及 す人 清 齢依 年 存的抑制 作 用 ( ) 刺激 球増殖性反 応

金 沢大 学十 全 医 学 会 雑誌 第9 2巻 第1 号 卜 1 Ⅰ ( 1 9 83)

P h _{y t}oh e m ag^glutinin (^{P H A}) 刺 激^{リ ン パ} 球 増殖 性 反応^に 及ぼす 人^血清^の年齢依存 的抑 制作^用

血清 ^{α2 ‑M acr oglobulin} 膿度と^の 関 連^{につ い て}

金沢 大学 医学 部小 児科単 数 室( 主 任 ^: 谷^口 封教授)

押 田 書 博

( 昭和^{5 7}年^{1 2}月^{2 7}日受 付)

p hy tohe m ag glutinin(P H A) 刺 激リ^{ン パ}球増 殖 性 反応^に及 ぼ す 正常人血 清の影 響^について年齢 因子 な ら びに血清 a 2^‑m a C r Oglobulin( 町I n) 濃度との関連^について検 討し た^･ 又, ア ト ピ^ー 型気 管 支喘 息 患 者 血 清の影 響^について同年 齢正常人 血清と 比較 検 討し た･ 血 清は 0 ^‑7 5 歳ま での正常 人及び ア ト ピ^ー 型気 管 支喘 息 患 者よ り得た. s ubop tim al do s e のP H A 濃 度 (3‑OJLg/ml) で年 齢 依存 的 抑 制作用 を認め た^･ 即ち 20 歳以下の若 年 者血 清及 び 61 歳以 上^の老 齢 者 血清は成人者血清^に比 し有 意な抑 制 作用 を 示 し(P <0^･01),

特^に5 歳以 下の若 年者血清^に著しい抑 制 作用 が あった･

一 九 ^op tim al do s e の P H A 濃度(7･5 _{p g}/ml) で は各 年 齢群^の血 清^の影 響^には有 意 差を認め な か^った. ア ト ピ^ー型 気 管 支喘 息患 者血 清と 正常人血 清と で は p H A 刺 激リン パ球 増殖 性 反応^に及ぼ す影 響^には有 意差は な か^った^･正常人血清 中^{のこ の}抑 制 因子 は分子 量 5 万 以 上 で硫 安 塩 析 法で は 0 ^‑ 1.8 M 分 画 中^{にあ り, その}抑 制 活 性は 8 0⁰C, 1 0 分 間^の熱 処理 で失 活し た･

血 清α 2‑^{m 濃 度と}年 齢依 存 的 抑 制 作用 と は有 意^に相 関し ていた(P^<0^･0 1) ･ 正常人血 清よ り精製し たα 2^‑m

は濃 度依 存 的 抑制 作用 を 示 し, α2‑^{m を含ま ない血 清 分画には抑 制 作 用を認め な かった■ 以上の ことから,}

正常 人血 清^の年齢依 存 的抑 制 作用 は血 清 町 m 演度の違^{い に}も と づ く も^のと推 察さ れ た･

Key ^{w o r}ds N or m al hu m a n s e r um , P H A^‑Stim ulated l_ym ph o cy t^e p^rolife r a^‑ tion , α2

‑M a c r oglob ulin.

末 輸血 リ^{ン パ}球^{の mito}g^{e n} に対す る増 殖 性 反応は生 体^の免 疫 能^{の 1 つ の}指標と し て広く臨 床 的^に活用 さ れ て^いる^{. こ の}リ^{ン パ}球 増殖 性 反 応を検 討す る際^の培 養

には 血清^の添 加が 必要である が血 清 中^には リ^{ン パ}球の

mitoge n に対す る増 殖性反応を抑 制す る因子^の存 在が

知 ら れ て^おり, ホ ジ キ^ン病, 癌, ネ^{フロ ー} ゼ症候 群を は じめ多数の病 的血清 中^には抑 制 因子^の存 在を指摘す る報 告が あ る^{7 ) 1 7 )‑2 7 )}.･^一方,正常人血 清 中にも im m u n o^‑ r eg^ulato ry ^α‑globulin (I R A ) を は じ め何種 類^カ;の抑

制 因子の存 在が報 告さ れ^ている^{6 卜 1 3 )}. これ らのう ちα 2

1 1 1 a C r Oglobulin ( 以下α 2∬^{m と略) がモ ル濃度あ た り} 最 大^の抑 制作用 を有す る と さ れ て^いる^{1 4 )}. 又,肺 癌や ネ

A_ge^‑dep^{e n}t C hang^{e s} in Inhib oto ry E ffe ct

フロ ^ー ゼ症 候 群で は血清 中の抑 制 因子 はα 2

‑

m で あ る と

す る報 告^{2 1 ) 2 2)}が あ り,血 清 中^の免疫 調 節物 質と し てのα2

‑^{11ユの役 割が注目さ れ ている3 7).}

α 2‑^{m は加 齢に伴ない血清 濃 度が著しく変 動し,新生} 児 期^には成人値と ほ ぼ等し^いが 以後 急 速^に増 加し, 2

〜 4 歳 頃^には成人値^の2 ^〜 3 倍^に達し,1 0 歳以後^に成

人値^に戻る変 動^{の み}ら れ る血 清蛋 白^であ る^{. こ の} α 2‑^m

の加 齢^に伴な う 血清 濃度^の変 動は小 児期^の発育と 平行 し,成 長と密 接な関連を有す る と さ れ て^いる^{3 1 )}. そ^{こ で} 正常人^{に み}ら れ る血 清α 2^‑m 濃 度^の変 動が細 胞 性 免 疫 反応^にどのよ う な影 響を及ぼ すかを検 討す る目 的で phy tohe m ag glutinin (以下P H A と略) 刺激リン パ球

of H u m a n Se r a o n P h_{y t}ohe m ag glutinin

(^{P H A})^{‑Stim ulated L}y^m pho cy t^e Pr olife r atio n : Its R elatio n sh i_{p t}o S e r u m α2^‑M a c r oglobulin

C ｡ n C e ntr ati｡ n. Y ｡ Sh ih ir o O^shida_, D ep^{a r}tm e nt of Pediatric s (^{D ir e cto r : Pr of･ N ･ Ta ni‑}

g^{u c}hi),S ch o ol of M ed icin e , Ka n aza w a U ⁿiv e r sit y^･

2 押

増殖 性反応^に及 ぼ す 正常人 血清の影 響を年 齢 因^子につ

いて検 討す る と と もに_, 血 清 中 町 m 濃 度との関連^に

ついて検 討し た^.

ア ト ピ^ー 性 疾 患で は細 胞 性 免疫 能の低 下が報 告さ れ て お り^{3 8ト4 2)},ア ト ピ^ー型 気管 支 喘 息 患 者 血 清 中^にP H A 刺激リ^{ン パ}球 増 殖 性 反応を抑制す る因子^の存在を指 摘 す る報 告も あ る^{4 3)}. そこ で,ア ト ピ ^ー 型 気 管 支噛 息 患 者 血 清に^{つ い}て,P H A 刺 激リン パ球 増 殖 性 反 応^に及ぼ す

影響を同 年齢正常人血 清と 比較 検 討し た.

対 象およ び方法

1 . 対 象

0 ^〜75 歳の健 康正常 人2 7 5名と発 作 間歓 期で4 8時 間以 上 薬剤を服 用し ていないア ト ピ ^ー 型気 管 支喘 息 患 者1 0 0名よ り血 清を得た^. 年齢は以 下の如く^に区分し た^. Ⅰ群, 0 ^〜 5歳; ⅠⅠ群, 6 ^〜1 0歳: ⅠⅠⅠ群, 1 1^〜2 0 歳:ⅠⅤ群, 2 1^〜4 0 歳; Ⅴ群, 4 1 ^〜50 歳: ⅤⅠ群, 5 1^〜6 0 歳; ⅤⅠⅠ群, 6 1 ^〜7 5 歳.

2 ^. 被 検血清及 び標 準血清^の調 整

血 液 型や H L A 等^の個 体 差^によ る影 響を避け る た め^{7)2 7)},各年 齢 群の 5名の血 清を均 等^に混合し て被 検 血 清を作 製した,標 準 血 清と し^て2 5^〜3 5 歳の健 康 成人 1 5 名の血 清を均 等に混 合し て作 製し た^. 各 血 清は 5 6⁰C,

3 0分 間不清 化し1, ^‑_{2 0}⁰_{C に て保 存し た}

.

3 ^. リン パ球^の培 養 法

健 康 成人 よ り の ^{ヘ パ}リン加 末 梢 血をpho sphate

buffe r ed s alin e (P B S) にて希 釈 後, lym phophr ep 比 重 遠 心 法^にて分 離し, R P M I 1 64 0 培 養 液 (^{G I B C O},

Gr a nd Isla nd,N Y)^にて 1 ×10⁶/ml に調 整し たm o n o^‑ n u cle a r c ell を得た^. 1 ^×1 0⁵のc ell を 1 0 % 血 清を含む R P M I 1 64 0 培 養 液0^,2 ml に浮 遊 さ せ, P H A ‑ ^P (D ifc o Lab, U S A) を最終 濃 度が 3.O_JLg/ml,7.5_jLg/

mlにな る よ う^に添 加し, mi c r oplate 法に てtriplic ate で3 7⁰C,5 % C O2濃度で 7 2 時 間 培 養し た.培 養 終^{了 2 4} 時 間 前に tritiated thymi d in e (N e w Engln nd Nu cle a r_, Bo sto n, 以 下³H ^‑T d R と略) を 0^.2_/^̀Ci を 添 加した.培 養 終了後^に c ell ha rv e Ste r を用^いha r v e st し, 液 体^{シ ン}チ^レー シ ョンカ ウンタ ^ー で³Il‑ ^{T d R}の取 り 込 み を測 定し た^. c e11 viabilit y はtry pa n bule d_ye e x clu sio n によ り検 討し た.

4 . 血清^の分画

1) A mi c o n C F 5 0 A に よ る限外 濾 過

Amic o n C F 5 0 A (A mic o n Le xing to n, M a s s,

U S A) によ り Ⅰ, ⅠⅠ, ⅠⅠⅠ群の各血 清よ り分子量5 万 以 下の分画を得た. こ の分 画を 柑 A 3^.0_{〟 g}/ ml,各 血 清 10 % を 含む培 養 系^に2 0% ^に添 加し, リン パ球増 殖 性 反 応に及_{ぼ す}影 響を検討し た.

田

2) 硫 安 塩 析 法^{によ る}分画

Ⅰ ^‑ⅠⅤ群の各 血 清に硫 安 粉 末を攫拝し な が ら加え,

約3 0分 間 授拝 後,1 0,0 0 0rp^{m ,} 4⁰C,1 0 分 間 遠心^によ り, 0‑^{3.O M ま で 4} 段 階^に分 画し,各 分 画を Fr a ctio n

I(0 ^‑ 1.3 M), Fr a ctio nII(1^.3 ^‑1^.8 M), Fr a ctio n

III(1^.8 ^‑2 ^.4 M), Fr a ctio nI V (2^.4‑3^.O M) と し た.

各Fr a ctio n を P B S にて透 析 後,P H A 3.O_JLg/ml, 標 準血清10 % を含む培 養 系^に3 00J^Jg/ mlにな る よ うに添 加し た^.

5 .

α2

‑

m の測 定

免 疫 拡散 法 (パ ルチ ゲ^ン, ヘ キ^スト ジャ パ ン社) に よ り被検血清 中^の α 2^‑ m の濃 度を測 定し た.

6^･.

α2

‑

m の精 製

Ga n r ot ら^{3 8)}の方 法^に準じ精製し た^.

健 康 成人(2 5 ^‑3 5歳) 20 名よ り な る プ^{ー ル}血清1 0 0

mlに1 0 % 硫 酸デ キ^スト^{ラ ン}2^.O ml, 1 M M gC121 0 ml を加え, 1 0,0 0 0rpm , 4 ^OC, 1 5分 間遠 心にて リ ボ蛋白 質を除去し, 上清を 0.5 M N aC l を含む 0.0 5 M リ^ン 酸緩 衝 液 中で 2 4 時 間透 析し た^.透 析 後に硫 安 粉 末を攫 拝し な が ら加え, 2 M 濃 度^にし て 1 0,000 rpm , 4⁰C,

10 分 間遠心 し た.沈 漆を^{ベ ロ}ナ^ー ル横 衝 液 中で 4 8時間 透析し, 寒天電 気泳 動(pH 8 ^.6 ^{ベ ロ}ナ^{ー ル}緩 衝 液, 1 5 0

m A, 24 時 間) を行^った.

α‑globulin 分画 をpH 8.6,

0^･0 5 M ホウ酸ナ ト リ ウ^ム, 0.1 5 M NaCl 中^にて 2 4時 間 透 析 し て Sephade x G‑2 0 0 S F (P ha r m a cia,

Up ps ala) のカ ラム に通 し た( 綬 衝 液は_pH 8 ^.6, 0^.0 5 M ホウ酸ナ ト リ ウ^ム, 0.1 5 M N aCl). 第¹ 分画を ウ サ ギ抗^ヒト全 血 清及 び抗^ヒトα2‑^{m を 用いて}免 疫 電 気 泳動を行った^.抗^ヒト全血清及 び抗^ヒトα ｡‑^m と単 ^一の

沈降 線を作り,含有さ れ る 蛋白 質^{のすべて は} 勒‑^m で あ

った.

上記の寒天電 気 泳 動及 びgel fi1tr atio n によ り得ら れ た各 分 画を P H A 3^.0_{〟 g}/^ml, 標 準血清¹0 % を含む培 養 系^に5 0 0 〟g/ml の濃 度にな る よ う添 加し,精 製 町 m

も同 様に し て,5 0 0,2 5 0,12 5, 6 2^.5〟 g/ml の各 濃度^に な る よう添 加して P H A 刺 激リン パ球増 殖 性 反 応^に及ぼ す影 響を検 討し た. 尚, 蛋 白 濃度^の測 定^には Lo w ry の

方 法^{4 5=こ}拠った.

7 ^. 血清, 血清分画及 び精 製α 2^‑ m の P H A 刺 激 リ ン パ球 増 殖 性反応^に及ぼす影 響の表記 法 1) 血 清の影 響

% Re spo n s e( % ) ⁼ ( 被 検血清1 0% 加 培 養P H A 刺

激リ^{ン パ}球の^△ cpm) ^÷ ( 標 準 血 清^{1 0} % 加 培 養^{P H A} 刺 激リン パ球の△ _cp^m) ^×1 00

2) 血 清 分画 及び精製 α 2^‑ m の影 響

% Re spo n s e in l O % s e r u m も しくは% Re sp^{o n s e} in sta nda rd s e r u m と し て以 下の よ うに表 記し た.

P B A 刺 激リン パ球 増殖 性反応に及ぼ す 人 血清の影 響

i) % Re spo n s e in lO % s e r u m( % ) ⁼ ( 被検 血 清 1 0 % ⁺血 清 分 画 加 培 養P H A 刺 激リ^{ン パ}球の^{△ c}p^m

)^÷ ( 被 検 血 清1 0 % 加 培 養P H A 刺 激リン パ球の△ cpm) ^×1 0 0

ii) % Re spo n s eiⁿ sta nda rd s e r u m( % ) ⁼ ( 標 準 血 清1 0 % ^十血 清 分 画 加 培 養P H A 刺 激リン パ球の△ cpm) ^÷( 標 準 血 清¹0 % 加培 養P H A 刺激リ^{ン パ}球の△ Cpm) × 10 0

成 績

1 . 各 年齢 群血清^の P H A 刺 激リ^{ン パ}球 増 殖性反応

に及ぼ す影 響

Subop tim al do s e の P H A 濃度3^.O_JLg/^ml で は各年 齢 群 血 清の% Re spo n s e (M e a n ± 1 S D % ) は そ れ ぞ れ次の よ う で あった.Ⅰ群,6 5.9±1 4.8 ; ⅠⅠ群,8 5.6 ± 1 0^.5 : ⅠⅠⅠ群, 8 9^.1 ±1 6^.6;ⅠⅤ群, 1 0 6^.8±8 ^.7 ; Ⅴ群,

1 0 6.0±1 1.3 : ⅤⅠ群, 9 9.7±2 2.3 ; ⅥⅠ群, 6 9.6 ±1 8,4.

2 0 歳以下^のⅠ ^‑1ⅠⅠ群^の各血 清は成人者 血 清のⅠⅤ群^に比 し有意な反 応の低 下が み ら れ た(P <0 ^.0 1). 特に 5 歳 以下の Ⅰ群の血 清に著し^い反 応の低 下が み ら れ た.又,

6 1 歳以 上 の ⅤⅠⅠ群^の血 清^でも反 応^の低 下が み ら れ た( 図

Fig^. ト a

●

義

一

〜

● 伽

嘗

●

｡

†

｡

●

○

儀

を

き

=

釜･

÷

･

●●

●

●

●

了

●

●

●

●

工 Ⅱ Ⅱ工 二Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶエ

★ ★ ★ ★

A g^e Gr o up^S

3

1 ^{‑ a}). Op tim al do s e の P II A 濃 度7^.5_J^L_g/ ^ml で は 各 年 齢 群の血 清の P H A 刺 激リ^{ン パ}球 増殖 性反応^に及

ぼ す影 響^には有 意 差は み ら れ な^かった ( 図1 ^‑b).

ア ト ピ^ー 型 気 管 支 喘 息患 者血 清と 正常人 血 清と の 比 較で は P H A 刺 激リ^{ン パ}球 増 殖性 反 応^に及ぼ す影 響は

は有 意 差は み ら れ な かっ た( 図1 ^‑ a, 1 ^‑b).

2 ^. 血清 洩 度^の影響

Ⅰ, ⅠⅠ, ⅠⅠⅠ, ⅠⅤ, ⅥⅠ群の各血 清^{に つ い}て培 養 系の各 血 清 濃 度を 1 0, 20,3 0 % と増加し て P H A 刺 激リン パ

球 増 殖 性反 応^に及ぼ す血 清 濃度の影響を検 討し た. 結 果は 1 0% 血 清 濃 度^に対す る百分 率と して% Re spo n 父

i

n 1 0 % s e r u m( % ) と表 記し た. P H A 濃度3^.O_JLg/^ml で は全て の群の血 清で血 清 濃度^の増加^に伴な^い反 応の 低 下が み ら れ,特^に5歳 以 下の Ⅰ群と 6 1歳 以上^のⅥⅠ群 の血 清^に著し^い低 下が み ら れ た( 表1).P H A 濃 度7^.5 J^Lg/ ^ml で は血 清 濃度が 2 0, 30 % で の% Re spo n s ein

l O% s e r um(M e n n ± 1 S D % )は そ れ ぞ れ Ⅰ群(9 2.0 ± 1 2.1, 3 6^.9 ±4.8),ⅠⅤ群 (1 05^.0 ±1 1^.0, 7 0^.5 ±6^,8),

ⅤIl群 (8 2^.2 ±1 1^.1, 7 6^.1 ±2 3^.5) であり, 血 清濃 度^を 2 0% にし て も反応^の低 下は み ら れず血清 濃度を 3 0% と 増 加す る と Ⅰ群の血 清に のみ反 応の低 下が み ら れ た.

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工 Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ二 Ⅶ

A g^e Gr o u p^s F i_g.1‑ ^{a,1 ‑b. E 汗e ct of s e r u m fr o m e a ch age gr o u}p ^{o n} lym pho cy te p^{r o}life r atio n to s ubop tim al

do s e of P H A (3^.O F^Lg/ ml) [^{F ig. 1 ‑ a}] ^{a nd op tim a}l do s e of P H A (7^.5 _JLg/ ^ml)[^{F ig. 1 ‑b}] ^.

Sta nda rd s e r u m ⁼ 1 00% ^tr a n sfo r m atio n.Atop y(^○),N o n ^‑ atOp y(^●)^.*S igni丘c a ntlyd iffe r e ntfr o m age gr o upI V. Ba r r epr e s e nt m e a n v alu e.