人種との間ではそれらの頻度が異なることを明らか に し た 。 さ ら に 、 Jakobsson ら は 、 UGT2B17 del/del 遺 伝 子 型 が 韓 国 人 男 性 で は ス ウ ェ ーデン人男性のそれよりも 7 倍の頻度であることを報告した. 32 ). 。 Jakobsson ら は 、. Testosterone enanthate 500 mg を del/del 型 の コ ー カ サ ス 人 男 性 被 験 者 に 筋 肉 内 投 与 し た と こ ろ 、そ の 40%の 被 験 者 は T/E が WADA の 設 定 し た 閾 値 4 に 到 達 し な か っ た の に 対 し て 、ins/ins お よ び del/ins 型 被 験 者 に お い て は T/E が 閾 値 4 に 到 達 し た こ と を 報 告 し た. 33 ). 。こ の よ う に 、人 種 差 や 遺 伝 子 多 型 に よ り 内 因 性 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 尿 中 排 泄. は 大 き く 異 な る 可 能 性 が あ り 、そ の 基 準 を 見 直 す べ き で あ る と の 議 論 が な さ れ て き た 。 著 者 の 知 る 限 り に お い て は 、 日 本 人 ス ポ ー ツ 競 技 者 に お け る UGT2B17 遺 伝 子 解 析 お よ び UGT2B17 遺 伝 子 型 別 に 、 Testosterone 製 剤 を 使 用 し た 場 合 の 尿 中 ス テ ロ イ ド 濃 度 や T/E な ど の ス テ ロ イ ド プ ロ フ ァ イ ル （ steroid profile） に 対 す る 影 響 に つ い て の 報 告 は 無 い 。 さ ら に 、 Testosterone 製 剤 の 投 与 に よ る steroid profile へ の 影 響 に 関 す る 報 告 は、男性での報告と比較して女性での報告はほとんど無い。本章では、日本人競技者 8.
(15) か ら 尿 試 料 お よ び 血 液 試 料 を 採 取 し 、 UGT2B17 遺 伝 子 型 お よ び 尿 中 の steroid profile に 関 し て 検 討 し た 。 ま た 、 非 競 技 者 で あ る 日 本 人 女 性 に 対 し て UGT2B17 遺 伝 子 型 別 に 少 量 の Testosterone enanthate を 筋 肉 内 投 与 し 、 投 与 前 後 の 尿 試 料 を 採 取 し た 。 尿 中 の steroid profile お よ び 尿 中 ス テ ロ イ ド の CIR 測 定 を 行 い 、現 行 の Testosterone ド ー ピ ング検査法の妥当性について検討した。. Figure 1-1. Metabolic pathway of testosterone and the related steroids 2 5-30) . 9.
(16) 1.2 1.2.1. 実験の部 試薬および材料. β-グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ（ Escherichia coli K12）溶 液 は Roche Diagnostics GmbH （ Mannheim, Germany） か ら 購 入 し た 。 N-メ チ ル -N-ト リ メ チ ル シ リ ル ト リ フ ル オ ロ ア セ タ ミ ド （ MSTFA）は Marcherey-Nagel（ Duren, Germany）か ら 購 入 し た 。ヨ ウ 化 ア ン モ ニ ウ ム （ NH 4 I） は Sigma（ St. Louis, MO, USA） か ら 購 入 し た 。 エ タ ン チ オ ー ル お よ び tertブ チ ル メ チ ル エ ー テ ル （ tert-butyl methyl ether: MTBE） は 和 光 純 薬 （ Osaka, Japan） か ら 購 入 し た 。 乾 燥 ピ リ ジ ン は Merck（ Darmstadt, Germany） か ら 購 入 し た 。 蒸 留 水 は Milli-Q ultra pure system（ Millipore, Bedford, MA, USA） に よ り 製 造 し た も の を 使 用 し た 。固 相 抽 出 用 カ ー ト リ ッ ジ（ Bond Elut LRC-C18, 500 mg）は Varian（ Lake Forest, CA, USA） か ら 購 入 し た 。 QIAamp ® DNA Mini Kit は キ ア ゲ ン （ Tokyo, Japan） よ り 購 入 し た 。 TaKaRa Ex Taq ® Hot Start Version は タ カ ラ バ イ オ （ Shiga, Japan） か ら 購 入 し た 。 DNA-2500 Reagent Kit は 島 津 製 作 所（ Kyoto, Japan）か ら 購 入 し た 。pGEM ® DNA Marker は プ ロ メ ガ （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス 、 BigDye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit、 SYBR ® Gold nucleic acid gel stain お よ び DEPC treated water は ラ イ フ テ ク ノ ロ ジ ー ズ （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応（ polymerase chain reaction: PCR）用 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス の 構 成 は 以 下 に示した。 ・ UGT2B15 specific primers（ marker G） forward（ 5′ -CCTGGAAGAGCTTGTTCAGA-3′） reverse（ 5′ -CTGCCAGAATGACATCAAAC-3′） ・ UGT2B17 specific primers（ marker D） forward（ 5′ -TCACAAGTCAATCTCCCATCC-3′） reverse（ 5′ -CTGCAGAATATGTCAATAATTGGC-3′） ・ UGT2B17 deletion specific primer（ marker J） forward（ 5′ -TGCACAGAGTTAAGAAATGGAGAGATGTG-3′） reverse（ 5′ -GATCATCCTATATCCTGACAGAATTCTTTTG-3′） Epitestosterone、 Androsterone（ A） お よ び 17α-Methyltestosterone（ MT） は Sigma か ら 購 入 し た 。Etiocholanolone（ Et）お よ び 5α-androstan-3β-ol は Steraloids（ Newport, RI, USA） か ら 購 入 し た 。 Testosterone、 DHEA、 5α-androstan-3α,17β-diol（ 5α-diol）、 5β-androstan-3α,17β-diol（ 5β-diol）、 [16,16,17- 2 H 3 ]Testosterone（ d 3 -T）、 [16,16,17- 2 H 3 ]Epitestosterone（ d 3 -E）、 [2,2,3,4,4- 2 H 5 ]Et（ d 5 -Et）、 [16,16,17- 2 H 3 ]5α-diol （ d 3 -5α-diol）、 [2,2,3,4,4- 2 H 5 ]5β-diol（ d 5 -5β-diol） お よ び [2,2,4,4- 2 H 4 ]A-β-glucuronide （ d 4 -A-g） は National Measurement Institute（ New South Wales Pymbel, Australia） か ら 購 入 し た 。Pregnanediol（ Pdiol）は Merck か ら 購 入 し た 。 [2,2,3,4,4,6- 2 H 6 ]DHEA（ d 6 -DHEA） は Isotec（ Miamisburg, OH, USA） か ら 購 入 し た 。 Testosterone propionate は 東 京 化 成 10.
(17) （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 尿 中 ス テ ロ イ ド 定 量 用 の 内 部 標 準 物 質 （ internal standard: I.S.）は エ タ ノ ー ル 混 合 溶 液 と し 、MT、d 3 -T、d 3 -E、d 5 -Et、d 3 -5α-diol、d 5 -5β-diol、 d 4 -A-g お よ び d 6 -DHEA の 濃 度 は 、 4.1、 7.2、 1.9、 9.2、 3.7、 3.6、 7.9 お よ び 6.5 μg/mL に そ れ ぞ れ 調 製 し た 。 投 与 試 験 に 用 い た 注 射 用 製 剤 エ ナ ル モ ン デ ポ ー ® （ Testosterone enanthate, 100 mg 注 射 液 ） は 、 あ す か 製 薬 （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し た 。 そ の 他 の 試 薬はすべて分析用もしくは特級グレード以上のものを使用した。 1.2.2. GC–MS に よ る 尿 中 の steroid profile の 分 析. ドーピング検査における一般的な尿試料の前処理を行った. 34 , 35 ). 。要 約 す る と 、3 mL. の 尿 試 料 に 0.75 mL の 0.8 M リ ン 酸 緩 衝 液 （ phosphate buffered saline: PBS）（ pH 7.0）、 50 μL の 尿 中 ス テ ロ イ ド 定 量 用 I.S.の 混 合 溶 液 お よ び 50 μL の β-グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ （ Escherichia coli K12）溶 液 を 加 え 、50 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。0.5 mL の 20% K 2 CO 3 /KHCO 3 (1/1, w/w)水 溶 液 を 加 え て 塩 基 性（ pH 9.6）と し た 後 、5 mL の MTBE で 遊 離 型 ア グ リ コ ン（ ス テ ロ イ ド ）を 抽 出 し た 。溶 媒 を 窒 素 気 流 下 で 蒸 発 乾 固 し 、50 μL の MSTFA/NH 4 I/エ タ ン チ オ ー ル （ 1000/2/6, v/w/v)を 加 え 、 60 °C で 15 分 間 加 熱 し 、 ト リ メ チ ル シ リ ル（ TMS）誘 導 体 化 を 行 っ た（ Figure 1-2）。反 応 後 、そ の 2 μL を GC–MS システムへ注入した。. Figure 1-2. TMS derivatization of testosterone. GC–MS シ ス テ ム は 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 四 重 極 型 質 量 分 析 計 Agilent GC/5975 inert XL MSD（ Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）を 使 用 し た 。分 析 カ ラ ム は Agilent Ultra-1（ 17 m, 内 径 0.25 mm, 膜 厚 0.11 μm） を 用 い た 。 オ ー ブ ン 温 度 は 180 °C（ ホ ー ル ド 1 分 ）か ら 229 °C ま で 3 °C/分 で 昇 温 し 、さ ら に 300 °C ま で 40 °C/分 で 昇 温 し 、 3 分 間 保 持 し た 。キ ャ リ ア ガ ス は 定 圧 モ ー ド（ 12 psi）で ヘ リ ウ ム を 使 用 し た 。注 入 口 温 度 は 280 °C に 設 定 し 、 注 入 モ ー ド は ス プ リ ッ ト （ 11:1） と し た 。 イ ン タ ー フ ェ ー ス 温 度 は 300 °C に 設 定 し た 。イ オ ン 化 は 70 eV で 電 子 イ オ ン 化（ electron ionization: EI） と し 、 イ オ ン 源 温 度 は 230 °C に 設 定 し た 。 デ ー タ は す べ て 選 択 イ オ ン モ ニ タ リ ン グ （ selected ion monitoring: SIM） で 取 得 し た 。 尿 中 ス テ ロ イ ド の 定 量 は 、 WADA 認 定 試 験所で統一して用いられている 1 点検量線で安定同位体希釈質量分析により行った。 定 量 用 標 準 物 質 添 加 尿 試 料 か ら 得 ら れ た I.S.に 対 す る ピ ー ク 面 積 比 と 測 定 試 料 の ピ ー 11.
(18) ク面積比を比較して尿中濃度を算出した。ステロイド濃度は、グルクロン酸抱合体の 加水分解後のアグリコン濃度を表記した。定量用の標準物質添加尿試料のステロイド 濃 度 は 、 そ れ ぞ れ 、 Testosterone: 2.4 ng/mL（ 0.5− 16 ng/mL） も し く は 70 ng/mL（ >16 ng/mL）、Epitestosterone: 20 ng/mL、A: 1330 ng/mL、Et: 1330 ng/mL、5α-diol: 110 ng/mL、 5β-diol: 334 ng/mL お よ び DHEA: 104 ng/mL と し た 。 1.2.3. GC–IRMS に よ る 尿 中 ス テ ロ イ ド の 炭 素 同 位 体 比 測 定. ドーピング検査における一般的な尿試料の前処理を行った. 36 -3 8). 。要 約 す る と 、10–30. mL の 尿 試 料 を BondElut LRC-C 18（ CH 3 OH 6 mL お よ び 蒸 留 水 6 mL で 活 性 化 し た も の ） に 供 し て 、5 mL の 蒸 留 水 で 洗 浄 し 、3 mL の CH 3 OH で 固 相 抽 出 を 行 っ た 。抽 出 溶 媒 を 窒 素 気 流 下 、60 °C で 蒸 発 乾 固 し た 。1 mL の 0.2M PBS（ pH 7.0）を 加 え 、5 mL の ジ エ チ ル エ ー テ ル に よ り 遊 離 型 ス テ ロ イ ド を 除 去 し た 。 水 層 に 50 μL の β-グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ （ Escherichia coli K12） 溶 液 を 加 え 、 50 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。 遊 離 型 ア グ リ コ ン と し た 対 象 ス テ ロ イ ド は 、 25 mg の K 2 CO 3 を 加 え て 塩 基 性 （ pH 9.6） と し 、 5 mL の n-ペ ン タ ン に よ り 液 − 液 抽 出 し た 。 有 機 層 に 100 μL の Testosterone propionate エ タ ノ ー ル 溶 液（ 24 μg/mL）を 加 え 、窒 素 気 流 下 60 °C で 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 を 110 μL の 30% CH 3 CN で 再 溶 解 し 、高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ high performance liquid chromatography: HPLC） に よ る ス テ ロ イ ド の 分 画 分 取 用 試 料 と し た 。 HPLC シ ス テ ム は Alliance（ Waters, Milford, MA, USA）を 使 用 し 、カ ラ ム は CAPCELL PAK C 8 DD （ 150 mm × 2.0 mm, 粒 径 5 μm） を 資 生 堂 （ Tokyo, Japan） か ら 購 入 し て 使 用 し た 。 注 入 量 は 50 μL と し た 。 検 出 器 は 、 Waters 2998 Photodiode array を 用 い て 波 長 を 191 nm に 設 定 し た 。 移 動 相 に は 30% CH 3 CN（ 移 動 相 A） お よ び 100% CH 3 CN（ 移 動 相 B） を 使 用 し た 。 カ ラ ム 温 度 は 50 °C に 設 定 し 、 流 速 は 0.5 mL/分 で グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し た 。 グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 、 0% B か ら 20 分 で 50% B ま で リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 し 、 3 分 間 保 持 し た 。そ の 後 、3 分 で 0% B に 戻 し 、7 分 間 保 持 し て 移 動 相 初 期 条 件 で 平 衡 化 し た。以下のように、対象ステロイドを 5 つのフラクションに分画し、分取した。 フ ラ ク シ ョ ン I（ 6 分 − 7.4 分 ）. : Testosterone. フ ラ ク シ ョ ン II（ 7.4 分 − 8.1 分 ）. : DHEA. フ ラ ク シ ョ ン III（ 8.1 分 − 9.5 分 ）. : 5α-diol、 5β-diol お よ び Epitestosterone. フ ラ ク シ ョ ン IV（ 9.5 分 − 11.2 分 ）. : A お よ び Et. フ ラ ク シ ョ ン V（ 11.2 分 − 13.3 分 ）. : Pdiol. な お 、 回 収 す る 保 持 時 間 （ retention time: t R ） に つ い て は 標 準 物 質 の 分 析 を 行 い 、 適 宜 最 適 な 時 間 を 設 定 し た 。 I.S.と し て 加 え た Testosterone propionate の t R を 指 標 と し て 、 測 定 試 料 毎 の わ ず か な tR の 差 異 を 補 正 し て 分 取 し た 。. 12.
(19) 次 に 、 分 画 分 取 し た 各 フ ラ ク シ ョ ン に 、 GC–IRMS 測 定 用 の I.S.と し て 30 μL の 5α-androstan-3β-ol エ タ ノ ー ル 溶 液（ 100 μg/mL）を 添 加 し 、窒 素 気 流 下 、60 °C で 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 に 50 μL の 乾 燥 ピ リ ジ ン お よ び 100 μL の 無 水 酢 酸 を 加 え 、60 °C で 60 分 間 加 熱 し 、 ア セ チ ル 誘 導 体 化 を 行 っ た （ Figure 1-3）。 反 応 終 了 後 、 窒 素 気 流 下 室 温 で 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 に 30 μL の シ ク ロ ヘ キ サ ン を 添 加 し て 再 溶 解 し 、GC–IRMS に よ る CIR 測 定 用 試 料 と し た 。. Figure 1-3. Acetylation of 5α-androstan-3α,17β-diol. GC–IRMS シ ス テ ム は Agilent 7890A GC/Isoprime 安 定 同 位 体 比 質 量 分 析 計（ Isoprime Ltd., Cheadle, UK）を 使 用 し 、分 析 カ ラ ム は Agilent DB-17（ 30 m, 内 径 0.25 mm, 膜 厚 0.25 μm, 50% phenylmethylsilicone） を 用 い た 。 オ ー ブ ン 温 度 は 50 °C（ ホ ー ル ド 1 分 ） か ら 250 °C ま で 20 °C/分 で 昇 温 し 、 さ ら に 300 °C ま で 5 °C/分 で 昇 温 し 、 9 分 間 保 持 し た 。キ ャ リ ア ガ ス は 、定 流 速 モ ー ド（ 1 mL/分 ）で 超 高 純 度 ヘ リ ウ ム を 使 用 し た 。注 入 口 温 度 は 260 °C に 設 定 し 、注 入 モ ー ド は ス プ リ ッ ト レ ス と し た 。イ ン タ ー フ ェ ー ス 温 度 は 350 °C に 設 定 し た 。 酸 化 銅 が 充 填 さ れ た ガ ラ ス 燃 焼 管 は 850 °C に 設 定 し た 。 有 機 物 を 燃 焼 し て CO 2 ガ ス と し 、 生 成 し た H 2 O は 液 体 窒 素 に よ り −100°C に 冷 却 し て 除 去 し た 。 CO 2 ガ ス を 連 続 的 に 安 定 同 位 体 比 質 量 分 析 計 に 導 入 し 、 m/z 44（ 12 C 16 O 2 ） と m/z 45（ 13 C 16 O 2 ）の イ オ ン 測 定 を 行 っ た 。標 準 物 質 に 対 し て 校 正 さ れ た 標 準 CO 2 ガ ス と の 比 較 か ら 有 機 化 合 物 の CIR を 測 定 し た 。δ 13 C 値 測 定 用 の 標 準 CO 2 ガ ス は 、国 際 標 準 品 NBS-19 limestone （ IAEA の 供 給 す る CaCO 3 ）に 対 し て 校 正 し た も の を 使 用 し た 。 1.2.4. UGT2B17 遺 伝 子 解 析. UGT2B17 遺 伝 子 解 析 は Wilson ら の 方 法 に 従 っ て 実 施 し た. 31 ). 。要約すると、ヒト全. ®. 血 試 料 200 μL か ら ゲ ノ ム DNA を QIAamp DNA Mini Kit を 用 い て 抽 出 し た 。 ゲ ノ ム DNA 濃 度 は 、NanoDrop ® ND-1000 分 光 光 度 計（ NanoDrop Technologies, DE, USA）に よ り 吸 光 度 を 測 定 し て 算 出 し た（ 波 長 : 260 nm, 280 nm）。DNA 濃 度 に 応 じ て 、DEPC treated water に よ り 2 ng/μL に 希 釈 し た 。 プ ラ イ マ ー マ ス タ ー ミ ッ ク ス を 含 む ゲ ノ ム DNA サ ン プ ル （ 10 ng） は 、 GeneAmp ® PCR シ ス テ ム 9700（ ラ イ フ テ ク ノ ロ ジ ー ズ ） を 用 い て PCR 増 幅 し た 。PCR 増 幅 は 、94 °C 180 秒 で ホ ー ル ド し 、94 °C 20 秒 、60 °C 30 秒 、 72 °C 90 秒 を 30 サ イ ク ル 行 い 、 さ ら に 4 °C に ホ ー ル ド し た 。 得 ら れ た PCR 反 応 産 物 13.
(20) 5 μL を DNA ラ ダ ー 溶 液 （ pGEM ® DNA Markers） 11 μL と 共 に PCR チ ュ ー ブ に 採 り 、 96 ウ ェ ル プ レ ー ト の 各 セ ル 内 で 混 合 し た 。 SYBR ® Gold nucleic acid gel stain を 染 色 試 薬 に 用 い て 、 MultiNA MCE ® -202 マ イ ク ロ チ ッ プ 電 気 泳 動 シ ス テ ム （ 島 津 製 作 所 ） で UGT2B17 変 異 測 定 を 行 っ た 。 PCR 反 応 産 物 の シ ー ケ ン ス は 、 BigDye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit お よ び Applied Biosystem 3130xl Genetic Analyzer（ ラ イ フ テ ク ノ ロジーズ）により解析した。 1.2.5. 統計解析. 統 計 解 析 は エ ク セ ル 統 計 1.01 for Windows（ 社 会 情 報 サ ー ビ ス , Tokyo, Japan）を 使 用 し た 。 特 に 言 及 が な い 数 値 に つ い て は 、 す べ て 平 均 値 （ mean） ± 標 準 偏 差 （ standard deviation: SD n - 1 ） で 記 述 し た 。 分 布 の 正 規 性 は 、 コ ル モ ゴ ロ フ –ス ミ ル ノ フ 検 定 に よ り 確 認 し た 。 UGT2B17 ホ モ 接 合 型 欠 失 群 （ del/del） と そ の 他 （ del/ins + ins/ins） の 間 の 有 意 差 検 定 は 、ノ ン パ ラ メ ト リ ッ ク な マ ン –ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 を 用 い て 解 析 し た 。 日 本 人 に お け る 遺 伝 子 型 の 分 布 に つ い て の ハ ー デ ィ –ワ イ ン ベ ル ク 平 衡 へ の 適 合 性 は 、 ピ ア ソ ン の χ 2 検 定 （ χ 2 = 3.84, 有 意 水 準 5%, 自 由 度 = 1) に よ り 確 認 し た 。 男 女 差 お よ び 遺 伝 子 型 間 の 差 は 、 χ 2 検 定 を 使 用 し て 解 析 し た 。 Testosterone enanthate の 投 与 前 後 の 比 較 に は 、 ウ ィ ル コ ク ソ ン の 符 号 順 位 検 定 を 用 い た 。 本 章 で は 、 P < 0.05 を 統 計 学 的 有 意 差 あ り と し た 。ま た 、95%信 頼 区 間（ 95% CI, 2.5 th パ ー セ ン タ イ ル と 97.5 th パ ーセンタイル間) を基準範囲に設定した。 1.2.6. ヒト試料. 本章を含め本研究における医薬品のヒトへの投与試験については、厚生労働省の臨 床 研 究 に 関 す る 倫 理 指 針 「 平 成 20 年 7 月 31 日 改 訂 版 」 に 従 い 、 介 入 を 伴 う 医 学 研 究 としてヘルシンキ宣言に示された倫理規範を準拠した。薬剤投与試験については、臨 床試験実施医療機関（都内 2 施設）における倫理審査委員会の承認を得た。臨床試験 情 報 は 、（ 一 財 ） 日 本 医 薬 情 報 セ ン タ ー （ JAPIC） の デ ー タ ベ ー ス に 登 録 し 、 公 開 し た （ http://www.clinicaltrials.jp/user/cteSearch.jsp, JapicCTI No.: 090956, 101028, 101301, 101356, 111585 お よ び 111685）。国 内 の 2 箇 所 の 大 学 に お い て 実 施 し た 競 技 者 か ら の 試 料採取における倫理審査は、各大学において実施し、承認を得た。また、全ての研究 工程は、三菱化学メディエンス株式会社倫理委員会の承認を得た。なお、本研究の投 与試験の対象者には、競技者を含まないこととし、研究結果の悪用またはドーピング へ の 応 用 を 防 止 す る た め の 処 置 と し て 、全 て の 関 係 施 設 と は 守 秘 義 務 契 約 を 締 結 し た 。 試験に先立ち、すべての被験者に対して研究内容の詳細説明を実施し、被験者全員か ら 書 面 で の 同 意 書 を 得 た 。 UGT2B17 遺 伝 子 解 析 用 の 血 液 試 料 は 、 EDTA 採 血 管 に よ り 採 取 し た 。採 取 し た 尿 試 料 お よ び 血 液 試 料 は 分 析 に 供 す る ま で −20 °C に 保 管 し た 。安 全配慮のため、投与試験中はバイタルサイン（血圧, 体温, 脈拍数）を監視し、投与 試験前後では心拍数を測定し血液の一般臨床検査を行った。 14.
(21) 1.2.6.1. 日本人競技者. 男 性 被 験 者 群 と し て 、 競 技 ス ポ ー ツ を 行 う 255 名 の 日 本 人 男 子 大 学 生 （ 年 齢 : 20.3 ± 1.3 才 , ボ デ ィ マ ス 指 数 （ body mass index: BMI） : 23.3 ± 2.1） を 対 象 と し た 。 男 性 被 験者の競技種目は、陸上、サッカー、バスケットボール、野球、バレーボールおよび ダ ン ス ス ポ ー ツ で あ っ た 。 ま た 、 女 性 被 験 者 群 と し て は 、 競 技 ス ポ ー ツ を 行 う 256 名 の 日 本 人 女 子 大 学 生 （ 年 齢 ： 19.8 ± 0.9 才 , BMI: 21.8 ± 2.2） を 対 象 と し た 。 女 性 被 験 者の競技種目は、陸上、サッカー、バスケットボール、チアリーディング、バドミン トン、野球、バレーボール、スキー、ライフセービング、フェンシング、ラクロス、 ソフトテニス、ハンドボール、剣道、ゴルフ、体操、ダンススポーツであった。試料 採取前の食事の制限は特に実施しなかったが、試料採取 3 日前からアルコール、医薬 品 、 サ プ リ メ ン ト の 摂 取 を 不 可 と し た 。 採 血 お よ び 採 尿 は 、 午 前 9 時 か ら 午 後 12 時 30 分 の 間 に 実 施 し た 。 1.2.6.2. Testosterone enanthate の 女 性 へ の 単 回 筋 肉 内 投 与 試 験. 日 本 人 の 非 競 技 者 で あ る 42 名 の 日 本 人 女 性 が 、 無 作 為 公 募 に 対 し て 自 発 的 に 研 究 に 参 加 し た 。 UGT2B17 遺 伝 子 型 を 解 析 し た と こ ろ 、 28 名 が del/del 型 で あ り 13 名 が del/ins 型 で あ っ た 。 ins/ins 型 は 1 名 の み で あ っ た 。 準 ラ ン ダ ム 化 に よ る 被 験 者 選 択 （ quasi-randomized selection）と 健 康 診 断 の 結 果 、10 名 の 健 常 日 本 人 女 性（ 年 齢 : 21 – 38 才 , BMI: 21.3 ± 1.9） が 投 与 試 験 に 参 加 し た 。 投 与 試 験 参 加 被 験 者 の UGT2B17 遺 伝 子 型 の 内 訳 は 、6 名 が del/del 型（ subjects-02, -03, -04, -06, -08 お よ び -10）、3 名 が del/ins 型 （ subjects-01, -05 お よ び -07）、 1 名 が ins/ins 型 （ subject-09） で あ っ た 。 次 に 、 100 mg の Testosterone enanthate（ 遊 離 testosterone と し て は 72 mg） を 、 空 腹 時 に 10 名 の 被 験 者 に 筋 肉 内 注 射（ intramuscular injection）し た 。尿 試 料 は 、投 与 前（ pre）、 投 与 後 1、2、3、4、6、8–9、10–11、12–13 お よ び 15–16 日 に 採 取 し た 。試 料 採 取 前 の 食事の制限は特に実施しなかったが、投与試験期間中のアルコール、医薬品（特に経 口 避 妊 薬 お よ び フ ィ ナ ス テ リ ド な ど の 内 因 性 ス テ ロ イ ド 代 謝 に 影 響 を 及 ぼ す も の ）、サ プリメントの摂取および運動を不可とした。 1.3 1.3.1. 結果および考察 UGT2B17 遺 伝 子 解 析. 日 本 人 競 技 者 511 名 （ 255 名 の 男 性 お よ び 256 名 の 女 性 ） か ら 採 取 し た 血 液 試 料 を 用 い て 、UGT2B17 遺 伝 子 解 析 を 行 っ た 。PCR 反 応 産 物 の MultiNA MCE ® -202 に よ る 電 気 泳 動 像 の 例 を Figure 1-4 に 示 し た 。 一 般 に 、 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で は バ ン ド に 歪みが出ることがあるが、マイクロチップ電気泳動により分離能の高い電気泳動分析 が可能であった。. 15.
(22) UGT2B1 7 deletion n mark er J UGT2B15 5 marker G UGT2B17 7 marker D. di. dd. dd. dd. dd. dd. ii. dd. di. dd. di. dd. dd. dd. dd. di. Figure 11-4. Typica l electropho oresis data oof PCR pro ducts (dd: del/del, d di: del/ins, ii: ins/ins). (marker J: 884 bp, maarker G: 32 29 bp, marker D: 136 bbp) UGT2B 17 遺 伝 子 型 は 、3 つ の プ ラ イ マ ー（ markeer D、markeer J お よ び marker G） ）の PCR 増 幅 の 有 無 を 用 い て 判 定 し た 。 各 マ ー カ ー の 遺 伝 子 と の 位 置 関 係 を Figure 1-5 に 示 し た. 31 ). 。 UG GT2B17 (～150 0 kb). UG GT2B15. 3’. 5’ Exon 6. 5 4. 3 2 1. Exo on 6. marker D. 5 4. 3 2 1. m maker G. UG GT2B17 deletio on. m marker J. marker J. Figuree 1-5. Gene--specific m arker locatiions 31 ) . UGT2B 17 遺 伝 子 が 存 在 し て い る 場 合 に は 、 UGT T2B17 の 5’側 の upstreeam 領 域 の 増 幅 産 物 （ maarker D） が 検 出 さ れ る 。 UGT2B B17 遺 伝 子 （ 150 kb） ）を欠失して いる場合には、 UGT2B 17 欠 失 点 （ UGT2B15 5 の 3’末 端 1.2 kb の 領 域 ）の 増 幅 産 物（ m marker J）が が検出さ れ る 。 UGT2B17 を 欠 失 し て い な い 場 合 に は 、 maarker J の 増 幅 は 無 い 。 ま た 、 marker m G は UGT T2B15 の exxon 1 領 域 の 増 幅 産 物 で あ り 、 PCR P 反 応で の ゲ ノ ム の 存 在 を確 認 す る た め の 指 標 と し た 。 以 上 のこ と か ら 、 次 の よ う に 遺 伝 子型 を 判 定 し た 。 16.
(23) UGT2B17 ホ モ 接 合 型 欠 失 del/del 型. : marker J の 検 出 お よ び marker D の 不 検 出. UGT2B17 ホ モ 接 合 型 挿 入 ins/ins 型. : marker J の 不 検 出 お よ び marker D の 検 出. UGT2B17 ヘ テ ロ del/ins 型. : marker J の 検 出 お よ び marker D の 検 出. そ の 結 果 、Table 1-1 に 示 す よ う に 、日 本 人 競 技 者 の del/del 型 は 、男 性 で 74.5%、女 性 で は 60.2%の 頻 度 で あ っ た 。del/ins 型 は 、男 性 が 24.3%で あ り 、女 性 は 37.1%で あ っ た 。 ins/ins 型 は 、 男 性 が 3 人 （ 1.2%）、 女 性 が 7 人 （ 2.7%） で あ っ た 。 男 性 の del/del 型 頻 度 は 、 女 性 の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 で あ っ た （ 帰 無 仮 説 H0 は 棄 却 さ れ な か っ た 。 χ 2 = 12.0, 自 由 度 = 1, P < 0.01）。 日 本 人 競 技 者 の 遺 伝 子 型 分 布 は 、 ハ ー デ ィ –ワ イ ン ベ ル ク 平 衡 の 法 則 か ら の 乖 離 は な か っ た（ 帰 無 仮 説 H 0 は 棄 却 さ れ な か っ た 。 男 性 χ 2 = 0.7, 女 性 χ 2 = 2.9, 自 由 度 = 1）。 Table 1-1. UGT2B17 genotype distribution Origin. Number Rate%. Gender del/del. Asian (Japanese). Male. Asian (Japanese). Female. Asian (Koreans). Male. Caucasian (Swedes). Male. Caucasian (pubertal boys). Male. Reference. del/ins. ins/ins. 190. 62. 3. 74.5%. 24.3%. 1.2%. 154. 95. 7. 60.2%. 37.1%. 2.7%. 44. 15. 7. 66.7%. 22.7%. 10.6%. 8. 34. 44. 9.3%. 39.5%. 51.2%. 10. 52. 54. 8.6%. 44.8%. 46.6%. [32]. [32]. [39]. ス ウ ェ ー デ ン 人 男 性 お よ び 思 春 期 の コ ー カ サ ス 人 男 性 の del/del 型 は 、そ れ ぞ れ 9.3% お よ び 8.6%で あ る の に 対 し て. 32 ,3 9). 、 日 本 人 男 性 の そ れ は 、 74.5%と 非 常 に 高 い 割 合 で. あった。この結果は、日本人と同じく東アジアのモンゴロイド人種を中心とする韓国 に お い て 、 66.7%と 高 い 割 合 で あ る 結 果 と も 一 致 し た. 32 ). 。注目すべき点は、同じ東ア. ジ ア 人 で あ る 韓 国 人 男 性 の ins/ins 型 は 10.6%で あ る の に 対 し て 、日 本 人 男 性 で は 、1.0% と 10 分 の 1 未 満 に す ぎ な い 点 で あ る 。こ の 理 由 の 一 つ と し て 、日 本 の 地 理 的 な 要 因 が 考 え ら れ る 。 す な わ ち 、 元 来 は 東 ア ジ ア 地 域 の モ ン ゴ ロ イ ド 人 種 に お い て は 、 del/del 型が主流であるが、韓国は大陸と陸続きであり、欧州地域とは歴史的に密接な交流が あったのに対して、日本は島国であり、遺伝的に独立していたことが起因している可 能性も考えられる。. 17.
(24) 1.3.2. Testosterone 関 連 代 謝 物 の 尿 中 プ ロ フ ァ イ ル. GC–MS 測 定 に よ り 得 ら れ た SIM ク ロ マ ト グ ラ ム を 、 Figure 1-6 に 示 し た 。 TMS 化 ス テ ロ イ ド の 定 量 用 イ オ ン 、 I.S.の イ オ ン お よ び t R を Table 1-2 に 示 し た 。 ま た 、 本 法 で は 酵 素 加 水 分 解 の 成 否 の 確 認 用 に d 4 -A-g を 添 加 し た 。d 4 -A の 検 出 を モ ニ タ ー す る た め 、 d 4 -A-bis-TMS（ MW = 438） の イ オ ン m/z 438（ M + ） も あ わ せ て 設 定 し た 。 Abundance Ion 432.00 (431.70 to 432.70): 9301002.D\data.ms 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 8.00. Time> Abundance. T. DHEA E. 9.00. 10.00. 11.00. 12.00. 13.00. 14.00. 15.00. Ion 434.00 (433.70 to 434.70): 9301002.D\data.ms. A 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 8.00. 9.00. 10.00. Et. 11.00. 12.00. 13.00. 14.00. 15.00. Time> Abundance Ion 241.00 (240.70 to 241.70): 9301002.D\data.ms. 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 8.00. 5β-diol 5α-diol. 9.00. 10.00. 11.00. 12.00. 13.00. 14.00. 15.00. Time> Abundance Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 9301002.D\data.ms. MT 25000 20000 15000 10000 5000 0 8.00. 9.00. 10.00. 11.00. 12.00. 13.00. 14.00. 15.00. Time>. Figure 1-6. GC–MS chromatograms of steroid TMS derivatives.. 18.
(25) Table 1-2. Monitoring ions of target steroids and their retention times Steroid. Derivative. Qualifier ion. tR (min). Testosterone. Testosterone-bis-TMS. m/z 432 (M+). 13.5. Epitestosterone. Epitestosterone-bis-TMS. m/z 432 (M+). 12.6. DHEA. DHEA-bis-TMS. m/z 432 (M+). 12.1. A. Androsterone-bis-TMS. +. m/z 434 (M ) +. 10.7. Et. Etiocholanolone-bis-TMS. m/z 434 (M ). 10.9. 5α-diol. 5α-diol-bis-TMS. + m/z 241 (M ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH). 11.1. 5β-diol. 5β-diol-bis-TMS. m/z 241 (M+ ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH). 11.3. d 3 -T. d 3 -T-bis-TMS. m/z 435 (M+). 13.5. d 3 -E. d 3 -E-bis-TMS. m/z 435 (M+). 12.6. d 6 -DHEA. d 6 -DHEA-bis-TMS. m/z 438 (M ). d 5 -Et. d 5 -Et-bis-TMS. m/z 439 (M+). 10.9. d 3 -5α-diol. d 3 -5α-diol-bis-TMS. + m/z 244 (M ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH). 11.1. d 5 -5β-diol. d 5 -5β-diol-bis-TMS. m/z 246 (M+ ̶ CH3･ ̶ 2TMSOH). 11.2. MT. MT-bis-TMS. + m/z 446 (M ). 15.3. d 4 -A. d 4 -A-bis-TMS. Internal standard (I.S.). +. +. m/z 438 (M ). 12.0. 10.7. 本測定法は、ドーピング検査に用いられている標準法であるため、他施設で開発し た分析法の導入時のメソッドバリデーションの詳細は割愛する。1 例を示すと、 Testosterone の 直 線 性 は 0.5 ng/mL か ら 16 ng/mL で R 2 =0.9997、 正 確 度 （ accuracy） は 2.2 – 9.6%と 良 好 で あ っ た 。 同 様 に 、 他 の 測 定 対 象 ス テ ロ イ ド の Accuracy は 、 2.9 – – 20.4%で あ り 、 良 好 で あ っ た 。 ま た 、 す べ て の 尿 試 料 の 測 定 に あ た っ て は 、 精 度 管 理 用 試 料 （ quality control sample: QC sample） も 同 時 に 測 定 し て 精 度 管 理 を 行 っ た 。 QC sample に お け る 対 象 ス テ ロ イ ド 濃 度 は 、 精 度 管 理 基 準 内 に あ り 、 Testosterone 濃 度 の 日 間 再 現 性 は 、 1.6%（ 70 ng/mL） か ら 10.1%（ 0.5 ng/mL） と 良 好 に 測 定 が 行 わ れ た 。 尿中成分の濃度は、尿量による影響を受けるため、一般的にクレアチニン補正や比重 補 正 を 行 う 。本 章 で は 、ド ー ピ ン グ 検 査 で 採 用 さ れ て い る 尿 比 重（ specific gravity: S.G.） 1.020 を 基 準 と し て 、 次 式 （ 1） に よ り 補 正 し た 濃 度 を デ ー タ 解 析 に 用 い た Concentration co r r e ct ed. =. (1.020− 1) (S.G.sample − 1). × Concentration me a su r e d. 20 ). 。 （ 1）. 1 名 の del/del 型 の 男 性 は 、 ド ー ピ ン グ 禁 止 薬 物 が 検 出 さ れ た た め 統 計 解 析 デ ー タ か ら 除 外 し た 。 女 性 群 に お い て 、 2 名 の del/del 型 競 技 者 の Testosterone、 5α-diol お よ び 5β-diol に つ い て は 、夾 雑 ピ ー ク が 検 出 さ れ た た め 、統 計 解 析 デ ー タ か ら 除 外 し た 。コ ル モ ゴ ロ フ –ス ミ ル ノ フ 検 定 の 結 果 、非 正 規 分 布 を 示 し た た め 統 計 解 析 は ノ ン パ ラ メ ト リ ッ ク 法 に よ り 行 っ た 。Figure 1-7 に 、UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の steroid profile の Box-plot を 示 し た 。 ins/ins 型 は 、 男 性 で 3 名 、 女 性 で 7 名 の み で あ っ た た め 、 有 意 差 検 定 に お け る del/del 型 の 比 較 対 象 群 は 、 del/ins 型 と ins/ins 型 を 含 め る こ と と し た （ del/ins + ins/ins も し く は others と 表 記 ）。 19.
(26) Testosterone (ng/ml) 90 80. Epitestosterone (ng/ml) 120. ** **. **. 70 **. 60. ** NS **. 100. NS. 80. 50. 60. 40 40. 30 20. 20. 10 0. 0 del/del M. others M. del/del F. del/del M. others F. 5α-diol (ng/ml) 250. others M. del/del F. others F. 5β-diol (ng/ml) 180. ** NS. 160. **. 200. **. ** **. **. 140 NS. 120. 150. 100 80. 100. 60 40. 50. 20 0. 0 del/del M. others M. del/del F. others F. del/del M. del/del F. others F. 5α-/5β-diol. T/E 8. 6 5. others M. NS. **. * **. *. 7 ** 6. **. 4. **. 5 4. 3. 3. 2. 2 1. 1. 0. 0 del/del M. others M. del/del F. others F. del/del M. others M. del/del F. others F. Figure 1-7. Box plots of urinary steroid concentrations (i.e. aglycones) and the ratios. The whiskers indicate the 5 t h and 95 t h percentiles. **P < 0.0001. *P < 0.05. NS: not significant. others: del/ins + ins/ins. 20.
(27) Table 1-3 に 示 す よ う に 、日 本 人 男 性 競 技 者 に お い て 、del/ins 型（ median: 33.9 ng/mL） お よ び ins/ins 型（ median: 45.8 ng/mL）の 尿 中 Testosterone 濃 度 は 、del/del 型（ median: 4.4 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 を 示 し た （ P < 0.0001）。 一 方 、 del/ins 型 （ median: 31.7 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 13.9 ng/mL） の 尿 中 Epitestosterone 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 26.7 ng/mL)の そ れ と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た （ P > 0.05）。 del/del 型 （ median: 0.16） の T/E は 、 del/ins 型 （ median: 1.1） お よ び ins/ins 型 （ median: 3.3） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 い 結 果 を 示 し た （ P < 0.0001）。 Juul ら は 、 コ ー カ サ ス 人 種 の 思 春 期 男 性 に お い て 、del/del、del/ins お よ び ins/ins 型 の T/E 平 均 は 、 そ れ ぞ れ 0.29、 1.4 お よ び 2.1 と 報 告 し た. 39 ). 。今回、日本人男性競技者においても同. 様 の 結 果 を 示 し た 。 WADA の 設 定 し て い る T/E>4 を 示 し た の は 、 del/ins 型 2 名 （ 4.5 お よ び 5.0） で あ っ た 。 こ の 2 例 に つ い て は 、 1.2.3 項 に 示 し た GC–IRMS 分 析 を 実 施 し た 結 果 、内 因 性 の T/E 高 値 と 判 断 で き た 。日 本 人 男 性 の 74.5%を 占 め る del/del 型 の T/E 基 準 上 限 値 は 、 95% CI か ら 算 出 す る と 0.5 が 妥 当 と 考 え ら れ 、 WADA の 設 定 す る T/E>4 と は 大 き な 乖 離 で あ っ た 。Table 1-4 に 示 す よ う に 、女 性 競 技 者 に お い て は 、del/ins 型（ median: 5.2 ng/mL）お よ び ins/ins 型（ median: 9.5 ng/mL）の 尿 中 Testosterone 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 1.4 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 高 い 結 果 を 示 し た （ P < 0.0001）。 一 方 、 del/ins 型 （ median: 9.2 ng/mL） お よ び ins/ins 型 （ median: 5.8 ng/mL） の 尿 中 Epitestosterone 濃 度 は 、 del/del 型 （ median: 10.1 ng/mL） の そ れ と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た（ P > 0.05）。男 性 同 様 に del/del 型（ median: 0.14）の T/E は 、del/ins 型 （ median: 0.6） お よ び ins/ins 型 （ median: 1.7） の そ れ と 比 較 し て 有 意 に 低 い 結 果 を 示 し た（ P < 0.0001）。WADA の 設 定 し て い る T/E>4 を 示 し た 女 性 競 技 者 は い な か っ た が 、 ins/ins 型 の 女 性 競 技 者 が 最 大 で 3.4 を 示 し た 。 本 研 究 内 に お い て 、 95% CI を も と に UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E 基 準 上 限 値 を 設 定 し た 。す な わ ち 、日 本 人 女 性 に つ い て は 0.4（ del/del）、1.9（ del/ins）お よ び 3.2（ ins/ins） と 設 定 し た 。 WADA の 設 定 す る Testosterone 製 剤 に よ る ド ー ピ ン グ 判 定 基 準 に は 、 世 界 統 一 基 準 T/E>4 で は な く 、UGT2B17 遺 伝 子 型 別 の T/E 基 準 値 を 適 用 す る こ と が 妥 当 であることが明らかとなった。. 21.
(28) Table 1-3. Urinary steroid concentrations (i.e. aglycones) and the ratios classified according to UGT2B17 genotypes in Japanese male student athletes Testosterone Epitestosterone (ng/ml) (ng/ml). A (ng/ml). Et (ng/ml). 5α-diol (ng/ml). 5β-diol (ng/ml). DHEA (ng/ml). del/del Male n. 189. 189. 189. 189. 189. 189. 189. Mean. 4.8. 31.2. 2386. 1364. 55.1. 33.2. 34.4. Median. 4.4. 26.7. 2240. 1249. 49.3. 30.1. 30.6. Maximum. 32.6. 107. 7772. 6168. 235. 154. 143. Minimum. 0.6. 3.5. 701. 330. 15. 9. 9. 25th percentile. 3.5. 19.0. 1746. 956. 37. 21. 24. 75th percentile 95 % CI del/ins Male. 5.4. 38.9. 2732. 1565. 66. 40. 41. 2.1-9.1. 7.4-75.1. 1113-4765. 566-2688. 21.6-121. 11.0-71.6. 13.4-77.1. n Mean. 62. 62. 62. 62. 62. 62. 62. 37.7. 33.9. 2532. 1648. 56.4. 65.0. 36.8 30.3. Median. 33.9. 31.7. 2337. 1508. 50.0. 63.3. Maximum. 76.6. 85.6. 6548. 6792. 132. 169. 132. Minimum. 4.3. 7.4. 763. 385. 20.6. 19.0. 11.9. 25th percentile. 26.2. 20.6. 1731. 1161. 36.8. 42.7. 23.2. 75th percentile 95 % CI ins/ins Male. 48.3. 42.7. 3111. 2027. 70.7. 84.8. 46.3. 6.6-72.1. 9.9-70.0. 955-4753. 522-3027. 21.9-121. 24.8-118. 12.3-74.9. n. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. Mean. 46.7. 15.8. 1957. 1243. 36.4. 61.2. 24.1. Median. 45.8. 13.9. 1837. 1061. 40.2. 41.2. 24.9. Maximum. 55.5. 23.0. 2412. 1751. 41.7. 104. 28.6. Minimum P value. 38.7. 10.4. 1622. 918. 27.2. 38.2. 18.9. <0.0001. NS. NS. <0.01. NS. <0.0001. NS. T/E. A/Et. 5α-/5β-diol. 5α-diol/E. 5β-diol/E. A/T. n. 189. 189. 189. 189. 189. 189. Mean. 0.19. 1.9. 1.8. 2.2. 1.3. 548. Median. 0.16. 1.9. 1.7. 1.8. 1.0. 509. del/del Male. Maximum. 0.94. 4.6. 4.4. 10.1. 6.2. 2387. Minimum. 0.03. 0.6. 0.4. 0.5. 0.2. 68.6. 25th percentile. 0.12. 1.4. 1.4. 1.3. 0.7. 399. 75th percentile 95 % CI del/ins Male. 0.22. 2.2. 2.1. 2.6. 1.5. 635. 0.07-0.49. 0.8-3.6. 0.9-3.1. 0.6-6.2. 0.4-4.5. 260-978. n. 62. 62. 62. 62. 62. 62. Mean. 1.4. 1.6. 0.9. 2.0. 2.3. 87.8 63.2. Median. 1.1. 1.6. 0.9. 1.6. 2.1. Maximum. 5.0. 3.3. 2.2. 4.7. 6.6. 749. Minimum. 0.10. 0.87. 0.5. 0.6. 0.7. 24.7. 25th percentile. 0.8. 1.3. 0.67. 1.2. 1.4. 50.5. 75th percentile 95 % CI ins/ins Male. 1.7. 1.9. 1.1. 2.5. 2.9. 86.1. 0.2-4.1. 0.9-2.8. 0.5-1.9. 0.8-4.6. 0.7-5.3. 32.9-335. n Mean. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.2. 1.7. 0.7. 2.5. 3.7. 42.5. Median. 3.3. 1.8. 0.7. 2.6. 3.7. 41.9. Maximum. 3.7. 2.3. 1.0. 3.3. 4.3. 52.6. Minimum P value. 2.4. 1.0. 0.4. 1.7. 3.2. 33.1. <0.0001. <0.01. <0.0001. NS. <0.0001. <0.0001. P value: del/del vs. del/ins + ins/ins. NS: not significant.. 22.
図
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