Mg^2＋結合による豚脳S-100b蛋白の立体構造変化の特徴

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(1)Title. Mg^2＋結合による豚脳S-100b蛋白の立体構造変化の特徴. Author(s). 松田, 禎行. Citation. 北海道教育大学紀要. 自然科学編, 65(1): 5-8. Issue Date. 2014-08. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/7574. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 平成 2 6イ￨二 8月. 北海道教育大学紀要(自然科学編)第 6 5巻第 1号 J o u r n a lo fHokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n( N a t u r a lS c i e n c e s )Vo . l6 5 .No. l. Augus . t2014. Mg2+結合による豚脳 S-100b蛋白の立体構造変化の特徴松田禎行北海道教育大学旭川校化学教室. F e a t u r e so fC o n f o r m a t i o nChangei nP i gB r a i n 2+ S-100bP r o t e i nC a u s e dbyMg B i n d i n g MA TSUDASadayuki. Departmento fC h e m i s t r y .AsahikawaCampus.HokkaidoU n i v e r s i t yo fE d u c a t i o n .Asahikawa0 7 0 8 6 2 1. 概要トリプルオペラジン (TFP)，或いはコンゴーレッド (CR) 存在下の吸収スベクトル測定か Z+結合は C端領域をより疎水的な雰囲気へ移行させることが示ら，豚脳 S-100b蛋白への Mg. された。 2-p トルイジニルナフタレン 6 スルホン酸 (TNS) を添加した蛍光スベクトル測定の結果もこれを裏付けた。これに対し CaZ+結合ではその程度は小さいか，むしろ C端領域を親水的雰囲気へ移行させることが示された。 S-100蛋白への. Ml+結合はその立体構造に大き. く寄与しているものと推測される。. 1.序論. 午や豚の S 1 0 0 a . a '及び、 S-100bへの CaZ+結合ではチロシン ( T y r ) 残基の環境変化に基づく明. 豚脳 S-100蛋白は等電点 4 . 2の酸性 CaZ+結合蛋. 瞭な紫外部吸収差スベクトルが得られるが，. 白質で三つのアイソフォーム ( S 1 0 0 a，S 1 0 0 a '，. MgZ+を加えても幅広くはっきりしない形の差ス. S 1 0 0 b ) で存在する 1-3)。これらは各々 αs ，α' s，. ベクトルがかろうじて観られるだけである。また. s sのサブユニット対で構成されるが， αとα'の化のそれとは学的性質は殆ど同じであるのに対 Ls. CaZ+のS 1 0 0 a . a 'への結合ではトリプトファン. 大きく異なるため，実質上 S 1 0 0 a . a '( S 1 0 0 a，. トル強度の大幅な増加が認められるが， MgZ+の. S 1 0 0 a 'の混合物)と S-100bに大別できる。 S-100. 添加によるそれは極めて小さい。それ故， S-100. 蛋白は EFハンド構造を持つ蛋白族に属し，各サ. 蛋白は MgZ+ と相互作用しないものとかつては考. 0 . 5 0 0 ) は二つの EF ハンドブユニット(分子量 1. えられていた 4.7刈。近年になって，間接的な実. 領域を有している。このうち N端側の EFハンド. Z+を結合し(解験手法から脳の S-100蛋白は Mg. 領域の Ca Z + 解離定数は 200~500μM ， C端側のそ. 離定数は 1~ 3mM)，構造変化を起こすことが. れは 20~50.uM と報告されている 4-6) 。. 見出された 9)。また C端側疎水性アミノ酸残基と. ( T r p 9 0 ) 残基の環境変化に基づく蛍光スベク. 5.

(3) 出. 松. 禎. 行. してシステイン ( C y s ) 残基に着目し蛍光試薬で. の TFPの代わりに 10μMTNSを含んだものとし. 2+結合では修飾して構造変化を調べたが， Ca. た。。フタルアルデヒドによるアミノ基の蛍光. Cys 残基は溶媒中へ大きく移行するのに比較し. .Bohlen等の方法に従って S-100bに対修飾は P. Mg2+結合によるそれは極めて僅かであることが. し等モル量の oフタルアルデヒドを添加して. 示された 10)。これらのことから多くの研究者は，. 行った 12)。また蛍光スベクトル測定は試料溶液. Mg2+結合による構造変化は Ca2+結合によるそ. を340nmで、励起(バンド幅 1 0nm)しておこなった。. れに比較して小さく生理的意味の乏しいものと捉えている。しかし，疎水性アミノ酸残基には他にも多くの種類があることに加えて親水性アミノ酸残基の挙. 3 . 結果と考察 3 . 1 TFP/S-100bの紫外吸収スペクトル. 動も観るべきであり，まだ構造変化の大小につい. 2+結合図 1に示すように TFP/S-100bへの Ca. ての早急な結論付けは出来ない。そこで本実験で. は Ogoma等により報告されている 3) とおり吸収. Mg2+結合による立体構造変化を四つの方法. 帯の深色効果を起こした。これは戸サブユニッ. で調べてみた。一つ日はトリプルオペラジン. トの C端にあると推測されているの TFP結合サ. (TFP) を添加し紫外部の吸収スペクトルを測. イトがより親水性の雰囲気に移行したことを示唆. は，. TFP/S-100bへの Mg2+結. C R )指定する方法，二つ目はコンゴーレッド (. する。これに対し，. 示薬を添加し可視部の吸収スベクトルを測定する. 合は吸収帝の浅色効果を示した。これは TFP結. p 一トルイジニルナフタレン 6 方法，三つ目は 2. 2+結合に伴い，より疎水的雰囲気合サイトが Mg. スルホン酸 (TNS) を添加し蛍光スベクトルを. 2+結合で生じた立体へ移行したことを示す。 Mg. 測定する方法，四つ日はオルト. ( 0 ) フタルアル. 構造変化の特徴が明示されたことになる。. S 1 0 0 a . a 'においても Ca2+や Mg2+の結合で同. デヒドでアミノ基を蛍光修飾する方法である。. 様な現象が認められたがその効果は S -100bのそれより大きかった(未発表)。. 2 .実験. このことは. S 1 0 0 a . a 'と S-100bの立体構造の違いを反映す. 試薬. S -100bは豚脳より既報に従って調製し. るものであろう。. た 11)。 TFP， CR ， TNS，。フタルアルデヒド. は，それぞれシグマ杜，和光純薬工業社，半井化. 紫外可視吸収スペクトル.紫外可視吸収スベク 0. 守. n u. U '. -100b，用いて測定した。溶液組成は 10μMS. ﹄﹄由一山内相︿. 5Cにて島津 UV-3100S型分光光度計をトルは 2. p γ. 。ucu. 学社，関東化学社から購入したものを使用した。. む. 8 1. 25μMTFP ( 或いは 10μM CR)， 2 0m M . 0 ) を含む。追加 MOPS-NaOH緩衝液 (pH= 7 s -ア成分は， O.lmMエチレングリコールピス (. ミノエチルエーテル). N，N ' 四酢酸 ( E G T A )， 0. 10mMMg2+， 1m MCa2+である。. 2 5 0. 5C 蛍光スペクトル法.蛍光スベクトル測定は 2 0. にて島津 RF-1500型蛍光光度計でおこなった。. TNSの蛍光スベクトルは試料溶液を 350nmで励起(バンド幅 10nm) して得た。溶液組成は前述. 6. ¥. 2 9 0. λ!nm. 3 3 む. FP/S-I00bの紫外部吸収スベクトル図1 T 2+/ TFP/ S 1 0 0 b . Ca2+ 曲線 1， 2， 3は各々 Mg. /TFP/ S l O O b . TFP/ S l O O bのスペクトルを指す。.

(4) Mg2+ 結合による豚脳 S 1 0 0 b蛋白の立体構造変化の特徴. z. 3.2 CR/S-l00bの可視部吸収スペクトル. 立体構造変化検出用の試薬が求められる。吸着指. 3 ・﹄﹂国}比. 増加は約 10%と僅かなため(図 1)，より鋭敏な. ︹開山一 C. 2+結合による TFP/S-100bの吸収ピークの Mg. 示薬としてよく用いられる CRに蛋白質表面の環境変化検出を期待し，. S-100bへの添加をおこ. 図 2。 ) CR/S-100bの吸収ピークの吸なった ( 光度は Ca2+結合，. Mg2+結合に伴ってそれぞれ. λ/nm. 始めの 72%， 78%へと明らかに減少した。また. 2+結合により CRの吸収ピークは 497nmから Ca 490nmへと移動し浅色効果を示した。一方. M l +の結合では吸収ピークは 484nmへ移動した. NS/S-100bの蛍光スベクトル図3 T 2+/Mg 2+/ 曲線 1， 2， 3， 4は各々 Ca S 1 0 0 b， 2+/ Mg2 +/ S 1 0 0 b，Ca S 1 0 0 b，S 1 0 0 bを指す。. ことから S-100bの CR結合サイト付近は更に疎. ことは，午脳 S-100蛋白への Mg2+結合が僅かな. 水性の環境へ移行したことがわかる。このことは. TNS蛍光強度の増加を示したこと 9)とは大きく. Mg2+結合よる CR結合サイト付近の立体構造変. 異なる。豚脳 S-100蛋白と牛脳 S-100蛋白とでは. 化は，. Ca2+結合によるそれよりも大きいことを. その立体構造に僅かな違いがあると推測される。また，これら TNS/S-100b錯体のスベクトルの. 意味する。. ピーク波長はそれぞれ4 30，4 3 6，4 2 0，427nmで. 2+結合では発光ピーあった。豚 S-100bへの Ca クは長波長側へ移動し，. 。。. 0 . 4. TNS結合サイト(戸サ. ブユニットの C端側にあると推測されている 8)). 丸、一川 r. CGAMOWA司. はより親水性の雰囲気に移行したことがわかる。一方，. S-100bへの. 長側へ移動し，. M l +結合ではピークは短波. TNS結合サイトは疎水性雰囲気. に移行したことがわかる。同様な現象は豚脳. 2+結合においても観られた(未 S-100aa 'の Mg ，. 発表)。図 3の結果は先の図 1， 2及び Cys残基蛍光修飾の結果 1 0 )を支持するものである。図 2 CR/S-100bの可視部吸収スベクトル曲f 来 1， 2， 3は各々 C R/S-IOOb，Mg2 +/CR/S-. 2+/CR/S-100bのスベクトルを指す。 1 0 0 b，Ca. 3 . 4 oフタルアルデヒド /S-100bの蛍光スペク卜jレ. 図 4に oフタルアルデヒド /S-100b各種錯体の. 3 . 3 TNS/S-l00bの蛍光スペクトル環境変化検出に鋭敏な TNS蛍光法で Ca2+，. 蛍光スベクトルを示す。前述の TNS/S-100bと同様，. Ca2+や Mg2+の結合で蛍光スベクトル強. Mg2+結合がスベクトルに及ぼす効果を調べた. 度は大きく増加を示した。スベクトルピークの. ( 図 3。 ) これらのイオンを結合すると. Ca2+ 相対強度比は S-100b， M g2+/S-100b，. TNS/S-100bの蛍光強度は大きく増加した。即ち，. 2+/S-100bに対しそれぞれ /S-100b， Ca2+/Mg. 2+ スベクトルピークの相対強度比は S-100b， Ca. 1 .0，1.8，2 . 1，2.4であった。親7 ] ( 性で、あるアミ. 2+/S-100bの 2+/S-100b， Ca2+/Mg /S-100b，Mg. ノ基付近においても，. . 1であった。この順にそれぞれし 3. 4 ， 4 . 3，5. Mg2+結合でも明白な構造変化が起きることが示. Ca2+結合は無論のこと. 7.

(5) 松出禎行. .Matsuda，B u l l .Chem.5 0 c .j p n .1 9 9 467 ，8 8 8 . 1 1 .S 1 2 .P .Bohlen.P .S t e i n .W.Dairman.S .Udenfriend. A r c h .B i o c h e m .B i o p h y s .1 97 3 .155，2 1 3 .. (旭川校教授). 0 4 0 0. 図4. 480. > ' / n m. 0 フタルアルデヒド/ S-100bの蛍光スベクトル. 曲線上. 2， 3， 4は各々 Ca2+/Ml+/S-100b，. Ca2+/S-100b，Mg2+/S-100b，S-100bを指す。. された。またピーク波長に関しては S-100bと他錯体とで明らかな差は認められなかった。まとめると，豚脳 S-100bへの M g2+結合は C 端側蛋白表面の疎水性領域をより疎水的雰囲気へ移行させるような大きな立体構造変化を起こす。一方，. Ca2+結合は疎水性領域をむしろ親水性雰. 囲気へと移行させる構造変化を起こす。また同蛋白への M g2+， Ca2+結合はアミノ基付近でも立体構造変化を起こす。. 文献 1.T .Isobe， T .Nakajima， T .Okuyama， Biochem.. B i o p h y s .Acta ，1 9 7 7，494，2 2 2 . 2. T .I s o b e， T .Okuyama， E u r . ] .Biochem.1 9 81 .116， 7 9 3.Y .Ogoma， T .Shimizu， H .Kobayashi， T .F u j i i， A . Y .Kondo， M.Hatano， Biochem.B i o p h y s Hachimori，. Acta ，1 9 8 9，997 ，1 8 8 . 4.R .S .Mani， B .E .Boyes， C .M.Kay， Biochemistry， 1 9 8 2，21，2 6 0 7 5.J .K .Harley， M.F .F i l l a t， C .Gomez-Moreno， G .T o l -. B i o c h e m i s t r y ，1 9 9 5，77 ， 5 3 9 l i n， 6.J .Baudier， N .Glasser， D .Gerard， ] .B i o l .Chem. 1 9 8 6，261，8 1 9 2 7.P .L .P i n g e r e l l i， H .Mizukami， A .S .Wagner， D .E . J .P .O l i v e r， ] .P r o t .Chem.1 9 9 0， 9，1 6 9 . B a r t n i c k i，. 8.J .B a u d i e r， D .G e r a r d， B i o c h e m i s t η1 ，1 9 8 3， 22 ， 3 3 6 0 . 9 .S .Matsuda ， Bul . lC hem.5 0 c .j p n .2 0 0 2，75 ， 2 5 0 3 .. B u l l .Chem.5 0 c .j p n .2 0 0 8， 81， 3 01 . 1 0 .S .matsuda，. 8.

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