r一 ハ } 無 アル ブミンラ ッ ト肝細 胞 への分離正常 肝細胞の移植 61570179 昭和63年 度 科学 研究黄補 助金(一 般C>研 究成果報告書 平成元年3月 研究代表者 小川 勝洋 (旭 川医科 大学医学部教授)
は し が き 研究 組織 研究代表者:小 川 勝 洋 研究分担者:小 山田 正 人 (旭川医科大学医学部教授) (札幌医科大学医学部助手) 研究経黄 昭和61年 度 昭和62年 度 昭和63年 度 計 1500千 円 200千 円 100千 円 1800千 円 研究発表 (D学 会 誌 等 OYokota,K.,Ogawa,K.,Mori,M.,Nagase,S. andSato,K. Transplantationofputativepreneopiastichepatocytes ofanalbuminemicratsintheliversofSprague-Dawley xanalbuminemichybridrats. Jpn.J.LancerRes.(Gann)78:109-112(1987) 02Yokota,K.,Ogawa,K.,Mori,M.andNagase,S. Lackofalbuminasagenotypicmarkerofpreneoplastic analbuminemicratshepatocytestransplantedwithin albumin-positiveliver. CancerRes.48:389-392(1988)
③ 小 川 勝 洋 、 辻 哲 、 横 田 欽 一 、 池 田 健 、 森 道 夫: モ ザ イ ク 動 物 の 肝 発 癌 研 究 へ の 応 用 J.ToxICOlPatho1.1:61-66(1988) (2)口 頭 発 表 OOOgawa,K.,Yokota,K.,Mori,M.,Nagase,S.: Settlementoftransplantedhepatocyteswithintheliver ofanalbuminemicrats. Proc.XithInt.Cong.ElectronMicroscopy11:2933-2934 (1986) ② 小 川 勝 洋 、 横 田 欽 一 、 森 道 夫 、 長 瀬 す み: 無 ア ル ブ ミ ン ラ ッ ト(NAR)肝 内 へ の ア ル ブ ミ ン 産 生 細 胞 の 移 植 日 病 会 誌75:387(1986) ③ 小 川 勝 洋 、 横 田 欽 一 、 森 道 夫 、 長 瀬 す み: 門 脈 よ り 注 入 し た 正 常 肝 細 胞 の 無 ア ル ブ ミ ン ラ ッ ト肝 内 へ の 生 着 過 程 の 電 顕 的 観 察 日 癌 記 事45:248(1986) ④ 小 川 勝 洋 、 横 田 欽 一 、 森 道 夫 、 長 瀬 す み: 無 ア ル ブ ミ ン ラ ッ ト前 癌 肝 細 胞 の ア ル ブ ミ ン 産 生 性 ラ ッ ト肝 内 で の 生 着 と そ の 推 移 日 癌 記 事46:24(1987) ⑤ 横 田 欽 一 、 小 川 勝 洋 、 森 道 夫 、 長 瀬 す み: 無 ア ル ブ ミ ン ラ ッ ト 前 癌 肝 細 胞 の ア ル ブ ミ ン 産 生 性 ラ ッ ト肝 内 へ の 移 植 一 肝 発 癌 過 程 の 解 析 へ の 遺 伝 的 マ ー カ ー の 導 入 日 病 会 誌76:116(1987) ⑥ 小 川 勝 洋: 遺 伝 マ ー カ ー に よ る 肝 癌 発 生 過 程 の 解 析 日 病 会 誌77(補2):22(1988)
は じめに 分離肝細胞 を同系 動物 に移植 す る試み は これ まで数多 く行なわれて お り、脾臓 1)、前眼房2)、 腹腔 内3)、 皮下 脂肪組織4)な どには長期 にわた って生着す るこ と が報告 されて いる。肝臓内へ の移 植の試 み もい くつか行 なわれてお り、Gunnラ ッ ト肝5・6}やGalactosamine障 害肝7)へ 正常肝細 胞 を移植す ることによ り、 明 らか な症状の改善や延命効果が あ った とす る報 告が見 られ る。 しか し、後者の実験 で は、必ず しも移植肝細胞 が宿主 肝 に生着 したとは限 らず、 酵素 蛋 白または小器官 が宿主細胞に取 り込 まれて一 時的 に機能 を発揮 した可 能性や肝細胞 か らの何 らか の 因子が宿主肝の再生を促進 した可能性 も考 え られ る8)。 一方、 門脈血中 にはhepatotrophicfactorsが 存在 す ることや組織構造の点な ど か ら考 えて、肝細胞 は他組織 よ りも肝組織 内 に生着 す る方が機能 を発揮す る上 で 有 利 と考 え られ る。 しか し、肝 細胞が肝 内 に生着す ることを確認す るために は移 植 細胞 と宿主細胞 とを区別 す るマ ーカ ーが必要 とな る。我 々は、無 アルブ ミンラ ッ ト(NAR)の 肝内にアルブ ミン産 生肝細胞 を注入 して、アル ブ ミンをマーカー と して移植後 の運命 を追跡 した。 門脈内に」入 した肝細 の 命 NARに2/3部 分肝切除 を行 ない、手術 直後 に コラゲナーゼ 法 によ り分 離 した SDラ ッ トの肝細胞 を2×106ケ を腸問膜 静脈の末梢 か ら注入 した。NARで は加 令 にともな ってアルブ ミン陽性 細胞 が出現 す るこ とが知 られ ているため91、 宿 主の NARは 週令6週 の比較的若 いものを使 用 した。注 入後、様 々な時間 に肝 を還 流固 定 し、抗ラ ッ トアルブ ミン抗体 に よる免 疫染色 に よ り注入細胞 を追跡 した。注入 後2時 問 目で は大部分の注入肝細 胞は門脈 枝内で集塊 をな して塞栓 を形成 して い たが、一部は単一 または少数の集 団で類洞 内に散在性 に認 め られ た。 これ らを電 顕 的に観察す ると多 くは球状 に近 い形 態 を と り、類洞壁 との接触性 は乏 しか った。 しか し、注入後6時 問 目で はこれ らの肝細 胞は接 着面 をも って類洞壁 に接す る傾 向がみ られ、電顕的 には類洞内 皮の一部 が欠損 して、 そ こに注入細胞 が嵌 り込 ん で、細胞質の一部が宿主肝細胞 と接 して いた。 しか も、類洞内皮の細 胞突起 が注 入肝細胞の表面の0部 被 ってい る像も観察 され た。24時 問目では、 門脈内、類 洞 内にアルブ ミン陽性肝細胞 は見 られず 、肝細胞索内 にのみ見 られ、 それ らは正 常 肝細胞 と同様 に多角形 を示 して いた。電 顕的観察 ではアルブ ミン陽性で ある以
外 、 宿 主 肝 細 胞 と の 区 別 は な く 、 隣 接 細 胞 と の 問 に は 毛 細 胆 管 及 びtightjunc-tionが 観 察 さ れ た 。 こ れ らの 観 察 の 結 果 か ら、 類 洞 内 に 移 行 し た も の は 比 較 的 短 時 間 内 に 宿 主 の 肝 細 胞 索 内 に 組 み 込 ま れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 1 肝細胞以外では、膵島細胞 や悪性腫瘍細 胞 を門脈内 に注入 してその生着過程 を 調べ た報告があ る。例 えば膵 島細胞 について は門脈内で塞栓 を形成 し、 その後 、 門脈内皮 によって被われ、 グ リソン鞘 内に取 り込 まれて生着す る事 が報告 されて いる10》。 また、門脈 内 に注入 した腫 瘍細胞 は細胞 の種類に よ り一定のパ ター ンで 肝組織 内に生着 して転移巣 を形成 する ことが知 られてい るli)。 この ように細胞 の 種類 に より肝組織 内への生 着部位及び様 式 には明 らかに違 いがみ られ る。 この よ うな肝内生着の メカニズムに は移植細胞 と類洞内皮細胞 、細胞外基質 との反応 が 重要 と考え られ る。 単層 培養 した血管 内皮細胞上 に腫瘍 細胞を加 えた場合、腫瘍 細 胞が細胞外基質 に対 して高 い反応性 を示 すと、内皮細胞 の細胞質突 起が収 縮 し、 その欠損部か ら腫 瘍細胞 が内皮下 に侵入す ることが示 されてい る。 この時、細胞 外基質の成分 として はfibronectin、laminin、TypeIVcollagenが 重要 とされ て いる。一方、肝のDisse腔 に はこれ らの成分 が豊富 に含 まれ るとともに12)、 肝細胞 は培養条件で これ らの成分 と強 い親和 性を示す ことが知 られて いる。 した が って、類洞壁 には肝細胞が類洞 内皮 を押 し退けてDisse腔 に侵入 しやす い条件 がそ ろって いるもの と考 え られ る。 門脈内肝細胞 面 の応 門脈内肝細胞移植法の応用 につ いて は、1つ に は肝不全 や代謝疾患な どの治 療 への実験モデル と しての可能性 で ある。実 際、上記の よ うに肝不全や代謝疾 患な どに効果が あったとする報告 が あるが、 その作用 は一 時的なもので長期 には有効 でない。 また、今 回のSDラ ッ トとNAR間 の移 植 はallogeneicな 関係で あ り、 長期生着す ることは期待 しが た く、 したが って実際 の治療 でも他の個体 か らの肝 細胞 を移植 する場合 には同様 の問題が あ ろう。 一方、 近年遺伝子治療の 目的で体細胞 に遺伝子 を組 み込 んで再び体内 に移植 し・ 生体内で遺伝子発現 を行 なわせ よ うとす る試 みが行 なわれている13》。肝特異 酵素 の欠損に よる先天性代謝疾患 の場合 にはho{oenzymeや 代謝過程の再 構築を必要 とするため、 同一 個体か ら分離 した肝 細胞 に遺伝子導 入 して再び体 内に戻す こと
は 有 効 な 治 療 法 に な り う る と 考 え られ る14)。 し か し 、 今 後 こ れ を 実 現 す る た め に は 生 着 効 率 を 大 幅 に 上 げ る こ と や 移 植 肝 細 胞 を 生 体 内 で 特 異 的 に 増 殖 さ せ る 手 段 な ど 、 多 くの 問 題 の 解 決 が 必 要 で あ ろ う。 門 脈 内 移 植 法 の 今 一 つ の 応 用 は 細 胞 のlineageを 追 跡 す る こ と で あ る15》。 我 々 は こ れ ま でhomoNARとheteroNAR(heteroNARで は 無 アル ブ ミ ン 血 症 は 劣 性 遺 伝 の た め ア ル ブ ミ ン 産 生 性 で あ る)の 問 で 前 癌 肝 細 胞 の 移 植 を 行 な い ア ル ブ ミ ン の 有 無 を マ ー カ ー に して 移 植 後 の 運 命 を 追 跡 し た 。 こ の 場 合 に は 長 期 生 着 が 可 能 で あ り、 ま た 、 宿 主 に プ ロ モ.._.ショ ン を 行 な う こ と に よ り移 植 細 胞 は 増 殖 し て コ ロ ニ ー を 形 成 す る 。 こ の 場 合 に は 移 植 細 胞 は ど の 様 に 形 や 形 質 を 変 え て も 遺 伝 マ ー カ ー を 利 用 し て 検 出 で き る た め 、 前 癌 肝 細 胞 の 運 命 を 追 跡 す る 上 で き わ め て 有 効 で あ っ た 。
1) Mito, M., Ebata, H., Kusano, M., Onishi, Y., Saito, T.,
Sakamoto, S. : Morphology and function of isolated hepatocytes
transplanted into rat spleen. Transplantation 28: 499-505, 1979
2) Rao, M. S., Thorgeisson, S., Reddy, M. K., Lalwani, N. D., Evarts, R. E., Usman, M. I., Singh, B., Reddy, j. K. : Induction of
some proliferation in hepatocytes transplanted into the anterior
chamber of the eye. A model system for the evaluation of
induced effects. Am. j. Pathol. 124: 519-527, 1986
3) Demetriou , A. A., Whiting, j. F., Feldman, D., Levenson, S. M., Choudhurg, N. R., Mosciomi, A. D., Kram, M., Choudhurg, j. R. :
Replacement of liver function in rats by transplantation of
carrier-attached hepatocytes. Science 233: 1190-1192, 1986
4) jirtle, R. L., Michalopoulos, G. : A clonal assay in vivo
chymal hepatocytes. In: Cell Clones: Manual of Mammalian Cell niques, C. S. Potten & j. H. Hendry (Eds.) Churchill Livingstone, Edin, London, Melbourne & N. Y. p. 139-151, 1985
5) Matas, A., Sutherland, D. E. R., Steffes, M. W., Mauer, S. M., Lowe, A., Simmons, R. L., Najarian, j. S. : Hepatocellular
plantation for metabotic deficiencies: decrease of plasma
bin in Gunn rats. Science 192: 892-894, 1976
6) Groth, C. G., Arborgh, B., Bjorken, C., Sundberg, B., Lundgrem, G. : Correction of hyperbilirubinemia in the
deficient rat by intraportalhepatocyte transplantation. Transplant.
Proc. 9: 313-316, 1977
7) Sommer, B. G., Sutherland, D. E., Matas, A. J., Simmons, R. L., Najarian, J. S. : Hepatocellular transplantation for treatment of D-galactosamini-induced acute liver failure in rats. Transplant.
Proc. 11: 578-584, 1979
8) Makowka, L., Falk, R. E., Rotstein, L. E., Falk, J. A., Nossal, N., Langer, B., Blendis, L. M., Phillips, M. J. : Cellular
tion in the treatment of experimental hepatic failure. Science 210: 901-903, 1980
9) Makino, R., Sato, S., Esumi, H., Negishi, C., Takano, M.,
Sugimura, T., Nagase, S., Tanaka, H. : Presence of albumin positive cells in the liver of analbuminemic rats and their increase on
tment with hepatocarcinogens. Gann 77: 153-159, 1986
10) Hart, T. K., Pino, R. M. : Psendoislet vascularization. Induction
of diaphragmfenestrated endothelia from the hepatic sinusoids. Lab. Invest. 54: 304-313, 1986
11) Nicoison, G. L. : Cancer metastasis. Organ colonization and the
cell-surface properties of malignant cells. BBA. 695: 113-176, 1982
12) Martinetz-Hernandez, A. : The hepatic extracellular matrix. :
I. Electron •immunohistochemical studied rat liver. Lab. Invest. 51: 57-74, 1984
13) Ledley, F. D. : and prospects.
Somatic Part 1.
gene therapy for J. Pediat. 110: human disease 1-8, 1987 . : Background 14) Peng, H., Armentano, D., Darlington, G., Ledley, transfer and expression
mouse hepatocytes. Proc
Mackenzie-Graham, L
F., Woo, S. L. C. : of human phenyl an i me
. Natl. Acad. Sci.
., Shen, R. F.,
Retrov i ra l -med i ated gene hydroxylose in primary 85: 8146-8150, 1988 15) Yokota, K., Ogawa K. genotypic marker of transplanted within 1988
, Mori, M., Nagase, S. : Lack of albumin as preneoplastic analbuminemic rat hepatocytes
