巨大で複雑なゲノムを持つコムギとその近縁野生種のジェノタイピングにおけるRNA-Seqの活用

2020 年 2 月 3 日受理 連絡責任者：吉田健太郎（[email protected]）

巨大で複雑なゲノムを持つコムギとその近縁野生種のジェノタイピングにおける

RNA-Seq の活用

吉田健太郎

神戸大学大学院農学研究科（〒 657-8501 兵庫県神戸市灘区六甲台町 1 − 1） 要旨：シーケンサーの技術革新と生物情報学の発展によって，コムギとその野生近縁種の全ゲノムが解読され， 遺伝子情報が簡単に利用できるようになっている．本稿では，巨大で複雑なゲノムをコムギ連の種のゲノム解析 における難しさを概説し，この困難さを回避するための一手法である RNA シークエンスによるコムギ野生近縁種 におけるジェノタイピング研究の現状について紹介する． キーワード：ゲノム，コムギ，Aegilops，RNA-Seq，ジェノタイピング

1．はじめに

2005 年に国際イネゲノム塩基配列解読プロジェクトに よって，イネ品種「日本晴」のゲノムの解読が発表された のを皮切りに（IRGSP 2005），様々な作物種のゲノム配列 が決定されている．2012 年にコムギ連 Triticeae の中で初 めて，オオムギ （Hordeum vulgare L., 2n=2x=14, HH）のゲ ノ ム が 公 開 さ れ た（IBGSC 2012; Mascher et al. 2017）． 2014 年 に な っ て， パ ン コ ム ギ（Triticum aestivum L., 2n=6x=42, AABBDD）のドラフトゲノム配列が解読され （IWGSC 2014），更に 2018 年に染色体ごとにまとまったコ ムギのゲノム配列が解読された （IWGSC et al. 2018）．そし て，4 倍 体 コ ム ギ の デ ュ ラ ム コ ム ギ（T. turgidum L. ssp. durum Husn., 2n=4x=28, AABB） （Maccaferri et al. 2019）と 野 生 エ ン マ ー コ ム ギ T. turgidum ssp. dicoccoides Thell., 2n=4x=28, AABB）（Avni et al. 2017），パンコムギ成立に関 わった野生コムギ近縁種である一粒系コムギ（T. urartu Thum., 2n=2x=14, AA）（Ling et al. 2013; Ling et al. 2018）と タルホコムギ Aegilops tauschii Coss., 2n=2x=14, DD）（Jia et al. 2013; Luo et al. 2017; Zhao et al. 2017）についてもゲノム が解読された．また，10+ Wheat Genomes Project によって パンゲノムプロジェクトとして，新たなコムギ品種のゲノ ムも解読されつつあり，制限つきながらもこれらのゲノム データも利用できる （http://www.10wheatgenomes.com）．こ れらの快挙は，イルミナシーケンサーを代表とするこの最 近 10 年間におけるシーケンサーの技術革新と解析技術の 発展に依っている．コムギ連には，これらゲノムが決定さ れた種の他にも様々な近縁種が存在する．栽培種にない環 境ストレス耐性や病害虫抵抗性が報告されおり，他にも農 業的に有益な形質が眠っているとされ，有用な遺伝資源と して期待されている．一方，これらの近縁種においては， 遺伝的多様性と表現型の多様性について未解明な部分が多 く，連鎖地図やゲノム配列情報も不足している．しかし， 新たなシーケンサーの出現で，これらの野生近縁種でもゲ ノム網羅的な解析が出来るようになってきた．本稿では， イルミナシーケンサーによる野生コムギ近縁種におけるゲ ノム解析における課題と成果について紹介したい．

2．コムギとコムギ近縁野生種のゲノム解析における

課題

コムギ連のゲノムの特徴の一つに，ゲノムサイズの巨大 さがある．パンコムギは，異質 6 倍体であり AABBDD ゲ ノムを持つが，ABD を合わせたゲノムサイズは，およそ 16 Gbp で あ り，1 つ の ゲ ノ ム だ け で も 5Gbp 以 上 あ る （IWGSC et al. 2018）．シロイヌナズナのゲノムサイズ（0.13 Gbp）の約 38 倍，イネのゲノムサイズ（0.5 Gbp）の約 10 倍に相当する．染色体の大きさで考えると，シロイヌナズ ナの全ゲノムは，パンコムギの 1 本の染色体の短腕の一部 にあたるゲノムにしか過ぎず，イネの全ゲノムサイズは， パンコムギの 1 本の染色体長腕のゲノムにおよそ一致す る．イネでは，1Mbp あたりの遺伝子数は，101 個である のに対し，パンコムギでは，7 個である．このゲノムサイ ズ の 違 い は， 全 ゲ ノ ム 関 連 解 析 で 良 く 利 用 さ れ る Manhattan plots の見方にも影響与える．又，遺伝子のマッ プベースクローニングにいても，コムギの場合，2 Mbp ま で狭めることができれば，候補遺伝子が見えてくる． このパンコムギゲノムのほとんどがリピート配列からな る． 転 移 因 子 Transposable element （TE） の コ ピ ー 数 は， 400 万弱であり，その種類も 500 ファミリーに及ぶ．これ らの TE のゲノム占有率は，85% にもなり，TE の種類によっ てゲノム分布に違いが見られるものの，染色体全体に TE が存在する（Wicker et al. 2018）．もしイルミナシーケンサー を使用して，パンコムギのゲノム配列を読んだ場合，出力 されるリード配列のおよそ 85% のリード配列は，リピー ト配列からなることを意味する．TE 以外の遺伝子座領域 を解析する場合，これらのリピート配列は邪魔になる．ま た，ゲノムが巨大なため，全ゲノム配列をカバーするリー

総説

ド数を得るとなるとデータ量も増加し，多くの計算資源を 必要とする．これらは，交配集団，野生集団のジェノタイ ピングをする上での大きな障害となる．

3．ゲノム配列の複雑性と巨大さを回避する方法

イルミナシーケンサーから出力されたデータに基づくこ れまでに開発されたジェノタイピング手法を利用すること で，リピート配列によるゲノムの複雑性と巨大さによる ジェノタイピングの困難さを回避することができる．制限 酵 素 を 利 用 し た ゲ ノ ム を 間 引 く 手 法 の Restriction-site Associate DNA Sequencing（RAD-seq），エキソン領域に絞っ て解析するエキソームシークエンス，解析したい領域を標 的にする Single Nucleotide polymorphism（SNP）array，発 現している遺伝子だけの配列情報を得ることが可能な RNA シークエンス（RNA-Seq）を利用する方法がある （Scheben et al. 2017）．特に，リピート配列を回避し，遺伝 子座領域の DNA 多型を効率良く得るためには，エキソー ムシークエンス，SNP array，RNA-Seq が有効である．た だし，ゲノム配列が解読されていないコムギ野生近縁種を 対象とした場合，参照ゲノム配列があることが望ましいエ キソンシークエンスと SNP array の手法は難しい（Scheben et al. 2017）．RNA-Seq であれば，発現している遺伝子しか 解析できないという欠点はあるものの，参照ゲノム配列の 存在を前提しなくても DNA 多型情報が得られるという利 点がある．

4．RNA-Seq を用いた野生近縁種におけるゲノム

網羅的なジェノタイピング解析

我々は，これまでにイルミナシーケンサーの MiSeq に よる 300 bp 両側読みの RNA-Seq を活用し，コムギ 2 倍体 野生近縁種の種内の DNA 多型及び近縁野生種間の系統関 係を明らかにしてきた（Iehisa et al. 2012; Iehisa et al. 2014; Nishijima et al. 2016; Okada et al. 2018; Michikawa et al. 2019; Miki et al. 2019）．300 bp 両側読みにおいて，リード配列間 で重複できるようにシークエンスをすると，400-500 bp の 配 列 情 報 を 得 る こ と が で き，500 bp 前 後 の Expressed sequence tag（EST）に匹敵する DNA 配列情報を大量に得 ることができる（Sato et al. 2016； Tanaka et al. 2019）．

Ae. umbellulata Zhuk.（2n=2x=14, UU）は，U ゲノムを有 する野生 2 倍体種であり，ギリシャ，トルコ，イラク，イ ランにかけて分布する．さび病などの病害抵抗性遺伝子を 有し（Schachermayr et al. 1994），さらにデゥラムコムギと の交雑で合成コムギを作出することができ（Okada et al. 2017），新たな遺伝資源として期待されている．しかしな がら，遺伝的多様性と表現型の多様性について未解明な部 分が多く，連鎖地図やゲノム配列情報も不足している．こ のような種に対し，RNA-Seq のアプローチは，染色体を 網羅する SNPs 同定を可能にする．RNA-Seq のリード配列 から cDNA 配列を構築するツール（Trinity 等）が開発さ れており（Haas et al. 2013），ゲノム配列情報が無くても cDNA 配列を得ることができる．構築した Ae. umbellulata の cDNA 配列に Ae. umbellulata の系統から得られた RNA-Seq のリードをアライメントすることによって，SNP を得 ることができる．そして，cDNA を Ae. umbellulata の近縁 種でゲノムが解読されているタルホコムギとオオムギの物 理地図上に位置付けることで，染色体上の SNP の分布を 見ることができ，実際，SNP は，染色体全体にわたって 得られた（Okada et al. 2018）． また，パンコムギの A ゲノム提供親である T. urartu と A ゲノムに遺伝的に近い Am ゲノムを持つ T. monococcum L. ssp. monococcum（2n=2x=14, Am_Am ） と T. monococcum L. ssp. aegilopoides （2n=2x=14, Am_Am ）のジェノタイピングに は，パンコムギの A ゲノムのゲノム配列に RNA-Seq のリー ド配列をアライメントすることで SNP を得ることができ る（Michikawa et al. 2019）．さらに B ゲノムの提供親であ るとされるクサビコムギ Ae. speltoides Tausch（2n=2x=14, SS）をはじめとする S ゲノム種の進化的関係を明らかに する研究では，パンコムギの B ゲノムのゲノム配列に RNA-Seq のリード配列をアライメントし，SNP を検出し た（Miki et al. 2019）．いずれの方法でも染色体を網羅する SNP を得ることができる．

QTL-seq な ど の Bulk Segregant Analysis（BSA）（Takagi et al. 2013）を RNA-Seq を元に実施することも可能である （Trick et al. 2012; Ramirez-Gonzalez et al. 2015; Wu et al.

2018; Nishijima et al. 2018）．デュラムコムギとタルホコム ギの交雑で得られた合成パンコムギの中には，低温下でネ クロース症状を示す雑種生育異常が観察されている．遺伝 解 析 に よ っ て 原 因 遺 伝 子 で あ る Net2 を マ ッ ピ ン グ し， Net2 と連鎖する遺伝マーカーを得ている（Sakaguchi et al. 2016）．更に Net2 の領域を狭めるために，RNA-Seq BSA を実施した（Nishijima et al. 2018）．合成パンコムギの野生 型親と合成パンコムギの雑種生育異常を示す親を交雑し，

ヘテロの状態で維持し，F5世代で集団を作出した．Net2

をホモに持つ個体と持たない個体の RNA をバルクし， MiSeq による RNA-Seq を実施し，SNP index を計算した． その結果，2D 染色体に SNP index が高い領域を検出する ことができ，その SNP を遺伝マーカーとして使用し，マッ ピンングすることで，0.5 cM まで狭めることができてい る（Nishijima et al. 2018）．

5．おわりに

ゲノム配列が解読されていないコムギ近縁種の遺伝的多 様性の把握，ジェノタイピング，マッピングに RNA-Seq は有効である．ただし，遺伝子発現量が低いもしくは発現 していない遺伝子，遺伝子をコードしない領域のゲノム配 列情報を得ることができない．また，cDNA 配列をゼロか ら構築できるものの，イソフォームの取り扱いや 2 つの異

なる遺伝子が融合したキメラ配列を除去する必要があるな どフィルタリングの煩雑性がある．BSA においてもサン プル間の遺伝子発現量のばらつきがあるため，SNP index の値もゲノムシークエンスによる SNP index よりばらつき が多い．そのような弱点はあるものの，ゲノム網羅的に SNPs を特定することができ，解像度の高い進化系統解析， ゲノム解読されていない種でも新規遺伝マーカーを作出す ることが可能という多くの利点がある．そして，発現して いる遺伝子そのものを標的にしているので，表現型の原因 遺伝子に辿りつく可能性もゼロではない．ゲノムシークエ ンスのコストが下がり，解析手法も改善され計算資源の消 費量も少なりつつある．今後は，16 Gbp のゲノムサイズ であるパンコムギであってもゲノムシークエンスによる ジェノタイピングが普通になってくるだろう．そして，ゲ ノ ム シ ー ク エ ン ス に よ る BSA 解 析 MutMap（Abe et al. 2011）や QTL-seq（Takagi et al. 2013）をパンコムギに応用 することが簡便に行えるようになると思われる．

参考文献

Abe, A., S. Kosugi, K. Yoshida, S. Natsume, H. Takagi, H. Kanzaki, H. Matsumura, K. Yoshida, C. Mitsuoka, M. Tamiru, H. Innan, L. Cano, S. Kamoun and R. Terauchi（2012） Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap. Nat. Biotech. 30:174-178.

Avni, R., M. Nave, O. Barad, K. Baruch, S. O. Twardziok, H. Gundlach, I. Hale, M. Mascher, M. Spannagl, K. Wiebe, K. W. Jordan, G. Golan, J. Deek, B. Ben-zvi, G. Ben-zvi, A. Himmelbach, R. P. Maclachlan, A. G. Sharpe, T. Komatsuda, T. Eilam, H. Sela, A. Sharon, N. Ohad, C. J. Pozniak, E. D. Akhunov and A. Distelfeld（2017）Wild emmer genome architecture and diversity elucidate wheat evolution and domestication. Science 97:93-97.

Haas, B. J., A. Papanicolaou, M. Yassour, M. Grabherr, D. Philip, J. Bowden, M. B. Couger, D. Eccles, B. Li, M. D. Macmanes, M. Ott, J. Orvis, N. Pochet, F. Strozzi, N. Weeks, R. Westerman, T. William, C. N. Dewey, R. Henschel, R. D. Leduc, N. Friedman and A. Regev（2013）De Novo Transcript Sequence Recostruction from RNA-Seq: Reference Generation and Analysis with Trinity. Nat. Protoc. 8:1-43. Iehisa, J. C. M., A. Shimizu, K. Sato, S. Nasuda and S. Takumi

（2012）Discovery of high-confidence single nucleotide polymorphisms from large-scale de novo analysis of leaf transcripts of aegilops tauschii, a wild wheat progenitor. DNA Res. 19:487-497.

Iehisa, J. C. M., A. Shimizu, K. Sato, R. Nishijima, K. Sakaguchi, R. Matsuda, S. Nasuda, and S. Takumi（2014） Genome-wide marker development for the wheat D genome based on single nucleotide polymorphisms identified from transcripts in the wild wheat progenitor Aegilops tauschii.

Theor. Appl. Genet. 127:261-271.

International Barley Genome Sequencing Consortium（2012） A physical, genetic and functional sequence assembly of the barley genome. Nature 491:711-716.

International Wheat Genome Sequencing Consortium（2014） A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat（ Triticum aestivum ）genome Ancient hybridizations among the ancestral genomes of bread wheat. Science 345:1251788.

International Wheat Genome Sequencing Consortium（2018） Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. Science 361:eaar7191. International Rice Genome Sequencing Project（2005）The

map-based sequence of the rice genome. Nature 436:793-800. Jia, J., S. Zhao, X. Kong, Y. Li, G. Zhao, W. He, R. Appels, M.

Pfeifer, Y. Tao, X. Zhang, R. Jing, C. Zhang, Y. Ma, L. Gao, C. Gao, M. Spannagl, K. F. X. Mayer, D. Li, S. Pan, F. Zheng, Q. Hu, X. Xia, J. Li, Q. Liang, J. Chen, T. Wicker, C. Gou, H. Kuang, J. Wang, G. He, Y. Luo, B. Keller, Q. Xia, P. Lu, J. Wang, H. Zou, R. Zhang, J. Xu, J. Gao, C. Middleton, Z. Quan, G. Liu, J. Wang, H. Yang, X. Liu, Z. He and L. Mao （2013）Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a

gene repertoire for wheat adaptation. Nature, 496:91-95. Ling, H. Q., J. Wang, S. Zhao, D. Liu, J. Wang, H. Sun, C.

Zhang, H. Fan, D. Li, L. Dong, Y. Tao, C. Gao, H. Wu, Y. Li, Y. Cui, X. Guo, S. Zheng, B. Wang, K. Yu, Q. Liang, W. Yang, X. Lou, J. Chen, M. Feng, J. Jian, X. Zhang, G. Luo, Y. Jiang, J. Liu, Z. Wang, Y. Sha, B. Zhang, H. Wu, D. Tang, Q. Shen, P. Xue, S. Zou, X. Wang, X. Liu, F. Wang, Y. Yang, X. An, Z. Dong, K. Zhang, X. Zhang, M. C. Luo, J. Dvorak, Y. Tong, J. Wang, H. Yang, Z. Li, D. Wang and A. Zhang（2013）Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature 496:87-90.

Ling, H. Q., B. Ma, X. Shi, H. Liu, L. Dong, H. Sun, Y. Cao, Q. Gao, S. Zheng, Y. Li, Y. Yu, H. Du, M. Qi, Y. Li, H. Lu, H. Yu, Y. Cui, N. Wang, C. Chen, H. Wu, Y. Zhao, J. Zhang, Y. Li, W. Zhou, B. Zhang, W. Hu, M. J. T. Van Eijk, J. Tang, H. M. A. Witsenboer, S. Zhao, Z. Li, A. Zhang, D. Wang and C. Liang （2018）Genome sequence of the progenitor of wheat A

subgenome Triticum urartu. Nature 557:424-428.

Luo, M. C., Y. Q. Gu, D. Puiu, H. Wang, S. O. Twardziok, K. R. Deal, N. Huo, T. Zhu, L. Wang, Y. Wang, P. E. McGuire, S. Liu, H. Long, R. K. Ramasamy, J. C. Rodriguez, L. Van Sonny, L. Yuan, Z. Wang, Z. Xia, L. Xiao, O. D. Anderson, S. Ouyang, Y. Liang, A. V. Zimin, G. Pertea, P. Qi, J. L. Bennetzen, X. Dai, M. W. Dawson, H. G. Müller, K. Kugler, L. Rivarola-Duarte, M. Spannagl, K. F. X. Mayer, F. H. Lu, M. W. Bevan, P. Leroy, P. Li, F. M. You, Q. Sun, Z. Liu, E. Lyons, T. Wicker, S. L. Salzberg, K. M. Devos and J. Dvoák（2017） Genome sequence of the progenitor of the wheat D genome

Aegilops tauschii. Nature 551:498-502.

Maccaferri, M., N. S. Harris, S. O. Twardziok, R. K. Pasam, H. Gundlach, M. Spannagl, D. Ormanbekova, T. Lux, V. M. Prade, S. G. Milner, A. Himmelbach, M. Mascher, P. Bagnaresi, P. Faccioli, P. Cozzi, M. Lauria, B. Lazzari, A. Stella, A. Manconi, M. Gnocchi, M. Moscatelli, R. Avni, J. Deek, S. Biyiklioglu, E. Frascaroli, S. Corneti, S. Salvi, G. Sonnante, F. Desiderio, C. Marè, C. Crosatti, E. Mica, H. Özkan, B. Kilian, P. De Vita, D. Marone, R. Joukhadar, E. Mazzucotelli, D. Nigro, A. Gadaleta, S. Chao, J. D. Faris, A. T. O. Melo, M. Pumphrey, N. Pecchioni, L. Milanesi, K. Wiebe, J. Ens, R. P. MacLachlan, J. M. Clarke, A. G. Sharpe, C. S. Koh, K. Y. H. Liang, G. J. Taylor, R. Knox, H. Budak, A. M. Mastrangelo, S. S. Xu, N. Stein, I. Hale, A. Distelfeld, M. J. Hayden, R. Tuberosa, S. Walkowiak, K. F. X. Mayer, A. Ceriotti, C. J. Pozniak and L. Cattivelli（2019）Durum wheat genome highlights past domestication signatures and future improvement targets. Nat. Genet. 51:885-895.

Mascher, M., H. Gundlach, A. Himmelbach, S. Beier, S. O. Twardziok, T. Wicker, V. Radchuk, C. Dockter, P. E. Hedley, J. Russell, M. Bayer, L. Ramsay, H. Liu, G. Haberer, X. Q. Zhang, Q. Zhang, R. A. Barrero, L. Li, S. Taudien, M. Groth, M. Felder, A. Hastie, H. Šimková, H. Stanková, J. Vrána, S. Chan, M. Munõz-Amatriaín, R. Ounit, S. Wanamaker, D. Bolser, C. Colmsee, T. Schmutzer, L. Aliyeva-Schnorr, S. Grasso, J. Tanskanen, A. Chailyan, D. Sampath, D. Heavens, L. Clissold, S. Cao, B. Chapman, F. Dai, Y. Han, H. Li, X. Li, C. Lin, J. K. McCooke, C. Tan, P. Wang, S. Wang, S. Yin, G. Zhou, J. A. Poland, M. I. Bellgard, L. Borisjuk, A. Houben, J. Doleael, S. Ayling, S. Lonardi, P. Kersey, P. Langridge, G. J. Muehlbauer, M. D. Clark, M. Caccamo, A. H. Schulman, K. F. X. Mayer, M. Platzer, T. J. Close, U. Scholz, M. Hansson, G. Zhang, I. Braumann, M. Spannagl, C. Li, R. Waugh, and N. Stein（2017）A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature 544:427-433.

Michikawa, A., K. Yoshida, M. Okada, K. Sato and S. Takumi （2019）Genome-wide polymorphisms from RNA-Sequencing

assembly of leaf transcripts facilitate phylogenetic analysis and molecular marker development in wild einkorn wheat. Mol. Genet. Genomics 294:1327-1341.

Miki, Y., K. Yoshida, N. Mizuno, S. Nasuda, K. Sato and S. Takumi（2019）Origin of wheat B-genome chromosomes inferred from RNA-Sequencing analysis of leaf transcripts from section Sitopsis species of Aegilops. DNA Res. 26:171-182.

Nishijima, R., K. Yoshida, Y. Motoi, K. Sato and S. Takumi （2016）Genome-wide identifi cation of novel genetic markers

from RNA-Sequencing assembly of diverse Aegilops tauschii accessions. Mol. Genet. Genomics 291:1681-1694.

Nishijima, R., K. Yoshida, K. Sakaguchi, S. I. Yoshimura, K.

Sato and S. Takumi（2018）RNA-Sequencing-based bulked segregant analysis facilitates efficient D-genome marker development for a specifi c chromosomal region of synthetic hexaploid wheat. Int. J. Mol. Sci. 19:1-13.

Okada, M., K. Yoshida and S. Takumi（2017）Hybrid incompatibilities in interspecific crosses between tetraploid wheat and its wild diploid relative Aegilops umbellulata. Plant Mol. Biol. 95:625-645.

Okada, M., K. Yoshida, R. Nishijima, A. Michikawa, Y. Motoi, K. Sato and S. Takumi（2018）RNA-Seq analysis reveals considerable genetic diversity and provides genetic markers saturating all chromosomes in the diploid wild wheat relative Aegilops umbellulata. BMC Plant Biol. 18:1-13.

Ramirez-Gonzalez, R. H., V. Segovia, N. Bird, P. Fenwick, S. Holdgate, S. Berry, P. Jack, M. Caccamo and C. Uauy（2015） RNA-Seq bulked segregant analysis enables the identifi cation of high-resolution genetic markers for breeding in hexaploid wheat. Plant Biotechnol. J. 13:613-624.

Sakaguchi, K., R. Nishijima, J. C. M. Iehisa and S. Takumi （2016）Fine mapping and genetic association analysis of

Net2, the causative D-genome locus of low temperature-induced hybrid necrosis in interspecific crosses between tetraploid wheat and Aegilops tauschii. Genetica, 144:523-533.

Sato, K., T. Tanaka, S. Shigenobu, Y. Motoi, J. Wu and T. Itoh （2015）Improvement of barley genome annotations by

deciphering the Haruna Nijo genome. DNA Research, 23:21-28.

Schachermayr, G., H. Siedler, M. D. Gale, H. Winzeler, M. Winzeler and B. Keller（1994）Identification and localization of molecular markers linked to the Lr9 leaf rust resistance gene of wheat. Theor. Appl. Genet. 88:110-115. Scheben, A., J. Batley and D.

Edwards（2017）Genotyping-by-sequencing approaches to characterize crop genomes: choosing the right tool for the right application. Plant Biotechnol. J. 15:149-161.

Takagi, H., A. Abe, K. Yoshida, S. Kosugi, S. Natsume, C. Mitsuoka, A. Uemura, H. Utsushi, M. Tamiru, S. Takuno, H. Innan, L. M. Cano, S. Kamoun and R. Terauchi.（2013） QTL-seq: Rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant J. 74:174-183.

Tanaka, T., G. Ishikawa, E. Ogiso-Tanaka, T. Yanagisawa and K. Sato（2019）Development of genome-wide SNP markers for barley via reference- Based RNA-Seq analysis. Front. Plant Sci. 10:1-9.

Trick, M., N. M. Adamski, S. G. Mugford, C. C. Jiang, M. Febrer and C. Uauy（2012）Combining SNP discovery from next-generation sequencing data with bulked segregant analysis（BSA）to fi ne-map genes in polyploid wheat. BMC

Plant Biol. 12:14.

Tsunewaki, K.（2009）Plasmon analysis in the Triticum-Aegilops complex. Breed. Sci. 59:455-470.

Wicker, T., H. Gundlach, M. Spannagl, C. Uauy, P. Borrill, R. H. Ramírez-González, R. De Oliveira, K. F. X. Mayer, E. Paux and F. Choulet（2018）Impact of transposable elements on genome structure and evolution in bread wheat. Genome Biol. 19:1-18.

Wu, P., J. Xie, J. Hu, D. Qiu, Z. Liu, J. Li, M. Li, H. Zhang, L.

Yang, H. Liu, Y. Zhou, Z. Zhang and H. Li（2018） Development of molecular markers linked to powdery mildew resistance gene Pm4b by combining SNP discovery from transcriptome sequencing data with bulked segregant analysis （BSR-Seq）in wheat. Front. Plant Sci. 9:1-12.

Zhao, G., C. Zou, K. Li, K. Wang, T. Li, L. Gao, X. Zhang, H. Wang, Z. Yang, X. Liu, W. Jiang, L. Mao, X. Kong, Y. Jiao and J. Jia（2017）The Aegilops tauschii genome reveals multiple impacts of transposons. Nat. Plants 3:946-955.

RNA-Seq Enables Effi cient Genotyping of Wheat and Its Wild Relatives That

Have Large and Complex Genomes

Kentaro Yoshida

Graduate School of Agricultural Science, Kobe University（1-1, Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, Hyogo, Japan）

Summary：Advances in sequencing technology and bioinformatic analyses enable the whole genomes of wheat and their

wild ancestors to be decoded, making it easier to access full DNA sequence information that was previously fragmentary. This paper outlines diffi culties in genome analysis of large and complex genomes in wheat species and presents the current status of genotyping research in wild relatives of wheat by RNA-Seq, a technique to avoid these diffi culties.

Key Words：genome, wheat, Aegilops, RNA-Seq, genotyping

Journal of Crop Research 65: 67-71 （2020） Correspondence: Kentaro Yoshida（[email protected]）