血管内皮傷害と口腔細菌

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(1)● シンポジウム 11 神経再生と脳保護療法. 血管内皮傷害と口腔細菌梅村和夫＊，外村和也，松本祐直. 要旨マウス頭蓋内出血モデルを用い，S. mutans（標準的な株である MT8148 株（MT）と頭蓋内出血患者から分離した高病原性 TW295 株（TW））を静脈より投与し，24 時間後の頭蓋内出血の程度を検討した．頭蓋内出血量は MT 群では，コントロール群と比べ変化がなかったが，TW 群では有意に増加した．TW は菌表層にコラーゲン結合蛋白質（Cnm）を有しているが，MT は有していない．そこで，この Cnm を欠損させた TW295CND 株を作製した．CND 株群では，脳組織への集積は認められず，頭蓋内出血の増悪も認められなかった．また，TW 群は出血部位に強い MMP-9 の発現増強を認め，さらにコラーゲン添加による血小板凝集能を低下させた．これらの結果から，高病原性 S. mutans は，Cnm を有しており，その Cnm を介して血管内皮傷害により露出したコラーゲン層に集積し，MMP-9 の発現を亢進して血管壁を融解し，さらに血小板凝集能を低下させることで頭蓋内出血を助長したと考えられる．（脳循環代謝 26：141∼143，2015）. キーワード : 口腔細菌，全身疾患，頭蓋内出血，コラーゲン結合蛋白質. 感染性心内膜炎患者は高率に頭蓋内出血を併発する. 1．はじめに. ことが報告4）されており，そこで，我々は S. mutans が，全身疾患の 1 つとしての頭蓋内出血にフォーカス. 一般的にむし歯と言われているう蝕の病原細菌である Streptococcus mutans （S. mutans）は，グラム陽性の通. 性嫌気性レンサ球菌である．この S. mutans は時とし. をあて，この S. mutans と頭蓋内出血との関わりについて，さらにそのメカニズムについて検討したので報告をする5）．. て感染性心内膜炎患者の血液から分離されることがあ. 2．う蝕原因菌による頭蓋内出血の増悪. る．これは，S. mutans が抜歯等の歯科治療やブラッシングにより血液中に侵入し，心内膜や心弁膜に疣贅（ゆうぜい）といわれる細菌の塊が付着し，その部位で. 動物実験としてマウス頭蓋内出血モデル6）を用い. 細菌が増殖し心臓弁に損傷を与えることによって心内. た．この動物モデルは我々の講座で開発された実験法. 膜炎を発症することによる．また，P. gingivalis をはじ. であり，ローズベンガルという色素液と緑色光による. めとした歯周病原因菌が全身のいろいろな臓器におい. 光増感反応によって一重項酸素が発生し，それが血管. て障害を引き起こすについては，解明されてきてい. 内皮細胞を限局的に損傷することによって，そこへ血. る. ．このように，口腔細菌が口腔内の処置等により. 小板が粘着・凝集し，さらに血小板血栓が成長し，血. 血中に侵入し，全身の臓器に障害を与えることによっ. 管が閉塞する．緑色光を中大脳動脈の起始部に照射. て，全身疾患と大きく関わることが報告されてきてい. し，その部位を閉塞することによってその末梢の脳組. る．しかし，S. mutans に関しては，全身疾患としての. 織を虚血状態にさせることができる．本研究では照射. 感染性心内膜炎以外はあまり研究が進んでいない．. 条件を調整することで，いったん形成された血小板血. 1~3）. 浜松医科大学薬理学＊〒 431-3192 静岡県浜松市東区半田山 1-20-1 TEL: 053-435-2269 FAX: 053-435-2269 E-mail: [email protected]. 栓が自然に崩壊して血流が再開するような条件を用いた．閉塞した部位より末梢の脳組織では，虚血・再灌流により血管が傷害され，頭蓋内出血が観察できる． S. mutans の内で標準的な株である MT8148 株（MT） ─ 141 ─.

(2) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. Total area of hemorrhage (mm2). 4.0 4．頭蓋内出血増悪のメカニズム. 3.0. TW はコラーゲンへの結合能が非常に高いことから，血小板凝集能に影響を与えるのではないかという仮説を立て，コラーゲン惹起による血小板凝集能への. 2.0. 影響について検討した．TW は MT と比較して，有意にコラーゲンによる血小板凝集能を抑制した．一方， CND は，血小板凝集能に対して影響を与えなかっ. 1.0. た．菌のコラーゲン結合能とコラーゲンによる血小板凝集能との間には負の相関がみられた．マウス頭蓋内出血モデルの脳組織を採取し，ザイモ. 0. グラフィにより matrix metalloproteinase-9（MMP-9）の発現を検討した．コントロール群においては，非虚血側ではほとんど MMP-9 の発現はなかったが，虚血側で. 図 1．頭蓋内出血の面積 S. mutans の標準株である MT8148 は，菌を投与しない（コントロール群）場合とあまり変化はないが，高病原性株である TM295 は頭蓋内出血を増強した．TM295 からコラーゲン結合蛋白質を欠失した TM295CND は頭蓋内出血の増強を抑制した．. は弱い MMP-9 の発現がみられた．一方，TW 投与群では，虚血側では強い MMP-9 の発現亢進がみられた． in vitro 実験において，TW と CND をマウス脳血管内皮細胞（b.End3 cells）に暴露し，ケモカインである CXCL1, CCL2 （MCP-1），CXCL2 の mRNA の発現をリアルタイム PCR により測定した．TW を暴露した場合は，それらの mRNA は有意な発現増強が認められた. と頭蓋内出血患者から分離した高病原性 TW295 株. が，CND 暴露では発現増強は認められなかった．. （TW）を静脈より投与し，菌血症の状態を作製した．この状態で，中大脳動脈を血栓にて閉塞後再開し，24. 5．脳卒中患者を対象とした臨床研究. 時間後の頭蓋内出血の程度を検討した．頭蓋内出血量は MT 群では，コントロール群と比べ変化がなかった. 聖隷浜松病院を中心として，急性期の脳梗塞および. が，TW 群ではコントロール群および MT 群と比べ有. 頭蓋内出血を含む脳卒中患者より唾液を採取して健常. 意に増加した（図 1）．. 者との比較を行った．口腔内の S. mutans の保有率は各群とも約 50％と有意差はみられなかった．一方，. 3．頭蓋内出血に対して影響をおよぼすう蝕原因菌の特徴. Cnm 陽性である S. mutans の検出率は，健常群では約 15％であるのに対し，脳出血患者では約 40％と有意に高かった．. TW と MT の違いは菌表層に存在するコラーゲン結合蛋白質（Cnm）の有無であるため，TW の Cnm を欠失. 6．おわりに. させた TW295CND （CND）株を作製して，マウス頭蓋内出血モデルを用いて検討した．CND の投与では， TW とは異なり頭蓋内出血の増悪は認められず（図 1），また虚血側への菌の集積はなかった．また，Cnm を人工的に作製して，同様の検討を行ったところ，. S. mutans をはじめとする口腔細菌は歯科的治療だけでなく日々の歯磨きなどをきっかけとして，体循環に侵入することで菌血症を起こす可能性がある．本研究によって Cnm を菌表層に有した高病原性 S. mutans. TW 投与と同様にリコンビナント蛋白質の投与で頭蓋. が，口腔内から血液に入り，血管内皮が損傷を受けて. 内出血の増悪がみられた．これらのことから TW は血. いる部位に付着し，炎症性細胞を誘導し，炎症性反応. 管内皮が傷害を受けることによりコラーゲン層が露出. を増強し，血管壁を脆弱にする MMP-9 の発現を増強. した部位に，Cnm を介して菌が付着することで頭蓋内. する．さらには血小板凝集能を抑制することで，頭蓋. 出血を増悪していると考えられた．. 内出血を増悪していることが考えられる．以上の研究により，頭蓋内出血のリスク因子の 1 つに高病原性 S. mutans の保菌が関与していることを示唆した． ─ 142 ─.

(3) 血管内皮傷害と口腔細菌. 113: 110–114, 2010. 文献. 4） Pruitt AA, Rubin RH, Karchmer AW, Duncan GW: Neu-. 1） Inaba H, Hokamura K, Nakano K, Nomura R, Katayama K, Nakajima A, Yoshioka H, Taniguchi K, Kamisaki Y,. rologic complications of bacterial endocarditis. Medicine (Baltimore) 57: 329–343, 1978. Ooshima T, Umemura K, Murad F, Wada K, Amano A:. 5） Nakano K, Hokamura K, Taniguchi N, Wada K, Kudo C,. Upregulation of S100 calcium-binding protein A9 is. Nomura R, Kojima A, Naka S, Muranaka Y, Thura M,. required for induction of smooth muscle cell proliferation. Nakajima A, Masuda K, Nakagawa I, Speziale P, Shimada. by a periodontal pathogen. FEBS Lett 583: 128–134, 2009. N, Amano A, Kamisaki Y, Tanaka T, Umemura K,. 2） Hokamura K, Inaba H, Nakano K, Nomura R, Yoshioka H,. Ooshima T: The collagen-binding protein of Streptococcus. Taniguchi K, Ooshima T, Wada K, Amano A, Umemura. mutans is involved in haemorrhagic stroke. Nat Commun. K: Molecular analysis of aortic intimal hyperplasia caused. 2: 485. doi: 10.1038/ncomms1491, 2011. by Porphyromonas gingivalis infection in mice with endo-. 6） Zhao BQ, Ikeda Y, Ihara H, Urano T, Fan W, Mikawa S, Suzuki Y, Kondo K, Sato K, Nagai N, Umemura K:. thelial damage. J Periodont Res 45: 337–344, 2010 3） Hokamura K, Umemura K: Roles of oral bacteria in car-. Essential role of endogenous tissue plasminogen activator. diovascular diseases̶from molecular mechanisms to. through matrix metalloproteinase 9 induction and expres-. clinical cases: Porphyromonas gingivalis is the important. sion on heparin-produced cerebral hemorrhage after cere-. role of intimal hyperplasia in the aorta. J Pharmacol Sci. bral ischemia in mice. Blood 103: 2610–2616, 2004. Abstract Relations between endothelial damage and oral bacteria Kazuo Umemura, Kazuya Hokamura, and Yuji Matsumoto Department of Pharmacology, Hamamatsu University School of Medicine, Shizuoka, Japan We investigated cerebral hemorrhage 24 hours after MT8148 (MT), the standard strain of S. mutans or TM295 (TW) isolated from a subject with cerebral hemorrhage administered, using cerebral hemorrhage model in mice. Bacteria-induced aggravation of cerebral hemorrhage was observed in mice infected with TW, but not MT. The most important factor for highly virulent strains is the presence of the CBP expression. The reduction of cerebral hemorrhage was observed with TW295CND, a defect of CBP expression. TW caused the activation of MMP-9 in the ipsilateral hemisphere of injured mouse brain and reduced the platelet aggregation induced by collagen. S. mutans strains with collagen-binding protein possess high affinity to the exposed collagen fibers, resulting in the accumulation of highly virulent bacteria in collagen-denuded blood vessels. The accumulation of bacteria consequently leads to the activation of MMP-9 and the inhibition of platelet aggregation in injured blood vessels, resulting in an acceleration of bleeding and hemorrhagic infarction. Key words: oral bacteria, systemic diseases, intracerebral hemorrhage, collagen-binding protein. ─ 143 ─.

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