満 細 胞 系 か ら放 出 され る
12
0
0
全文
(2) 584. 津. 田. L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide. (S-2238),. benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide - 2222),. thrombin,. Stockholm,. Factor. (S. Xa. (AB. Kabi,. Sweden), calcium ionophore. (Ca-ionophore. A23187), chondroitin. type. A (whale cartilage),. type. B (porcine. type. C (shark. chondroitin. skin),. chondroitin. cartilage),. porcine. elastase,. Chemical. IgE. sulfate. 2)放. (Behringwerke haparinase, lyase(生. phenol(半 6000. 井 化 学 薬 品),. (PEG)(石. Fine Chemicals,. RPMI-1640, Island 2.方. fetal. calf. Biological. Uppsale,. serum. 23187を. 400. N Y).. 法. 1)ヒ. 加 え, 37℃,. 添 加 し, 37℃,. 肺 癌 患 者 の 外 科 的 切 除 肺 の う ち,肉. Ca2+, Mg2+‑free. Tyrode緩. 衝 液(pH. と 略 す)に 浮 遊 させ 重 量 計 測 後,. 眼 的 にお ち に. 7.4, CMFT. 検 体 を500g,. A23187で. 5分 間 遠 沈 して,上. 沈 渣 に 分 離 した.残. を2 特 異 的刺 A. 刺 激 され た 清 と細 胞 成 分. 存 す るhistamine,. substanceや. 出 す る た め に,細. heparin,. 他 のGAGを. 抽. 胞 成 分 沈 渣 を1mlのCMFT. papain,. DNAase,. collagenase,. 5分 間 遠 沈 して その 上 清 を 回 収 した.そ. れ ぞ れ の 上 清 及 び 細 胞 成 分 沈 渣 抽 出 液 を分 離 し た後,抗 凝 固 活 性, metachromatic histamineの. Caulfieldら. 方 法5)に 従 い,細 切 処 理 及 びpronase,. の. chymo. elastaseに. 測 定 ま で‑70℃. 3)分. 析方法. i)抗. 凝 固活 性 の測 定. 性(anti‑thrombin活. ら に 前 田 の 変 法6)を. Xa. (Percoll原. 液: 1.5M. 用 い て, Percoll等 NaCl=9:1)に. よる連 続 密. 度 勾 配 に て 比 重 遠 心 分 離 を 行 な い,マ ー ジ を除 くた め に. , 10%. cells/mlと. の5mlを, 夜 放 置 後,使. クロ フ ァ. な る よ う に 再 浮 遊 さ せ,そ. 2〜3mlのFCSで 用 前 にCFMTで. 覆 い4℃,一. CO2:. 95. 60分 間 培 養 後,非 接 着 細 胞 を 回. 酸 球 同 時 直 接 算 定 液7)の2倍. heparin様. 村 らの好 塩 基 希釈 液 で 染. 活. 性 と略 す)及 びanti‑Factor. 活 性(anti‑FXa活. 性 と略 す)と. して 測 定 した. anti‑thrombin活 性 は,検 体 に 一 定 量 のthrombinを 添 加 し ,検 体 のheparin. 量 は,発. IIIを 介 して 阻 害 されるthrombin. 色 合 成 基 質S‑2238を. その 吸 光 度 よ り測 定 した.す. 存thrombin. 用 い て 発 色 さ せ, な わ ちLasserら. 方 法8)に 準 じ, 20μlの 検 体 と20μlのAT U/ml)と460μlのTris緩 8mM. 収 して 単 離 肥 満 細 胞 を得 た. 回 収 さ れ た 単 離 肥 満 細 胞 は,木. に て 保 存 し た.. 量 を測 定 す る こ と に よ り求 め た.残 昼. 洗 浄 した プ ラ ス れ を5%. heparin様. 様 活 性 に よ りAT. FCS加RPMI‑1640に. チ ックシ ャー レ に 分 取 した.こ airで37℃,. 張液. substance,. 抗 凝 固 活 性 は, anti‑thrombin. よ. る 酵 素 処 理 を 行 な っ て 単 離 細 胞 を 回 収 し た,さ. 球‑好. 30分 間 加 温 し. 20分 間 加 温 した. Anti. びCa‑ionophore. 500g,. よ そ 正 常 と思 わ れ る部 分 約10‑20gを,直. %. 2. 濃度. に 再 浮 遊 させ て 凍 結 融 解 を6回 繰 り返 した 後,. ト肺 単 離 肥 満 細 胞 の 分 離. 107‑108. 洗 浄 し,. 衝 液 に 再 浮 遊 させ,非. metachromatic. (Grand. Island,. 胞 を3回. た 精 製 さ れ た 肥 満 細 胞 約5×106個. mlのTyrode緩. ‑IgE及. Sweden),. (FCS). Co., Grand. 濃 度1,000U/ml 2時 間 受 身 感 作 を. 激 剤 と して終 濃 度1μg/mlのCa‑ionophore. glycol Ficoll. レル ギ ー 患者. 衝 液 に 再 浮 遊 させ た後,終. 1/25のAnti‑IgEを. octylamine,. Percoll,. 清 を,終. 身 感 作 後,細. mlのTyrode緩. West Germany),. polyethylene. 津 製 薬),. (Pharmacia. 行 な っ た.受. た.ま. を2mlの. 衝 液 に 再 浮 遊 さ せ,ア. と な る よ う に添 加 し, 37℃,. albumin. Azure‑A,. あ っ た.. か ら採 取 した 高IgE血. ABC lyase, chondroitin. 化 学 工 業),. n=7)で. 出 反応 実 験. Tyrode緩. (Anti-IgE),. AG, Marburg,. chondroitin. n=7)でpurityは20.1±3.3%. 精 製 さ れ た 肥 満 細 胞 約5×106個. sulfate. serum. 算 盤 に て肥 満 細 胞. 回 収 肥 満 細 胞 数 を算 出 した.得. ら れ た肥 満 細 胞 の 絶 対 数 は, (1.00±0.31)×107. (mean±se,. pronase, (DNAase),. serum. 数 を 算 定 し,総. sulfate. Co., St. Louis, MO) rabbit. anti-human. AC. bovine. 色 後, Fuchs‑Rosenthal計. A23187. intestinal. polymethobromide (Polybrene), chymopapain, deoxyribonuclease. (Sigma. 史. 個(mean±se,. heparin, 1,5-dimethyl-1, 5-diazaundecamethylene. collagenase,. 隆. EDTA,. を, 37℃, (4U/ml)を. pH. 衝 液(0.2M 8.4)を. 混 合 し,そ. の III(1. Tris+ の100μl. 2分 間 加 温 し, 100μlのthrombin 加 え, 37℃,. 5分 間加 温 の後, 100μlの.
(3) ヒ ト好 塩 基 球‑肥. 図1. Tris緩. anti‑thrombin活. A:. anti‑thrombin活. B:. anti‑Factor. 性 測 定 法 とanti‑Factor. 加 え, 37℃,. Xa活. 5分 間 加 温 後,. 200μlの. 準 曲 線 はporcine. intestinal. 様 に 一 定 量 のFactor. 検 体 のheparin様. め た.残. Xaを. 活 性 に よ りAT. 害 され るFactor. Xa量. 存Factor. を用 い て 発 色 さ せ,そ. は 発 色 合 成 基 質S‑2222. の 吸 光 度 よ り測 定 し た.. す な わ ち, 25μlの 検 体 と75μlのAT ml)と150μlのTris緩 EDTA,. 衝 液(0.2M. pH 8.4)を. Factor. Xa(7M. 間 加 温 し,さ. Kat/ml)を. Tris+8mM. 加 え, 37℃,. 停 止 し,そ の 吸 光 度 を405nmで 曲 線 はporcine. B).標. 定 した,ま. た 検 体 のanti‑thrombin活. FXa活. 6分. intestinal. 算 した 値 で 示 し, anti‑thrombin活 及 びanti‑FXa活 に よ り求 め た.. 性 遊 離 率(%)は. 性. 準. 0〜0.1 相 関係 数 を. 性 とanti‑ heparinに. 胞 成 分 沈 渣 のanti‑thrombin活 又 はanti‑FXa活 性. ii) histamineの. 性. histamineの. 測定 測 定 は, Shoreら. じて 行 な っ た.す. な わ ち,放. れ た 検 体 をTyrode緩 し, 0.4N過. ×100. の 方 法9)に. 準. 出反 応 実験 で得 ら. 衝 液 を加 えて 全 量1mlと. 塩 素 酸1mlを. 加 え, 4℃,. 2,200g,. 20分 間 遠 沈 し,そ の上 清 のhistamineをTechnicon Corp.,. Tarrytown,. N Y)の. 出 液 を測 定 し,自 然 遊 離 を補 正 し て次 式 に よ り 求 め た.. 準 曲線 は と もに実験 ご とに設. 性 はporcine. 性/. 性 又 はanti‑FXa活. histamine遊. 酸 で反 応 を. intestinal heparinを,. 間 で 作 製 し, r=‑0.995の. 性 又 はanti‑FXa活. 上 清 のanti‑thrombin活. 自 動 分 析 装 置 に て 測 定 した10). histamineは,. 測 定 した.標. 得 た(図1,. 上 清 のanti‑tlrombin活. 放 出 反 応 実 験 で 得 ら れ た 上 清 と細 胞 成 分 沈 渣 抽. 衝 液 を加 え, 37. 200μlの50%酢. 性 遊 離 率(%) 性 遊 離 率(%)=. 社(Technicon. ら に100μlの 発 色 合 成 基 質S‑2222. 10分 間 加 温 後,. U/mlの. III(1U/. 混 合 し,そ の100μlに50μlの. (1.5mg/ml)と100μlのTris緩 ℃,. 添 加 し,. IIIを 介 して 阻. を測 定 す る こ と に よ り求. Xa量. 性 測 定 法 の標 準 曲線. anti‑thrombin活 又 はanti‑FXa活. +細. heparinを, 0〜0.12U/mlの 間 で 作 製 し, r= ‑0 .995の 相 関 係 数 を得 た(図1, A). anti‑FXa 活 性 は,同. Xa活. 585. 性 の標 準 曲 線. 酸 で 反 応 を停 止 し,そ の 吸 光 度 を405nm. で 測 定 した.標. 抗 凝 固 活 性 に 関 す る研 究. 性の標準曲線. 衝 液 と100μlの 発 色 合 成 基 質S‑2238(075. mM)を 50%酢. 満 細 胞 系 か ら放 出 さ れ るproteoglycanの. 換. 性 遊 離 率(%) それ ぞれ次 式. 離 率(%)= 上 清 のhistamine含. 量/. ×100. 上 清 のhistamine含 量 +細 胞 成 分 沈 渣 のhistamine含 iii) metachromatic metachromatic. substanceの substanceの. らの 方 法11)とParekhら Azure‑Aを. 量 測定. 測 定 は, Jaques. の 方 法12)を 改 変 し て,. 用 い て行 な っ た.す. なわ ち,放 出 反. 応 実 験 で 得 られ た 検 体 を 生 理 的 食 塩 水 に て1ml に し, 80%フ. ェノ ール を2ml加. 〜12時 間 静 置 し. , 3,000g,. え,室. 温 に て10. 20分 間 遠 沈 後 上 層 を.
(4) 586. 津. 分 取 して 除 蛋 白 を 行 っ た.こ ル で2回 amine 後,. れ を2mlの. 洗 浄 後 そ の200μlに250μlの7%. hydrochloride(pH. 3,000g,. の0.1N. 7.0‑8.5)を. 20分 間 遠 沈 した.上. NaOHと1mlの. HCl,. エーテ. のGAG分. lyase, chondroitin. 加 え2分. buffer. V). heparinを0〜0.2U/mlの. saline,. thrombin活. stance遊. metachromatic. たmetachromatic. substance遊. 性 を測 定 した.す. Tris, 0.15M 0.001%. 性 を測 定. な わ ち, 40μlの 検. EDTA,. と4μg/ml. NaCl,. bovine. Polybreneを. 0.1%. serum. PEG,. albumin. 含 む もの と 含 ま な い も. の)を 混 合 し,そ の100μlに50μlのthrombin(8 sub. U/ml)を. 加 え, 37℃,. 5分 間 加 温 した.こ. れに. 100μlの 発 色 合 成 基 質S‑2238(0.75mM)と100. 離 率(%)=. μlのTris‑NaCl緩. substance/. 上 清 のmetachromatic細 substance+metachromatic. 6時 間. 存 在 下 で のanti‑. 8mM. 次 式 に よ り求 め た.. 上 清 のmetachromatic. ABC. 37℃,. 影響 存 在,非. 緩 衝 液(0.02M. intestinal. 間 で 作 製 し た.標. 離 率(%)は. chondroitin. lyase)と,. 体 と20μlの 正 常 プ ール 血 漿 と440μlのTris‑NaCl. 準 曲 線 は 実 験 ご と に 設 定 し,測 定 は600nmの 吸 光 度 で 行 な っ た.ま. Polybreneの Polybreneの. 30分 間 遠 沈 して こ れ. 準 曲 線 はporcine. AC. した.. 330μlの 蒸 留 水 を加 え 室 温. に て1時 間 静 置 後, 3,500g,. 解 酵 素(heparinase,. 加 温 後 直 ち に 氷 冷 し, anti‑thrombin活. 清 除 去 後35μl. 50μlのphosphate. 史. octyl. の 操 作 を2回 繰 り返 し, 35μl. 0.005%のAzure‑A,. を測 定 した.標. 隆. エ ー テ ル を加 え, 70℃,. 10分 間 静 置 した.こ の0.1N. 田. 加 温 後,. ×100. 衝 液 を加 え, 37℃,. 200μlの50%酢. 15分 間. 酸 で 反 応 を停 止 し, 500g,. 5分 間 遠 沈 して その 上 清 の 吸 光 度 を405nmで. 胞 成 分 沈 渣 の. 測. 定 した.. substance. iv) glycosaminoglycan(GAG)分. 解酵素の影. 結. 果. 響 放 出 反 応 実 験 に おい て,受. 1.. 身 感 作 後anti‑IgE. Anti‑IgEお. よ びCa‑ionophore. A23187. で 刺 激 さ れ た 肥 満 細 胞 か ら上 清 中 に放 出 さ れ た. 刺 激 に よ り ヒ ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ る. 物 質 に 対 す るGAG分. 抗 凝 固 活 性, metachromatic. 解 酵 素 の 影 響 を検 討 した.. す な わ ち, 300μlの 検 体 と, 200μlの0.05M HCl緩. 衝 液(0.1M. albuminを. 表1. NaCl,. 含 む, pH. 0.1%. 7.0)を300μlの. Anti‑IgEお. Not. serum. determined.. 1)ヒ. 性 とanti‑Factor. A23187で Xa活. substance,. ついて. ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ る抗 凝 固 活 性 に つ い て(表1,. 各 種濃 度. よびCa‑ionophore. anti‑thrombin活. ND:. bovine. histamineに. Tris‑. 2). 刺 激 し た 時 の ヒ ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 され た 性.
(5) ヒト好 塩 基 球‑肥 表2. 満 細 胞 系 か ら放 出 さ れ るproteoglycanの. Anti‑IgEお. よ びCa‑ionophore. A23187で. 細 胞 よ り放 出 され たanti‑thrombin活 histamineの. •~•}. Anti‑IgEお. release=. se:. 刺 激 し た 時 に ヒ ト肺 肥 満 metachromatic. substance,. content. / supernatant+sediment. mean•}standard. content. •~ 100. error. よ びCa‑ionophore. A23187で. IgEで. 刺 激 した時のanti‑thrombin活. 刺 激 され肥 満 細 胞 か ら放 出 され たanti‑thrombin. FX. 活 性 とanti‑FX. 〜45 .8%(33.3±5.8%,. a活 性 は,細 胞 数5×106個. りの 活 性 値 と,上 清 中(released)の. あた. 活 性 と細 胞. 性 とanti‑. a活 性 を 示 す が, anti‑thrombin活. 2),. anti‑FX. mean±Se,. 成 分 沈 渣 抽 出 液 中(residual)の. 活 性 よ り求 め た. た.検. 体1〜4はAnti. 激 した 時 のanti‑thrombin活 ‑35. 体5,. .7%が. 性 は19.4 n=4)(表. a活 性 は20.0〜36.2%が. 遊 離 率(%)の. 両 者 を示 した,検. 587. 遊離率. supernatant percent. 性,. 抗 凝 固 活 性 に関 す る研 究. 6はCa‑ionophore. 検 出 され A23187で. 刺. 性 を 示 す が, 28.8. 検 出 さ れ た(表2).検. 体7は,非. 激 時 の 肥 満 細 胞 中 のanti‑thrombin活. 刺. 性 を示 す. が, 0.113U/5×106個. の 活 性 が 検 出 さ れ た.. 2). substanceとhistamine. metachromatic に つ い て(表2). 上 清 と 細 胞 成 分 沈 渣 抽 出 液 のAzure‑Aに. 対. す る染 色 性 より肥 満 細 胞 か らのmetachromatic substanceの. 遊 離 を測 定 した. Anti‑IgEで. 激 した 時 の遊 離 率 は32.6±9.4%, A23187で. ら れ た.ま. substanceの. た 同 様 にhistamineの. ると, Anti‑IgEで 5.1%で,. 3)放 活性 とmetachromatic anti‑thrombin活. substanceと. の相関. 性 とmetachromatic. は肥 満細 胞5×106個 ○ ●: anti‑IgEで. substance. あ た りの 値 を示 す. 刺 激 され た 時 を示 す. ◇ ◆: Ca‑ionophore. A23187で 刺 激 された時 を示 す. ○ ◇: 刺 激 後 ヒ ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ た上 清 中 の 活性 を示 す. Ca‑ionophore. ● ◆: 刺 激 後 ヒ ト肺 肥 満 細 胞 沈 渣 抽 出 液 中 の 活 性 を示 す. 遊 離 を測 定 す. A23187で. 刺 激 した 時. あ っ た.. 出 され たanti‑thrombin活 chromatic. stanceと. 性 とmeta. substanceの. 測 定 可 能 で あった 検 体1, anti‑thrombin活. 相 関 につ い て(図2) 2,. 3,. 5に. sub. の 関 係 を検 討 して み る と,両. で 有 意 水 準10%に. つ い て,. 性 とmetachromatic. は相 関 係 数r=0.68(回. 2.放. 遊 離 が認 め. 刺 激 した 時 の 遊 離 率 は11.2±. の 遊 離 率 は14.7%で. ヒト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ たanti‑thrombin. Ca‑ionophore. 刺 激 した 時 の 遊 離 率 は35.9‑50%で,. 共 にmetachromatic. 図2. 刺. 者の間に. 帰 直 線y=7.0x+0.17). て 相 関 関 係 が 認 め ら れ た.. 出 さ れ たanti‑thrombin活 物 質 の 性 状 に 関 す る検 討. 性 を有 す る.
(6) 588. 津. 図3. 市 販 のheparin及. びchondroitin. 田. sulfate. 隆. type. 史. A, type. B, type. Cのanti‑thrombin. 活 性 測 定 法 に対 す る影 響 A:. 精 製AT. B:. 正 常 プ ー ル 血 漿 を用 い た 場 合. IIIを 用 い た 場 合. 受 身 感 作 さ れAnti‑IgEで. 刺 激 され た肥 満細. 胞 か ら 上 清 中 に 放 出 され るanti‑thrombin活 の 性 状 を 検 体4を 1). chondroitin (dermatan. 性. 用 い て 検 討 した. sulfate. A,. Cの. type. のchondroitin. sulfate type. A, type. した 場 合(図3,. A), porcine. で は0.1〜10μg/mlす thrombin活 sulfate. り に 正 常 プ ー ル 血 漿 を 使 用 し た.. B, type. intestinal. A, type. 方AT. heparinで. heparin. か し, chondroitin. B, type. 性 は検出 さ. はAT. B), porcine. IIIを 使 用 し た と き と. 同 様 に0.1〜10μg/mlでanti‑thrombin活 示 した が, chondroitin 〜10mg/mlで. sulfate type. か しchondroitin. type. は,高. type. か わ ら ず,こ. 性 を Bで は0.1. 濃 度 依 存 的 にanti‑thrombin活. 性 が 検 出 さ れ た.し A,. in. Cで. sulfate. の 測 定 系 で はanti‑thrombin活. は 検 出 さ れ な か っ た.そ. こ で,以. 1.25U/ml,. heparinあ. 検 体,お. 性. 下 の肥 満細 胞. る い はchondroitin. 37℃,. した(図4, rinaseの. 6時. sulfate. 性 をS‑2238を A).肥. intestinal. 間 加 温 し た 後 に,そ. 上 で量 依存. 性 の 消 失 が み ら れ た.ま. intestinal. heparinで. はheparinase. の 終 濃 度12.5U/mlでanti‑thrombin活 失 が み ら れ た.一. sulfate. type. 性 に はheparinaseは. 度1.25×10‑3U/ml,. lyaseとchondroitin Bに. 影. に 同 様 の 測 定 系 に終 濃. 1.25×10‑2U/ml,. 1.25U/ml,. さ せ る と,図4,. 性 の 消. 方chondroitin. Bのanti‑thrombin活. 10‑1U/ml,. B. 用 いて吸 光 度 で 測定. 終 濃 度1.25×10‑2U/ml以. たporcine. type のanti‑. 満 細 胞 由 来 の 検 体 で は, hepa. 的 にanti‑thrombin活. ABC. か わ. 12.5U/mlの. よ びporcine. 響 を あ た え な か っ た.次. 濃 度 を使 用 した に も か. IIIの. 1.25×10‑2U/ml,. 1.25×10‑1U/ml, heparinaseを. と,. AT. 解 酵 素 の 影 響(図4). 終 濃 度1.25×10‑3U/ml,. thrombin活. Cで は その1,000. IIIの か わ り に 正 常 プ ー ル. 血 漿 を使 用 した 場 合 に は(図3, testinal. C. III存 在 下 で 測 定. 倍 量 を 使 用 してもanti‑thrombin活 れ な か った.一. 2)GAG分. 販. sulfate 常 プー ル 血 漿. の 使 用 が 適 切 と 考 え ら れ た の で,. な わ ち0.01〜1U/mlでanlti‑. 性 を示 した.し. type. 可 能 性 も 考 慮 に 入 れ,正. B. 性 の 測 定 前 に,市. の 抗 凝 固 活 性 を測 定 した. AT. Bの. 抗凝 固活 性. の 測 定 系 に 対 す る 影 響 につ い て(図3) 検 体 のallti‑thrombin活. 性 を 有 す る物. 質 の 性 状 に 関 す る 実 験 で はchondroitin type. type. sulfate), type. よ り放 出 さ れ るanti‑thrombin活. 1.25×. 12.5U/mlのchondroitin AC. lyaseを. 示 す よ う にchondroitin. 反応.
(7) ヒト好 塩 基 球‑肥. 図4. Anti‑IgEで. ABC. lyase,. B:. chondroitin. heparinase,. ●‑●:. anti‑IgE刺. ○‑‑‑‑‑‑○:. porcine. ◇‑◇:. chondroitin. 図5. chondroitin ABC. AC. intestinal. lyase,. heparin. sulfate. Anti‑IgEで. A:. porcine. B:. anti‑IgE刺. B (porcine. 性 に 対 す るheparinase,. 影響. chondroitin. AC. lyase. 上 清 を検 体 と した場 合. skin)(1mg/ml). 刺 激 した 時 に ヒ ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ るanti‑thrombin. intestinal. 影響. heparin. (0.1U/ml). 激 後 ヒ ト肺 肥 満 細 胞(5×106/ml)の. polybrene非. 存在下. ●‑‑‑‑‑‑●:. polybrene存. 在下. intestinal heparinあ. は肥 満 細 胞 由 来 の検 体 のanti‑thrombin活 は影 響 を あ た えな か った が, chondroitin type Bのanti‑thrombin活. C:. 589. (1μg/ml). type. ○‑〇:. lyaseはporcine. lyaseの. 激 後 ヒ ト肺 肥 満 細 胞(5×106/ml)の. 活 性 に 対 す るPolybreneの. ABC. 抗 凝 固 活 性 に 関 す る研 究. 刺 激 した 時 にヒ ト肺 肥 満 細 胞 よ り放 出 さ れ るanti‑thrombin活. chondroitin A:. 満 細 胞 系 か ら放 出 され るproteoglycanの. るい 性 に. sulfate. 性 を 終 濃 度1.25×. 10‑3U/ml以. 上 清 を検 体 と した場 合. 上 で 抑 制 し た.ま. よ う にchondroitin 来 の 検 体 とporcine chondroitin. sulfate. AC. た 図4,. lyaseは,肥 intestinal. type. Cに. 示 す. 満 細 胞 由 heparinと. Bのanti‑thrombin.
(8) 590. 津. 田. 隆. 史. 活 性 に 影 響 を あ た え な か っ た.. heparinと. 3)Polybreneの. にもanti‑thrombin活. 影 響(図5). Polybreneのheparin抑 で,ま. ずporcine. 度1.25U/ml,. 制 効 果 を調べ る目的. intestinal. heparinに. A).. heparinase非. Polybreneの. 反応. heparin. 存 在 下 で は,. sulfate. り, heparinaseの. 濃 度 を あ げ て 加 え て も影 響. を うけ な かった.一 heparinaseの. intestinal. 性 は 消 失 して お. 方Polybrene非. 存 在 下 で は,. 濃 度 依 存 的 にanti‑thrombin活. 性 の 消 失 が み られ た.同 intestinal. heparinの. 代 わ りに肥 満 細胞 由来 の. 検 体 で 検 討 し て み る と(図5,. B),. Polybrene. の 存 在 下 で は, heparinase非. 存 在 下 で 既 に肥. 満 細 胞 由 来 の 検 体 のanti‑thrombin活 失 して お り, heparinaseの も 影 響 を うけ な か った.し. 性 は消. 濃 度 を あげ て加 え て か しPolybrene非. 下 で は 潜 在 的 なanti‑thrombin活. cofactor type. II(HC. 存在. 性 がheparin. aseに よ っ て抑 制 さ れ た.. chondroitin. 後Anti‑IgEで A23187で. 刺 激 した 場 合 も, Ca‑ionophore 刺 激 した場 合 も と もに抗 凝 固 活性 の. 放 出 が 認 め ら れ た(表1).抗 thrombin活. 害 に働 き13),し. れ,放. 出 さ れ た 物 質 がAT. あ る い はFXaを. 性 と も に認 め ら IIIを 介 してthrombin. 阻 害 す る活 性 を 有 して い る こ と. を示 して い る.こ のhistamineと. 同 時 に放 出 さ. chondroitin. sulfate. 化 し な い.ゆ. え に図2,. 場 合 は,正. type. Bの 場 合 は, HC. type. BはAT. hialuronic. IIIを 活 性. IIIとHC. れ た の で,次. に そ れ が 何 如 な るproteoglycan. に起 因 す るの か を検 討 した. heparinaseに て 検 体 のanti‑thrombin活 A),. AC. な ど で な くheparinで い る.そ. sulfate thrombin活. type. A,. よ って は影 響 を れ は肥 満 細 胞 か 性 を 有 するpro sulfate. 定 系 にPolybreneを. type. み る と, porcine. intestinal. Cのanti‑. 性 を 測 定 して み る と, AT. IIIを 介. み がanti‑thrombin. 活 性 の 消 失 が み られ た(図5,. 活 性 を 示 した(図2,. に 対 して, AT. のPolybreneは,. IIIの. か わ り に正 常 プ ー ル血 漿 を使 用 した場 合 に は. 添 加 して. heparinと. 同様 に. 肥 満 細 胞 か ら放 出 された 検 体 で もanti‑thrombin. す る 反 応 で はheparinの A)の. B. あ るか 否 か を確. 定 す るた め に,測. type. type. あ る こ と を 強 く示 唆 して. こ で こ れ がheparinで. うちheparinとchondroitin B,. lyaseお. C).こ. chondroitin. が 放 出 さ れ た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た,そ. ABC. lyaseに B,. ら放 出 さ れ たand‑thrombin活 teoglycanが,. よっ. 性 は完 全 に分 解 さ. chondroitin. (図3)こ とより,抗 凝 固 活 性 を有 す るproteoglycan. のproteoglycanの. IIの い ず れ のin. IIIを 介 す る抗 凝 固 作 用 を 持 つ こ と が 証 明 さ. う け な か っ た(図4,. こで既 存. C,. 肥 満 細 胞 か ら放 出 さ れ たproteoglycanが AT. よ びchondroitin. substance. type. sulfateな ど他 のpro. IIIお よびHC. たanti‑. 意 の 相 関 関 係 が 認 め られ た. chondroitin. sulfate. 活 性 化 し な い と さ れ て い る16).. 呈 す る物. 性 とmetachromatic. IIを sulfate. IIの み を介 してthrombin. acid, keratan. teoglycanはAT hibitorも. 方. Bに 示 されたheparinの. A, chondroitin. Azure‑Aに. の 放 出 の 間 に は,有. みを. 阻 害 し, chondroitin. れ た が(図4,. thrombin活. 阻. IIはthrombinの. 常 プ ール 血 漿 中 のAT. 介 してthrombinを. 出 され た. 対 するmetachromasiaを. III. IIIを 活 性 化 す る の に 対 し て. れ た 抗 凝 固 活 性 を 有 す る物 質 は,放. 質 と ほ と ん ど同 量 で あ っ た(表2).ま. か もAT. proteaseを. 特 異 的 に 阻 害 す る と い わ れ て い る15).一 heparinがAT. 凝 固 活 性 はanti‑. 性, anti‑FXa活. B. よって も活 性 化 され, throm. 害 す る14)の に 対 して, HC. sulfate. ヒ ト肺 よ り単 離 さ れ た 肥 満 細 胞 を 受 身 感 作 の. type. の 複 合 体 形 成 比 が 急 速 に増 加 す る こ と に. を阻 害 して い ると 考 えられ る.ま た, 按. よ って 活. sulfate. が 内 因 系 凝 固 の す べ て のserine. type. 考. ある. 阻 害 した た め と考 え ら. IIはchondroitin. だ け で なくheparinに binと. B B).. IIIと 同. sulfate)に. 性 化 され, thrombinを れ る. HC. II)が,. B(dermatan. よってthrombin阻. 様 の 測 定 系 で, porcine. type. こ れ は 正 常 プ ー ル血 漿 中 に 存 在 し, AT 様 に抗 凝 固 作 用 を 有 す るglycoproteinで. 存 在 下 で 既 にporcine. heparinのanti‑thrombin活. sulfate. 性 が 認 め られ た(図2,. 終濃. 12.5U/mlのheparinaseを. さ せ た(図5,. と も にchondroitin. AT. heparin存. A,. B).至. 適濃度. 在 下 でのthrombin‑. III複 合 体 形 成 を阻 止 す るがthrombin‑HC. II.
(9) ヒト好 塩 基 球‑肥. 満 細 胞 系 か ら放 出 され るproteoglycanの. 複 合 体 形 成 に は 影 響 し な い と い わ れ17),こ 合 も 検 体 中 のheparinがPolybreneに. の場 よ って. 阻 害 さ れ た と 考 え ら れ た.. A23187で. るいはCa‑iono. と もに放 出 され た抗 凝 固 活性 を. 有 す る物 質 は, heparinで. 脱 顆 粒 した肥 満細 胞 の局 所 の環 境 が炎症 細 胞 の 浸 潤 や,持. 続 的 な 刺 激 に よ る抗 凝 固 活 性 物 質 の. も し れ な い.急. 刺 激 さ れ た ヒ ト肺 肥 満 細 胞 か. らhistamineと. あ る こ とが証 明 され. た.. 性 炎 症 に お け るfibrinの. ア レ ル ギ ー 患 者 が 抗 原 を吸 入 す る と,気 道 の 急 激 な狭 窄 と う っ 血 を き た す が,こ. れ は肺肥 満. を除 去 す る と肺 水 種 が 欠 如 し た こ とで 示 さ れ て いる26).さ. ら にfibrinの. 沈着 は組織 学的 に内 皮. に よ る そ の 分 解 産 物 で あ るBβ1‑42が. 細 胞 の 脱 顆 粒 と, histamineやprostaglandin. す な わ ちfibrinの. 遷 延 化 を 防 ぐ こ と に な り,こ. B2(TXB2)やplatelet‑activating. factor(PAF)な. ど のinflammatory. 血管内皮. 形 成 を抑 制 す る こ と は 炎 症 の. か らinflammatory. mediator. よびplasmin. 細 胞 障 害 作 用 を 有 す るこ と が 報 告 さ れ て い る3).. D2(PGD2)やleukotriene. C4(LTC4)や. 役 割 は,. 急 性 呼 吸 器 疾 患 の動 物 実 験 にお いて, fibrinogen. 細 胞 障 害 に 関 連 して お り, fibrinお. thromboxane. 591. 拡 散 や 代 謝 に よ っ て 変 化 す る た め に起 こ る の か. 以 上 の 結 果 か ら, Anti‑IgEあ phore. 抗 凝 固 活 性 に 関 す る研 究. 所 で,抗. の意 味 で肥 満 細 胞. mediatorが. 放 出 され る局. 凝 固 作 用 が 働 く こ と は 合 目 的 で あ ろ う.. が 放 出 さ れ る こ と で 惹 起 され る と考 え ら れ て い. 今 回 著 者 が 同 定 したheparinは,. AT. る18,19).一 方 種 々 のproteoglycanが. を飛 躍 的 に 加 速 してthrombinを. 急 速 に阻 害 し,. 血 小 板20)リ ンパ 球 や 単 球21),好 酸 球23)で 合 成 さ れ 放 出 され,そ は 特 徴 的 なproteoglycanの. 白血 球 や 塩 基 球22),好. fibrin形. れぞれの 細 胞 に. 構 成 が あ り,そ. れ. IIIの 活 性. 成 を阻 止 す る こ とで抗 凝 固作 用 を発揮. す る.ま たIgE関. 連 の即 時型 過 敏 反 応 に お け る. 肥 満 細 胞 由 来 のmediatorの. な か で, PGD2は. が白血 球 の生 化 学的 な指 標 と して有 用 で あ る こ. 血 小 板 凝 集 を抑 制 し て抗 血 栓 性 に働 い て い る 可. とが 示 唆 され て い る.な. 能 性 が あ る.ま た 肥 満 細 胞 中 でheparinと. か で も肥 満 細 胞 の 脱 顆. 粒 と と も に 放 出 さ れ るproteoglycanは,他 inflammatory. mediatorと. の. と も に即 時 型 過 敏. 体 を形 成 して い るtryptaseも,内 接 触 相 に お けるcofactorで. 複合. 因系 凝 固 の. あ る 高 分 子kinino. 反 応 に お い て 重 要 な 役 割 を担 っ て い る24).塩 基. gen27)や,. 性 色 素 でmetachromasiaを. に は 影 響 せ ず28)抗 凝 固 的 に働 く可 能 性 が あ る.. のproteoglycanは,顆. 呈 す る肥 満 細 胞 中 粒 内 でproteaseと. 複. fibrinogenを. 分 解 し, plasminogen. した が っ て こ れ らの 抗 凝 固,抗. 合 体 を形 成 して存 在 し,抗 原 あ るいはAnti‑IgEで. 肥 満 細 胞 由 来 のmediatorは,互. 刺 激 さ れ る とhistamineと. IgE関. さ れ る.本. と も に細 胞 外 に放 出. 実 験 で検 出 され たheparinは,細. 内で は 分 泌 顆 粒 内 の 主 要 なproteaseで aseと. 胞. あるtrypt. 血 栓 作 用 を もつ い に協 力 して. 連 の 即 時 型 過 敏 反 応 に お け る 炎 症 局 所 で,. fibrin形. 成 を阻 止 して 炎 症 の 遷 延 化 を 防 い で い. る可 能 性 が 示 唆 さ れ る.. 複 合 体 を 形 成 して 存 在 して お り, heparin. がtryptaseの. 結. 活 性 を調 節 して い る 可 能 性 も示. され て い る25).蕁. 麻 疹 に 代 表 され る肥満 細 胞 関. 連 の 即 時 型 過 敏 反 応 に お い て は,組. 織 学的 に. 即 時 型 ア レル ギー 反応 に おい て肥 満細 胞 か ら 放 出 さ れ るproteoglycanの. fibrinの 沈 着 が 欠 如 し て い る こ と が 特 徴 的 で あ. す る 目 的 で,ヒ. る と さ れ て い る,こ. い て 検 討 し,以. で はimmune. れ に対 して ア ルサ ス型反 応. complexの. 型 過 敏 反 応 やlate. onsetの. 沈 着 が み ら れ,遅. 延. ア レル ギ ー 反 応 で は. 1)ヒ. lagenase, 後,. mediatorと. とも に. ト肺 か ら単 離 し た 肥 満 細 胞 を用 下 の 結 果 を 得 た.. ト肺 単 離 肥 満 細 胞 は,肺. IgEを. 放 出 され るinflammatory. 抗 凝 固 活性 を解 明. 切 除 肺 の 健 常 部 をpronase,. fibrinの 沈 着 が む し ろ 一 般 的 で あ る.こ の事 は, 介 す る 即 時 型 過 敏 反 応 で は肥 満 細 胞 か ら. 語. elastase,. Percollを. 癌 患 者 の外 科 的. chymopapain,. DNAaseに. よ り酵 素 処 理 の. 用いた連 続 密 度 勾配 遠 心法 及び付. 着 細 胞 除 去 法 で 精 製 し て 得 た.得. られ た肥満 細. なん らかの抗 凝 固 物 質 が働 い て い る こ とが考 え. 胞 の 絶 対 数 は, (1.00±0.31)×107個(mean±. ら れ る が,後. se, n=7)でpurityは20.1±3.3%(mean±se,. 者 の場 合 は抗 凝 固 作 用 が働 い て も. col.
(10) 592. 津. n=7)で 2)ヒ. 隆. 放 出 さ れ たanti‑thrombin活 substance, ±5.8%,. 11.2±5.1%で. A23187で. ぞ れ28.8‑35.7%,. 35.9‑50.0%,. あ っ た.. 14.7%で. た こ のanti‑thrombin活. metachromatic. substanceの. IgEで. い ず れ に よっ て も 阻 害 性 は. よ っ て 消 失 し た.. 刺 激 した 時 に 放 出 さ れ るanti‑thrombin. 活 性 はheparin さ れ,即. あ. proteoglycanに. よ るこ とが示. 時 型 過敏 反 応 に お いて肥 満 細 胞 の脱顆. 性 が. 粒 時 にfibrin形. 成 を阻 止 し,炎 症 の 遷 延 化 を 防. 性 と. い で い る こ と が 推 測 さ れ た.. 間 に はr=0.68. の 有 意 の 相 関 関 係 が 認 め ら れ た. 3)ヒ. lyaseの. た このanti‑thrombin活. 以 上 の 結 果 よ り ヒ ト肺 単 離 肥 満 細 胞 をAnti‑. 刺 激 した 時 には そ れ. ず れ の 場 合 に もanti‑thrombin活. 認 め ら れ た.ま. Polybreneに. 遊 離 率 は そ れ ぞ れ33.3. 32.6±9.4%,. AC. さ れ な か っ た.ま. 刺 激 した 時 に. 性, metachromatic. histamineの. Ca‑ionophore. 史. chondroitin. あ っ た. ト肺 肥 満 細 胞 をAnti‑IgEで. り,い. 田. 稿 を終 え る に あ た り,御 指 導,御 校 閲 を賜 っ た恩. ト肺 肥 満 細 胞 をAnti‑IgEで. に 放 出 され たanti‑thrombin活. 性 は,. に よっ て 阻 害 さ れ た がchondroitin. 刺 激 した 時. 師 木 村 郁郎 教 授 に深 甚 の謝 意 を表 す る と と も に,終. heparinase. 始 御 懇 篤 な る御 指 導 を賜 っ た 林. ABC. 久 智 講 師 に深 謝 い. た しま す.. lyase,. 文. 献. 1. Kennedy JF: Generalized primary structure of glycosaminoglycans; in Proteoglycans Biological and Chemical Aspects in Human Life. Kennedy, ed., vol 2. Elsevier/North Holland Biomedical, Amsterdam (1975)p 29. 2, Dvorak AM, Schulman ES, Peters SP, MacGlashan DW Jr, Newball HH, Schleimer RP and Lichtenstein LM: Immunoglobulin E-mediated degranulation of isolated human lung mast cells. Lab Invest (1985)53, 45-56. 3. Rowland FN, Donovan MJ, Picciano PT, Wilner GD and Kreutzer DL: Fibrin-mediated vascular injury. Identification of fibrin peptides that mediate endothelial cell retraction. Am J Pathol (1984)117, 418-428. 4. Watanabe K and Tanaka K: Influence of fibrin, fibrinogen and fibrinogen degradation products on cultured endothelial cells.. Atherosclerosis. (1983)48, 57-70.. 5. Caulfield JP, Lewis RA, Hein A and Austen KF:. Secretion in dissociated. human pulmonary. mast cells. Evidence for solubilization of granule contents before discharge.. J Cell Biol (1980). 85, 299-312. 6.. 前 田 昌 則:ヒ ト肺 の 肥 満 細 胞 に関 する研 究.第1編. ヒ ト肺 肥 満 細 胞 の 分 離 精 製 に関 す る検 討.岡. 山医 学会 雑. 誌(1986) 98, 475‑485. 7.. 木 村 郁 郎.谷 崎 勝 朗:好 塩 基 球 お よ び 好 酸 球 の適 切 な同 時 直 接 算 定 法 の 考 案 と そ の臨 床 的 評 価.医. 学のあ. ゆ み(1969) 69, 25‑28.. 8.. Lasser. EC, Lang JH, Curd JG, Cochrane. SD: The plasma contact 9.. Shore PA, Burkhalter in tissues.. 10. Siraganian. 11. Jaques. A and Cohn VH Jr:. J Pharmacol RP:. (1975) 7,. A method. MM, Hamblin. AE. and Revak. Clin Immunol (1983) 72, 83-88.. for the fluorometric. assay. of histamine. in the. automated. fluorometric. histamine. analysis. system.. J. 283-290.. LB and Wollin A: A modified. Canad J Pharmacol. J Allergy. Exp Ther (1959) 127, 182-186.. Refinements. Immunol Methods. CG, Lyon SG, Howard. system in atopic asthma.. (1967) 45, 787-794.. method. for the colorimetric. determination. of heparin ..
(11) ヒ ト好 塩 基 球‑肥. 満 細 胞 系 か ら放 出 され るproteoglycanの. 12. Parekh AC and Glick D: Studies mast cells: Determination,. in histochemistry.. intracellular. 抗 凝 固 活 性 に 関 す る研 究. Lxv. heparin. distribution,. and hexosaminein. and effects of biological. state.. 593. isolated. J Biol Chem. (1962) 237, 280-285. 13. Tollefsen DM, Pestka fate.. CA and Monafo WJ:. Activation. of heparin. cofactor II. by dermatan. sul. J Biol Chem (1983) 258, 6713-6716.. 14. Rosenberg. RD: Biologic actions. 15. Tollefsen DM, Majerus. of heparin.. Semin Hematol (1977) 14, 427-439.. PW and Blank MK:. Heparin. inhibitor. in human. of a heparin-dependent. of thrombin. cofactor II; plasma.. Purification. and properties. J Biol Chem (1982) 257, 2162. -2169. 16. Tollefsen DM and Pestka protein. and platelet. factor 4.. 17. Tollefsen DM and Pestka vascular. CA: Modulation. coagulation. of heparin cofactor II activity. and hepatic. cofactor II. failure.. activity. in patients. with disseminated. intra. Blood (1985) 66, 769-774.. 18. Casale TB and Marom Z: Mast cells and asthma;. Characterization. glyco. J Clin Invest (1985) 75, 496-501.. CA: Heparin. genesis of allergic asthma. 19. Schleimer RP, MacGlashan. by histidine-rich. The role of mast cell mediators. Ann Allergy (1983) 1, 2-6. DW, Peters SP, Pinkard RN, Adkinson. of inflammatory. mediator. release. from purified. in the patho. NF Jr and Lichtenstein LM: human. lung mast cells.. Am. Rev Respir (1986) 133, 614-617. 20. Olssen I and Gardell S: Isolation and characterization cytes and platelets.. Biochim Biophys. 21. Levitt D and Ho P-L: Induction lymphocytes. and monocytes.. isolated. human leuko. Acta (1967) 141, 348-357.. of chondroitin. sulfate proteoglycan. synthesis. and secretion. in. J Cell Biol (1983) 97, 351-358.. 22. Metcalfe DD, Bland CE and Wasserman teoglycans. of glycosaminoglycans from. from basophils. SI: Biochemical and functional characterization. of patients. with chronic. myelogenous. leukemia.. of pro J Immunol. (1984) 132, 1943-1950. 23. Metcalfe DD, Litvin J and Wasserman sulfated glycosaminoglycans. SI: The isolation,. synthesized. identification. in vitro by human eosinophils.. and characterization Biochim Biophys. of Acta. (1982) 715, 196-204. 24. Yurt RW, Leid RW Jr, Spragg J and Austen rat peritoneal 25. Schwartz. mast cells.. KF:. Immunologic release of heparin. from purified. J Immunol (1977) 118, 1201-1207.. LB and Bradford. TR:. Regulation of tryptase. from human lung mast cells by heparin.. J Biol Chem (1986) 261, 7372-7379. 26. Malik AB, Johnson coagulation.. A and Tahamont. by human. purified. Mechanism of lung vascular injury after intravascular. Ann NY Acad Sci (1982) 384, 213-234.. 27. Maier M, Spragg J and Schwartz. 28. Schwartz. MV:. mast cell tryptase. LB, Bradford. tryptase. TR,. from human. LB:. Inactivation. of human. high molecular. weight. kininogen. J Immunol (1983) 130, 2352-2356. Littman. BH and Wintroub. lung mast cells.. BU. The fibrinogenolytic. J Immunol (1985) 135, 2762-2767.. activity. of.
(12) 594. 津. Anticoagulant human. 田. activity. cell system. anti-IgE. activity. released. lung mast. Takashi. with. A23187. of proteoglycans. human. from. by challenge. or Ca-ionophore. isolated. Department. 史. of proteoglycans. basophil-mast. I. Anticoagulant. 隆. released. from. cells. TSUDA. of Medicine, Okayama University Okayama,. Medical School,. 700. (Director: Prof. Ikuro Kimura) The. anticoagulant. evaluated.. Human. normally. appearing. by. velocity. of. 20.1•}3.3%.. serum calcium A,. as. well. (28.1%). as. were. method. using. The. metachromatic that. lyase, that. heparin. and. released Both in. activity. proteoglycan may. mast. cells,. challenged. resistant. S-2238. from. for. fibrin. were. and. identified. cells an. Xa. by. lyase. in. important. Azure to. Polybrene.. mast play. high. the. an. A. be. IgE. stimulated with. cells. with. ABC. by. a purity. and. chondroitin. These. data mediated. role. at. activity. correla was. heparin. IgE. by Azure. amidolytic. A significant. change. chondroitin. lung. or. anti-Factor. mast. enriched. with with. IgE. and. was from. and. obtained. respectively.. inhibited. cells. metachromatically. lung. activity by. carcinoma. passive-sensitized. stained. human. mast dissociated. anti-human. S-2222,. human of. were. metachromatic. and. lung. were. (33.8•}5.8%). from. degradation. deposition. human. enzymatically. surgery. rabbit. which. and. the. heparinase. released prevent. which with. anticoagulant to. by. during. activity. and. from and. ((1.00•}0.31)•~107). released. with. degraded. reaction. cells. anti-thrombin. substrate. were. obtained. Mast. proteoglycans. materials. released. mechanically. proteoglycans. chromogenic. they. were. lung. anti-thrombin. completely. sensitivity lesions.. A23187, histamine.. between. proteoglycans. fragments. patient. detected. tion. criteria. lung. human. allergic. ionophore. cells. sedimentation. Isolated. an. of. mast. human. gradient. from. activity lung. found. by. the AC. suggest hyper. inflammatory.
(13)
関連したドキュメント
As shown in Figure 3C and 6A, both mouse and human ES cell-derived differentiated cells expressed Cyp7A1, thereby suggesting that Albumin-positive cells derived from ES cells
Abbreviations: CA, cholic acid; CDCA, chenodeoxycholic acid; DCA, deoxycholic acid; GCA, glycocholic acid; GLC, gas-liquid chromatography; G- , glycine-conjugated
Using the RBL-2H3 mast cell line, we detected Rab37 on the secretory granules and found that antigen-induced degranulation was extensively increased by either knockdown of Rab37
よっ て ， 学位 申請 者は 博士 （歯 学） の学 位授 与に 値する もの と認 めら
ダーによる HAp 層の高い接着強度を示した。柔軟性と高い生体活性を併せ持つ材料の開発 に成功した。 第 5 章では、SBF
74 報告する． 18．当院における小腸出血症例の検討
115 最近，血栓症，習慣性流産，血小板減少を特徴とす
Functions and differentiations of photosynthetic membranes (thylakoid membranes) in a green alga and nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria analyzed by multimodal spectral
