小 括

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総 括

ス ポ ー ツ 基 本 法 の 基 本 理 念 は 、「 ス ポ ー ツ は 、こ れ を 通 じ て 幸 福 で 豊 か な 生 活 を 営 む こ と が 人 々 の 権 利 で あ る こ と に 鑑 み 、 国 民 が 生 涯 に わ た り あ ら ゆ る 機 会 と あ ら ゆ る 場 所 に お い て 、 自 主 的 か つ 自 律 的 に そ の 適 性 お よ び 健 康 状 態 に 応 じ て 行 う こ と が で き る よ う に す る こ と を 旨 と し て 、 推 進 さ れ な け れ ば な ら な い 。」 と 謳 わ れ て い る 。 ス ポ ー ツ の 価 値 を 守 る た め に も 、 ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 活 動 は ま す ま す 重 要 視 さ れ 、 効 果 的 な ド ー ピ ン グ 検 査 や 新 た な 検 査 技 術 開 発 は ま す ま す 期 待 さ れ て い る 。

本 研 究 は 、 ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 活 動 に お け る 競 技 者 か ら の 検 体 分 析 を 有 効 的 な も の と す る べ く 、 現 行 の 検 査 法 の 妥 当 性 の 検 討 と そ こ か ら 見 え る 新 た な 課 題 の 解 決 を ま と め た も の で あ る 。 ド ー ピ ン グ 検 査 に お い て は 、 ホ ル モ ン 製 剤 の よ う に 元 来 生 体 内 に 存 在 す る 物 質 の 使 用 を 証 明 す る こ と が 最 も 困 難 で あ る 。 本 研 究 で は 、3つ の ホ ル モ ン 製 剤 に 焦 点 を 当 て た 。 タ ン パ ク 同 化 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン に 関 し て は 第 1 章 、 GH お よ び 成 長 促 進 因 子 に 関 し て は 第 2 章 、 そ し て 造 血 ホ ル モ ン で あ る EPO に 関 し て は 第 3章 に 述 べ た 。

第 1章 で は 、 日 本 人 に お け る Testosterone 製 剤 の ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る 妥 当 性 に つ い て 検 討 し た 。Testosteroneド ー ピ ン グ の 検 出 用 パ ラ メ ー タ ー で あ る T/Eに は 人 種 差 が あ り 、 日 本 を 含 む 東 ア ジ ア 人 の T/Eが 欧 米 人 の そ れ よ り も 低 い 傾 向 で あ る と 考 え ら れ て き た 。 本 研 究 で は 、 日 本 人 競 技 者 （ 男 性 255 名 お よ び 女 性 256名 ） に お け る Testosteroneの グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 に 関 与 す る 遺 伝 子UGT2B17の 遺 伝 子 多 型 に つ い て 調 査 し た 。そ の 結 果 、日 本 人 競 技 者 の UGT2B17 遺 伝 子 の ホ モ 接 合 型 欠 失（del/del 型 ） は 男 性 で 74.5%、 女 性 で 60.2%を 占 め 、UGT2B17ホ モ 接 合 型 挿 入 （ins/ins型 ） は 男 性 で わ ず か 1.2%、 女 性 で 2.7%で あ り 、 欧 米 諸 国 と は 対 照 的 で あ る こ と を 明 ら か と し た 。 さ ら に 、 こ れ ま で 実 施 例 の ほ と ん ど な か っ た 女 性 に 対 す る Testosterone 製 剤 使 用 後 の T/Eを 含 む steroid profileの 変 化 に つ い て も 検 討 し た 。そ の 結 果 、ins/ins お よ び del/ins型 で は 、WADA 承 認 試 験 法 で あ る 世 界 統 一 基 準 に よ る T/Eに よ る 判 定 法 は 有 効 で あ る も の の 、del/del 型 で は ほ と ん ど 検 知 で き な い こ と を 明 ら か に し た 。 こ の 事 実 は 、日 本 を 含 む ア ジ ア 地 域 に お け る WADA 認 定 試 験 所 に 対 し て 警 鐘 を 鳴 ら す こ と と な っ た 。 こ れ ま で T/Eの 世 界 統 一 基 準 閾 値 （T/E>4） を も と に Testosterone ド ー ピ ン グ の 検 査 が 実 施 さ れ て き た が 、 本 研 究 に よ り そ の 有 効 性 に は 限 界 が あ る こ と が 明 確 と な っ た 。WADA の 集 計 に よ る と ⁵⁾、2012年 の 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果

（AAF） の 報 告 率 は 、 日 本 （WADA Tokyo Laboratory） に お い て 0.16%で あ り 、 全 WADA 認 定 試 験 所 集 計 で の 1.19%と 比 較 し て 顕 著 に 低 い 。 こ の 傾 向 は 例 年 み ら れ る 傾 向 で あ る 。 日 本 人 競 技 者 は 、 過 去 オ リ ン ピ ッ ク で 一 人 の 陽 性 者 も 出 さ な か っ た よ う に 、 薬 物 に 対 し て ク リ ー ン で あ る と 考 え ら れ て き た 。 本 研 究 の 結 果 か ら 、 日 本 人 競 技 者 の 低 い 陽 性 率 は Testosterone ド ー ピ ン グ を 検 知 で き て い な い た め で あ る と 諸 外 国 か ら の 指 摘 を 受 け る 可 能 性 も あ る 。 故 に 、 日 本 と し て は 早 急 に 対 処 す る 必 要 性

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が あ る 。本 研 究 の 結 果 は 、Testosterone の よ う な 内 因 性 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 異 同 識 別 に お い て は 、 単 に 基 準 値 の 見 直 し で は 解 決 し 得 な い こ と を 明 ら か に し た だ け で は な く 、Testosterone ド ー ピ ン グ の 検 出 率 向 上 に 対 す る 確 か な 対 応 を 必 要 と し て い る こ と を 示 し た 。ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト（ABP）の よ う に 個 人 の T/E や steroid profile を 追 跡 し て い く こ と で そ の 変 動 を 捉 え る 手 法 は 、 日 本 を は じ め と す る ア ジ ア 地 域 の ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 機 関 に お い て は 重 要 で あ る 。 こ の 研 究 結 果 を 踏 ま え 、2013年 4 月 か ら 日 本 で は ア ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト （ABP） の 導 入 を 開 始 し て い る ¹⁰⁶⁾。

第2章 で は 、現 行 のWADA承 認 試 験 法 で あ る「GH isoform differential immunoassay」 の 世 界 統 一 基 準 に よ る rhGH ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 妥 当 性 に つ い て 検 討 し た 。rhGH お よ び 成 長 促 進 因 子 GHRP-2 の 投 与 試 験 を 実 施 し 、WADA承 認 試 験 法 の 妥 当 性 を 明 確 化 し 、 さ ら に は 検 出 法 の 原 理 の 弱 点 を 明 ら か と し た 。GHRP-2の 使 用 は WADA 承 認 試 験 法 で は 検 出 で き な い ば か り か 、rhGH と 併 用 使 用 し た 場 合 に は 、rhGH ド ー ピ ン グ の 検 出 を 隠 ぺ い す る 効 果 を 有 し て い る こ と も 明 ら か と し た 。そ こ で 、rhGH ド ー ピ ン グ 検 出 法 の 弱 点 を 補 う た め に 、GHRP-2 を 直 接 的 に 分 析 す る 手 法 の 開 発 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 尿 試 料 中 か ら GHRP-2 代 謝 物 D-Ala-D-(β-naphthyl-)Ala-Ala-OH（AA-3）

を 見 出 し 、 そ れ を UPLC−MS/MS に よ り 分 析 す る こ と で GHRP-2 ド ー ピ ン グ の 検 出 を 直 接 的 に 可 能 と し た 。 本 章 で 同 定 し た 代 謝 物 AA-3 は 、 そ の 後 、 ド イ ツ の WADA 認 定 試 験 所 で の 追 試 に お い て 、 イ ン タ ー ネ ッ ト 上 で 流 通 し て い る GHRP-2 含 有 サ プ リ メ ン ト Hemogex^TMの 経 口 服 用 後 の 尿 中 か ら AA-3が 高 感 度 に 検 出 さ れ る こ と が 実 証 さ れ た ¹⁰⁷⁾。 現 在 、WADA 認 定 試 験 所 で GHRP-2 ド ー ピ ン グ 検 出 の 対 象 物 質 と し て 検 査 が 実 施 さ れ る に 至 っ て い る 。

第 3章 で は 、rEPO の 一 つ Darbepoetin alfaの 質 量 分 析 法 の 開 発 を 行 っ た 。

Darbepoetin alfa は ヒ ト の EPO の 5 箇 所 の ア ミ ノ 酸 残 基 を 変 更 し 、シ ア ル 酸 含 量 を 高 め て 血 中 半 減 期 を 延 長 さ せ た165個 の ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な る 分 子 量 約35-kDaの 糖 タ ン パ ク 質 で あ る 。 イ ン タ ク ト で 質 量 分 析 に よ り 測 定 す る こ と は 感 度 面 で 困 難 で あ っ た が 、Bottom-up法 に よ り ヒ ト 尿 試 料 中 の Darbepoetin alfa の 質 量 分 析 法 を 開 発 し た 。 測 定 原 理 は 、尿 試 料 を 抗 EPOモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に よ る イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー に よ り 精 製 し 、NH₄HCO₃ buffer（pH 7.8） 中 で V8-プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 消 化 （25 °C, 3 時 間 ） 後 、 得 ら れ た Darbepoetin alfa に 特 異 的 な ペ プ チ ド V₁₁

（⁹⁰TLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKE¹¹⁷）を UPLC−MS/MS に よ り 測 定 す る も の で あ る 。Darbepoetin alfa投 与 後 に 採 取 さ れ た 尿 試 料 か ら 極 微 量（LOD：1.2 pg/mL）

の Darbepoetin alfaを 検 出 可 能 と し て い る 。 本 法 は 、 現 行 の WADA 承 認 試 験 法 で あ る IEF−PAGEが 分 析 に 3 日 を 要 す る の に 対 し 、 わ ず か 半 日 で の 高 感 度 か つ 迅 速 分 析 を 可 能 と し た 同 定 の 信 頼 性 が 高 い 質 量 分 析 法 で あ る 。 本 法 は 、 糖 鎖 構 造 の 違 い に 依 存 し な い た め 、特 許 切 れ 以 降 に 上 市 さ れ る こ と が 予 想 さ れ る Darbepoetin alfa の 後 続 品 に も 適 用 可 能 と 考 え ら れ る 。ま た 、ペ プ チ ド V₁₁の ア ミ ノ 酸 配 列 は 、馬 の EPO と の 相 同 性 が 無 い た め 、競 走 馬 に お け る Darbepoetin alfa の ド ー ピ ン グ 検 査 に も 適 用 可

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能 で あ る と 考 え ら れ る 。 医 薬 品 開 発 に お け る rEPO製 剤 の 体 内 動 態 試 験 で は 、 内 因 性 EPOも 同 時 に 測 り こ む イ ム ノ ア ッ セ イ が 用 い ら れ て き た 。本 法 を 最 適 化 す る こ と で 、 定 量 分 析 も 可 能 と 考 え ら れ る 。Darbepoetin alfa の 体 内 動 態 を 正 確 に 調 査 す る こ と が 可 能 と な る こ と が 期 待 で き る 。

2013 年 9月 7日 、2020年 東 京 で の オ リ ン ピ ッ ク 開 催 が 決 定 し た 。オ リ ン ピ ッ ク 成 功 の 一 つ に は 、ド ー ピ ン グ の な い 大 会 で あ る こ と が 挙 げ ら れ る 。2012年 の ロ ン ド ン 大 会 で は 、 参 加 競 技 者 の 30%以 上 で ド ー ピ ン グ 検 査 が 実 施 さ れ た 。 尿 試 料 と 血 液 試 料 あ わ せ て 過 去 最 高 の 5132検 体 が 分 析 さ れ 、8件 の 違 反 が 疑 わ れ る 分 析 結 果（AAF）

が 報 告 さ れ た ¹⁰⁸⁾。 こ れ ま で で 最 も 陽 性 事 例 の 少 な い ク リ ー ン な 大 会 と な り 、 近 年 の ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ 活 動 の 成 果 と 云 え る 。 一 方 で 、 ロ ン ド ン 大 会 前 に 全 世 界 で 71649 検 体 の 競 技 会 外 検 査 が 実 施 さ れ 、107件 の ド ー ピ ン グ 違 反 を 摘 発 し て 、ロ ン ド ン 五 輪 本 大 会 へ の 出 場 を 阻 止 し た 事 実 も あ る ¹⁰⁹⁾。 さ ら に 、 競 技 ス ポ ー ツ に お け る ド ー ピ ン グ 陽 性 事 例 数 は 、2012 年 は WADA の 統 計 に よ る と 年 間 5000件 を 超 え て い る の が 実 態 で あ る ⁵⁾。 加 え て 、 様 々 な 種 類 の 薬 物 に よ る ド ー ピ ン グ の 拡 大 も 懸 念 さ れ て い る 。 検 査 の す り 抜 け を 意 図 す る 不 法 な 合 成 薬 物 、 デ ザ イ ナ ー ド ラ ッ グ や 未 承 認 の 新 規 薬 物 の 使 用 な ど も 危 惧 さ れ て い る 。 創 薬 の 分 野 で は 、 持 続 的 な 薬 効 を 示 す ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 結 合 タ ン パ ク 製 剤 な ど が 、 新 た な 新 薬 候 補 と し て 開 発 が 見 込 ま れ て い る 。 こ う し た 背 景 の 中 、 ド ー ピ ン グ 検 査 法 の 開 発 は ま す ま す 重 要 性 を 増 し て い く で あ ろ う 。

最 後 に 、 著 者 は 本 研 究 成 果 が 健 全 な ス ポ ー ツ の 脅 威 で あ る ド ー ピ ン グ の 撲 滅 に 寄 与 し 、 競 技 者 の み な ら ず 青 少 年 へ の 健 康 被 害 を 防 止 す る こ と を 願 う も の で あ る 。 ま た 、 新 た な 分 析 技 術 の 開 発 、 分 析 精 度 の 向 上 お よ び 分 析 の 効 率 化 を 達 成 す る こ と で ア ン チ ・ ド ー ピ ン グ を 推 進 し 、 ス ポ ー ツ の 価 値 を 守 る 所 存 で あ る 。

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謝 辞

本 論 文 を ま と め る に あ た り 、 終 始 ご 懇 篤 な る ご 指 導 と ご 鞭 撻 を 賜 り ま し た 東 京 薬 科 大 学 薬 学 部 薬 物 生 体 分 析 学 教 室 教 授 渋 沢 庸 一 博 士 な ら び に 東 京 薬 科 大 学 薬 学 部 薬 学 教 育 推 進 セ ン タ ー 教 授 篠 原 佳 彦 博 士 に 心 よ り 感 謝 申 し 上 げ ま す 。ま た 、暖 か い 激 励 と ご 助 言 を 賜 り ま し た 東 京 薬 科 大 学 薬 学 部 病 態 生 理 学 教 室 講 師 長 谷 川 弘 博 士 に 深 謝 い た し ま す 。

試 料 採 取 に ご 協 力 い た だ き ま し た ボ ラ ン テ ィ ア な ら び に 関 係 者 の 皆 様 に 心 よ り 感 謝 申 し 上 げ ま す 。

本 研 究 の 遂 行 に あ た り 、多 大 な ご 協 力 を 賜 り ま し た 株 式 会 社 LSIメ デ ィ エ ン ス（ 旧 社 名   三 菱 化 学 メ デ ィ エ ン ス 株 式 会 社 ） 陰 山 信 二 氏 、池 北 紋 子 氏 、佐 藤 充 彦 氏 な ら び に 職 員 の 皆 様 に 深 謝 い た し ま す 。

な お 、 本 研 究 は 、 文 部 科 学 省 な ら び に ス ポ ー ツ 振 興 く じ 助 成 に よ る 研 究 助 成 、 資 金 負 担 に よ り 実 施 さ れ た も の で す 。 こ こ に 記 し て 感 謝 の 意 を 表 し ま す 。