Title
Mucopolysaccharidosis IV A : Molecular Cloning of the Human
N-acetylgalactosamine 6-Sulfatase (GALNS) Gene and Analysis
of the 5' -Flanking Region( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
中島, 芳博
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第265号
Issue Date
1994-02-16
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14862
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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目
中
島 芳
博(岐阜県)
博
士(医学) 甲第 265 号平成
6年
2月16
日学位規則第4条第1項該当
Mucopolysaccharidosis N A:MolecuIar Cloning of the Human N-aCetylgalactosamine6-Sulfatase(GALNS)Gene and Ana[YSis Of the5'-F暮anking RegIOn 審 査 委 員 (主査)教授
折
居 忠 夫 (副査)教授 江 崎 孝 行 教授 野 澤 義 則論
文
内
容
の 要旨
ムコ多糖症ⅠVA型は,リソゾーム酵素であるN-aCetylgalactosamine-6-Sulfatesulfatase(GALNS)の異常 による常染色休劣性の遺伝性疾患である｡本症は1929年MorquioおよびBrailsfordにより独立に報告された骨 系統疾患のプロトタイプで,短胴性の低身長,Ⅹ脚があり,知能は正常で軟骨内骨化障害を呈し,ケラタン硫酸, コンドロイチン6硫酸の排泄増加を特徴とする｡既に,当教室では,欠損酵素であるGALNSの精製,抗体の調 製を行い,その全長cDNAをクローニングし同定してきた｡また,数例の患者について病因と考えられる遺伝子 変異を同定している｡更に,in situ hybridization法によりGALNS遺伝子の染色体上の座位を16q24と決定し た｡ 今回,本疾患の遺伝子解析をゲノムレベルから進めるため,ヒトゲノミッタライプラリーよりGALNS遺伝子 のクローニングを行った｡また,プライマー伸長法により本遺伝子の転写開始点を決定した｡更に,調節領域の プロモーター活性を測定するためにCATアッセイを行った｡ 〈研究方法〉 正常人の白血球よりゲノムDNAを抽出し,Sau3AIで部分消化後,15-23kbを分画しスEMBL3に挿入しライ ブラリーを作成した｡助cんerよcんよαCOJよP2392を宿主としてファージクローン100万個を感染させ,32Pで標識 した全長cDNAをブロープとしてスクリーニングを行った｡得られた陽性クローンについて制限酵素地図を作 成し,塩基配列を決定した｡ 次に,22merの一本鎖DNAをプライマーとしてプライマー伸長法を行った｡プライマーの5'末端を32Pで標 識し,HeLa細胞及びヒト肝細胞より得られたmRNAとハイブリッド形成させ,逆転写酵素により転写開始部位 まで伸長させた｡得られた産物を6%アクリルアミドゲルにて電気泳動した｡ 更に,CATアッセイを行うため,非翻訳領域を7種類の長さに切断し,CATベクターに挿入した｡そのうち 3種類は逆方向に挿入した｡これらのプラスミドをHeLa細胞にトランスフェクションし,48時間培養した｡得 られた細胞から蛋白を抽出し,アセチルCoAを基質として,=Cで標識したクロラムフェニコールと反応させ て薄層クロマトグラフィーで展開した｡シンチレーションカウンターによりアセチル化したクロラムフェニコー ルの割合を計算した｡ 〈研究結果〉 1)入EMBL3ライブラリーのスクリーニングにより5種類のクローンを得た｡5つのクローンは,互いにオー バーラップし,CDNAの翻訳領域をすべてカバーしていることを確認した｡ 遺伝子は全長約50kbにおよび,14のエキソンに分かれ,それぞれのエキソンーイントロン境界部は共通配列 5に一致している｡プロモーター領域は他の多くのhousekeeping geneと同様にTATA,CCAAT boxは認めない が,GCの比率が高く(70.5%),4つのGC boxを第一エキソンの上流20-150bpに認めた｡ 2)プライマー伸長法により,ヒト肝細胞のmRNAにおいて2つの主要な転写開始点(開始メチオニンコドン より上流へ22bp及び58bp)を認め,HeLa細胞のmRNAにおいても同様の結果を得た｡ 3)CATアッセイの結果,単離された遺伝子がプロモーター活性を有することを確認した｡順方向に挿入した 場合,720bpから98bpまでの断片における活性が81bpにおいて著しく減少するため,この98bpがminimal promoterであると考えられた｡また,逆方向においても活性の上昇が認められ,本遺伝子のプロモーターは両 方向性であると思われる｡ 以上によりムコ多糖症IVA型の欠損酵素であるGALNSの遺伝子をクローニングし,全長約50kbで14のエキ ソンよりなることを明らかにした｡Sulfatase familyの中で,現在までにゲノム構造が解析されているものは5 つあり,本酵素は6番目となる｡これら6つの酵素の間で,アミノ酸レベルでは30-35%のホモロジーを有してい るが,エキソンーイントロン構造においては特に共通性を認めなかった｡ CATアッセイにおいて決定したminimalpromoterには,4つのGC boxのうちの最下流の1つが含まれて おり,これが転写因子の一つであるSplの結合部位として重要であることが示唆された｡更に,逆方向のプロモー ター活性を有することは,本遺伝子のプロモーターが他の両方向性プロモーターと同様に,別の遺伝子の制御を も行っている可能性があると思われる｡ これらの遺伝子構造の解析は,今後患者における変異のスクリーニングおよびゲノムレベルでの患者解析に応 用していく予定である｡
論文審査の結果の要旨
申請者中島芳博は,ムコ多糖症IVA型の欠損酵素であるGALNSの遺伝子クローニングを行い,その遺伝子は 全長約50kbで14のユキソンと13のイントロンからなり,TATAおよびCCAAT boxは認めないが,GCに富み, 4つのGC boxを認めた｡さらにこの遺伝子は2つの転写開始点とプロモーター活性を有することを明らかに した｡ この研究は,小児科学の進歩並びにムコ多糖症ⅠVA型のゲノム遺伝子レベルでの病因の解明に少なからず寄 与するところが大きいものと認める｡ [主論文公表誌]MucopolysaccharidosisIV A:Molecular Clonlng Of the Human N-aCetylgalactosamine6-Sulfatase
(GALNS)Geneand Analysis of the5'-Flanking Region
平成6年3月発行 Genomics20:99∼104
