1 名 の 被 験 者 の 投 与 前 、投 与 後 2時 間 お よ び 投 与 後 47時 間 の 尿 試 料 を 分 析 し て 得 ら れ た MRMク ロ マ ト グ ラ ム を Figure 3-7に 示 し た 。 ヒ ト EPO/Epoetin alfa お よ び Darbepoetin alfa に 共 通 の 消 化 断 片 ペ プ チ ド V9の ピ ー ク は 、 投 与 前 後 の 尿 試 料 に お い て tR = 2.9分 に 検 出 さ れ た （Figure 3-7 最 下 段 ）。 投 与 前 の 尿 試 料 に お け る ペ プ チ ド V9は 内 因 性 EPO由 来 で あ り 、 投 与 後 尿 試 料 に お い て は 、 内 因 性 EPO お よ び Darbepoetin alfa の 両 者 由 来 で あ る と 推 測 さ れ る 。 投 与 後 2時 間 （Figure 3-7b） お よ び 47時 間 （Figure 3-7c） で は 、 ペ プ チ ド V11の ピ ー ク が 、4 つ の mass transition に お け る MRMク ロ マ ト グ ラ ム に お い て tR = 2.6分 に 検 出 さ れ た 。 一 方 、 投 与 前 で は V11の ピ ー ク は 、い ず れ の mass transitionに お い て も 検 出 さ れ な か っ た（Figure 3-7a）。
他 の 2名 の 被 験 者 に お い て も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た 。 こ の よ う に 、Darbepoetin alfa 投 与 後 に 採 取 し た 尿 試 料 す べ て か ら 分 析 対 象 ペ プ チ ド V11を 検 出 し た 。
Figure 3-7. Typical MRM chromatograms generated from urine samples collected before and after intravenous injection of 15 μg darbepoetin alfa: (a) pre-administration, (b) post 2 h and (c) post 47 h.
(a) Pre-administration (b) Post 2 h (c) Post 47 h 2.50 2.75 3.00 Time
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.90
2.50 2.75 3.00 Time
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100 2.63
3.11
2.63
2.63
2.63
2.91
2.50 2.75 3.00 Time
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100
2.50 2.75 3.00
%
0 100 2.63
3.11
2.63
2.63
2.63
2.91
3.04 604.9 >702.5
2.90e4
604.9 >670.4 1.73e3
604.9 >642.2 1.57e3
604.9 >187.2 1.84e4
558.3 >584.3 2.99e3
604.9 >702.5 1.41e5
604.9 >670.4 3.85e4
604.9 >642.2 3.31e4
604.9 >187.2 2.07e5
558.3 >584.3 2.22e4
604.9 >702.5 5.72e4
604.9 >670.4 1.82e4
604.9 >642.2 1.45e4
604.9 >187.2 9.06e4
558.3 >584.3 1.24e4
V9 V9 V9
V11
V11
V11
V11
V11
V11
V11
V11
87
ド ー ピ ン グ 検 査 に お け る LC−MS に よ る 定 性 分 析 に お い て は 、 参 照 標 準 の tRお よ び 成 分 の 構 造 的 特 徴 を 示 す 診 断 イ オ ン と WADA に よ り 設 定 さ れ た 基 準 範 囲 内
（torelance） で 一 致 す る こ と に よ り 測 定 試 料 中 の 成 分 を 同 定 す る こ と と 規 定 さ れ て い る 71)。Table 3-5 に 、Darbepoetin alfa投 与 尿 試 料 の 定 性 分 析 結 果 を 示 し た 。 Table 3-5. Compatibility of the relative retention times and the relative abundances of diagnostic ions with the identification criteria for qualitative assay
Analyte RRT Diff.%
Abundance (Peak area) Relative%
m/z 604.9
> 187.2
m/z 604.9
> 670.4
m/z 604.9
> 698.1
m/z 604.9
> 702.5
m/z 604.9
> 642.2
m/z 604.9
> 276.3 Reference
20 pg/mL
1.461
−
3778 100%
868 23.0%
2338 61.9%
2548 67.4%
661 17.5%
336 8.9%
Post 2 h 1.461 100%
7717 100%
1615 20.9%
5038 65.3%
5128 66.5%
1240 16.1%
666 8.6%
Post 47 h 1.461 100%
3303 100%
800 24.2%
2252 68.2%
2041 61.8%
490 14.8%
286 8.7%
Spiked 5 pg/mL
1.461 100%
1023 100%
191 18.7%
614 60.0%
639 62.5%
159 15.5%
124 12.1%
Spiked 100 pg/mL
1.461 100%
16416 100%
3411 20.8%
10281 62.6%
10566 64.4%
2304 14.0%
1190 7.2%
Tolerance71) 99–
101%
− 18.0–
28.0%
51.9–
71.9%
57.4–
77.4%
12.5–
22.5%
3.9–13.9%
ま ず 、 参 照 標 準 （Darbepoetin alfa 20 pg/mL添 加 尿 試 料, Table 3-5 最 上 段 ） お よ び 測 定 試 料 に お い て 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V11の I.S.（Hexarelin）に 対 す る 相 対 tR（relative retention time: RRT） を 算 出 し た 。LC−MSに お け る tRの 一 致 基 準 範 囲 （torelance）
は 、参 照 標 準 の RRTに 対 し て 測 定 試 料 の RRTの 差 が± 0.1 %と 規 定 さ れ て い る（Table 3-5 最 下 段 ）。Darbepoetin alfa投 与 尿 試 料 の RRTは 、 参 照 標 準 の RRT（1.461） と 完 全 に 一 致 し た 。次 に 、分 析 対 象 ペ プ チ ド V11の ベ ー ス ピ ー ク イ オ ン（m/z 604.9>187.2） に 対 す る 各 診 断 イ オ ン （m/z 604.9>670.4, m/z 604.9>698.1, m/z 604.9>702.5, m/z 604.9>642.2, m/z 604.9>276.3）の 強 度 比（rerative abundance: Relative%）を 算 出 し た 。 参 照 標 準 に お け る 診 断 イ オ ン の Relative%が>50 %の 場 合 、torelance は 参 照 標 準 の Relative% ± 10 %、 ま た 、5% − 25%の 場 合 の torelance は 参 照 標 準 の Relative% ± 5 % と 規 定 さ れ て い る 。 故 に 、 診 断 イ オ ン m/z 604.9>698.1お よ び m/z 604.9>702.5 の torelance は 、 参 照 標 準 の Relative% ± 10 %と な る 。 ま た 、m/z 604.9>670.4, m/z 604.9>642.2 お よ び m/z 604.9>276.3 の torelance は 、 参 照 標 準 の Relative% ± 5 %と な る （Table 3-5 最 下 段 ）。Darbepoetin alfa 投 与 尿 試 料 に お け る 各 診 断 イ オ ン の
Relative%は 、torelance を 満 た し た 。こ の よ う に 、本 分 析 法 は 、WADA が 要 求 す る 定 性 分 析 基 準 を 満 足 し 、 ド ー ピ ン グ 検 査 に 適 用 可 能 で あ る と 云 え る 。
88
次 に 、本 章 で 開 発 し た UPLC−MS/MS 法 の 妥 当 性 を 検 討 す る た め に 、現 在 の WADA 承 認 rEPO 検 査 法 で あ る IEF−PAGE に よ り 、同 一 尿 試 料 を 分 析 し た 。Figure 3-8 に 示 し た よ う に 、Darbepoetin alfaの 同 族 体 バ ン ド （lane 1 お よ び lane 8 の 酸 性 領 域 ） は 他 のEPO同 族 体 の バ ン ド（lane 1お よ びlane 8の 塩 基 性 領 域: Epoetins , lane 2: urinary EPO） と 比 較 し て 、 際 立 っ て 酸 性 側 に シ フ ト し て お り 、 少 な く と も 4つ の バ ン ド か ら 構 成 さ れ て い る 。IEF−PAGEに よ る Darbepoetin alfa 5 pg/mL の 尿 試 料 の バ ン ド
（lane 3）は 、不 鮮 明 で あ り 、Darbepoetin alfaを 検 出 す る の は 困 難 で あ っ た 。IEF−PAGE の み で ド ー ピ ン グ 判 定 す る こ と は 偽 陽 性 結 果 を 導 く 可 能 性 が あ っ た 。 こ の よ う な 場 合 、SDS−PAGE な ど の 追 加 分 析 が 必 要 で あ る 。 こ の 尿 試 料 を 本 研 究 で 開 発 し た UPLC−MS/MS 法 に 適 用 し た 場 合 は 、明 瞭 に 検 出 が 可 能 で あ っ た（Figure 3-6b お よ び Table 3-5）。Darbepoetin alfa投 与 尿 試 料 に つ い て は 、IEF−PAGE に よ り WADA の 検 出 基 準 （WADA TD2009EPO）10）を 満 た し 、 良 好 に 検 出 可 能 で あ っ た （lane 5: 投 与 前, lane 6: 投 与 2時 間 後, lane 7: 投 与 47時 間 後 ）。同 一 の 尿 試 料 を UPLC−MS/MS 法 に 適 用 し た 場 合 も 良 好 に 検 出 が 可 能 で あ っ た（Figure 3-7 お よ び Table 3-5）。こ の よ う に 、本 章 に お い て 開 発 し た UPLC−MS/MS法 は 現 行 の rEPOド ー ピ ン グ の 検 出 法 で あ る IEF−PAGEの 確 認 分 析 と し て 有 用 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 タ ン パ ク 質 に 結 合 し た 糖 鎖 の シ ア ル 酸 含 量 の 増 大 は 、 血 清 中 の 半 減 期 を 延 長 さ せ る 効 果 が あ る 102)。 Darbepoetin alfa は 、IEF–PAGEに よ り 皮 下 投 与 後 の 尿 中 か ら 長 期 間 に わ た り 検 出 が 可 能 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 103,104)。 本 研 究 に お い て 、Darbepoetin alfaは 静 脈 内 投 与 を 行 い 、 投 与 2 日 後 で も 検 出 が 可 能 で あ っ た 。 静 脈 内 投 与 は 皮 下 投 与 と 比 較 し て 消 失 が 早 い と 考 え ら れ る 。 検 出 可 能 期 間 に つ い て の 調 査 は 、 よ り 長 期 間 に 尿 試 料 を 採 取 し て 確 認 す る 必 要 が あ る 。
Figure 3-8. Immunoblots data separated by IEF−PAGE. 1: standard epoetins/darbepoetin alfa, 2: urinary EPO, 3: 5 pg/mL-urine of darbepoetin alfa, 4: 20 pg/mL-urine of
darbepoetin alfa, 5: pre-administration, 6: post 2 h, 7: post 47 h, 8: standard epoetins/darbepoetin alfa.
+ –
Acidic area Darbepoetin alfa Endogenous area Urinary human EPO Basic area Epoetins
1 2 3 4 5 6 7 8
89