H26説明配布資料_斎藤芳郎HP用.pptx

平成

26

年度　新技術説明会　創薬分野

October 28, 2014

新規糖尿病バイオマーカーを標的とする

２型糖尿病治療薬

 

 

斎藤�芳郎�

同志社大学�生命医科学部�医生命システム学科�

・准教授��

従来技術とその問題点

 

問題点

①：医師が薬剤を選択する

医学的判断基準が無い

 

問題点

②：投薬治療が、試行錯誤

となり、多くの無駄を含んでいる

 

糖尿病に対する薬剤の選択に医学的な判断基準はなく、臨床医の経験

に基づいて行われているのが現状

現状の問題点

糖尿病患者

 

医師による薬剤の選択・

投与

 

血糖値・

HbA1ｃ値

による投薬の評価

 

効果が見られない場合

 

試行錯誤

新技術の特徴・従来技術との比較

 

糖尿病態において悪玉となる分子（セレノプロテインＰ）を標的とした薬剤の開発

→テーラーメイド２型糖尿病治療の実現

境界型・糖尿病型

 

→血中ＳｅＰ濃度の測定  

ＳｅＰ高値群

 

→ＳｅＰによるインスリン抵抗性の増加  

ＳｅＰを標的とした治療薬の選択

 

→糖尿病のテーラーメイド治療法の実現  

インスリン抵抗性を増加し、

糖尿病を悪化する“セレノプ

ロテインＰ”を同定

 

（_{Cell  Metabolism,  12,  483-­‐495,  2010）}  

セレノプロテインＰ（

SeP）の

活性を抑制する手法を開発

 

（新技術）

 

本研究の目指すテーラーメイド２型糖尿病治療

必須微量元素セレン

 

S

O

abundance in man

75 kg

49 kg

(65%)

190 g

(0.25%)

13 mg

(1.7x10

-5

_%)

Se

75  kgの成人に含まれる

各元素量

E

: major element

E

: minor element

E

: trace element

(96%)!

(3.6%)!

(0.4%)!

主要元素　　

少量元素　　

微量元素　　

●Human  Study  

1.

克山（ケシャン）病

：中国・克山の風土病。土壌中のセレンが少ないため、

 

　セレン欠乏化

_→重篤な

心筋症

を生じる。

 

2.血中セレンの低下（土壌中セレン濃度の低い地域）→

動脈硬化

・

ガン

発症率

 

　の増加

 

3.

HIV感染者

で血中セレン濃度の低下

→生存率の低下

●Animal  Study  

1.餌に含まれるセレンが、

免疫機能

や

雄性生殖

-­‐精子形成

に重要

 

2.セレン含有蛋白質を作れないマウスー

初期胚性致死

 

translation

selenoprotein

N C Met Sec stop

SECIS : Sec insertion sequence

other protein _{Met stop} mRNA 5' SECIS AUG UGA UAA or UAG 3' Sec

セレン含有蛋白質（セレノプロテイン）

 

NH

2

-CH-COOH

Se

H

CH

2

selenocysteine

(Sec)

セレノシステイン

? ? glutathione peroxidase (GPx) thioredoxin reductase (TR) iodothyronine deiodinase selenophosphate synthetase 15 kDa selenoprotein selenoprotein W selenoprotein function ROOH ROH T4 T3 redox regulation ATP + H2Se H3SePO3 + AMP selenoprotein P ROOH ROH

Se Transporter

セレン含有タンパク質の生合成機構

セレノプロテインＰ

 (selenoprotein  P,  SeP)  

Sec

His-rich

Sec-rich

血漿中の主要なセレノプロテイン!

3'

5'

UAA

AUG

UGA

2 SECIS

SeP mRNA

SECIS : Sec insertion sequence!

69 ｋDa (362 アミノ酸）の糖タンパク質!

主に肝臓で生合成!

血漿濃度　5.3 μg/ml!

#ヒトSePタンパク質の!

　精製法を確立!

#11種類の抗SePモノ!

　クローナル抗体を作成!

SePに対するサンドイッチ

ELISA

の開発

 

BD1

HRP : horseradish peroxidase

AH5

SeP

HRP

SeP

1000

100

10

1

SeP (ng/ml)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

A

45 0

10000

Plasma

concentration

5.3 ± 1.1 µg/ml

(n=77)

1  Y  Saito,  N  Sato,  M  Hirashima,  G  Takebe,  S  Nagasawa  and  K  Takahashi  (2004)  Biochem.J.,  381,  841-­‐846  

2  Y  Saito,  T  Hayashi,  A  Tanaka,  Y  Watanabe,  M  Suzuki,  E  Saito  and  K  Takahashi  (1999)  J.  Biol.Chem.,  274,  2866-­‐2871  

3  G  Takebe,  J  Yarimizu,  Y  Saito,  T  Hayashi,  H  Nakamura,  J  Yodoi,  S  Nagasawa,  and  K  Takahashi  (2002)  J.Biol.Chem.,  277,  41254-­‐41258   4  Y  Saito  and  K  Takahashi  (2002)  Eur.J.Biochem.,  269,  5746-­‐5751  

N末端

Sec  x  1

His-­‐rich

C末端

酵素活性部位

セレンに富む部位

過酸化脂質の還元

2,3

細胞へのセレンの供給

4

Sec:  セレノシステイン  

 His-­‐rich:  ヒスチジンに富む部位

Sec  x  9

SePの構造と機能

1

!

OOH

synthesis of selenoproteins

reduction of

phospholipid

SO

3

-SO

3

-heparan sulfate

phospholipid

Se-

transporter

-OOH

redox control

oxidative

stress

LDL

SePの生理機能ー酸化ストレス防御

!

Reduce phospholipid

hydroperoxide!

Oxidative

stress!

動脈硬化・癌の抑制

糖尿病病態に影響するヘパトカインの探索

 

ー金沢大学　医薬保健総合研究科 恒常性制御学・御簾先生

、

篁先生との共同研究

 

糖尿病患者・肝臓の

 

網羅的遺伝子発現解析

血糖値やインスリン抵抗性と

相関するヘパトカインの探索

セレノプロテインＰ（

_{SeP）の発現・}

血漿濃度が血糖値やインスリン

抵抗性と相関する

肝臓

SePの発現および血漿SeP濃度と糖尿病病態

_*

●  SeP発現量-­‐糖負荷後120分の  

　血漿グルコース濃度

●  血漿SeP濃度-­‐空腹時血糖

*H Misu, T Takamura, Y Saito, K Takahashi and S Kaneko et al (2010) Cell Metabolism, 12, 483-495

SePの増加はインスリン抵抗性を増加する

*

●  SeP投与によるグルコース負荷後  

　血糖値の増加

●  SeP投与によるインスリン投与後  

　血糖値の増加

糖負荷

インスリン投与

*H Misu, T Takamura, Y Saito, K Takahashi and S Kaneko et al (2010) Cell Metabolism, 12, 483-495

セレンのサプリメントによる弊害ー大規模臨床試験からの報告

 

●セレンの抗がん作用・抗動脈硬化作用  

 ↓  

　

セレンのサプリメント効果の検証（１３１２人が参加）

 

　ー大規模臨床試験

 the  Nutri[onal  Preven[on  of  Cancer  Trial（NPC試験）  

 

毎日

_200μ

ｇのセレン摂取

（

_{1日の所要量の約10倍、日本人の所要量の2倍）}  

 ↓  

　糖尿病を発症するリスクが高まる可能性

(Ann  Intern  Med  2007;147:217-­‐23)

※セレンや抗酸化物質ビタミン

Eのサプリメントとしての有用性評価（３万５千人が参加）  

ー

_{Selenium  and  Vitamin  E  Cancer  Preven[on  Trial（SELECT試験）で現在も検証されている}

高血糖は

SePの発現を誘導する

●  糖尿病モデル動物に

おける

_SePの増加

*H Misu, T Takamura, Y Saito, K Takahashi and S Kaneko et al (2010) Cell Metabolism, 12, 483-495

●  グルコースによるSePの誘導

SeP-injected mice, although those of glucagon and GLP-1 were

unaffected during a glucose tolerance test (

Figure S1

C). Western

blot analysis showed a reduction in insulin-induced serine

phosphorylation of Akt in both liver and skeletal muscle of

SeP-injected mice (

Figures 3

J and 3K).

Hyperinsulinemic-eugly-cemic clamp studies showed that treatment with SeP

significantly increased endogenous glucose production and

de-creased peripheral glucose disposal (

Figure S1

D and

Figures 3

L

and 3M). Additionally, serum levels of injected human SeP

protein negatively correlated with rates of peripheral glucose

disposal (

Figure S1

E). These data indicate that SeP impairs

insulin signaling in the liver and skeletal muscle and induces

glucose intolerance in vivo.

D

A

B

SEPP1 mRNA levels in liver

0.5 1.0 1.5 2.0 350 250 200 150 Glucose 120 min.(mg/dL) 300 R = 0.33 (p=0.049)2

SEPP1 mRNA levels in liver

0.5 1.0 1.5 2.0 12.0 8.0 4.0 0.0 MCR (mg/kg/min) R = 0.43 (p=0.021)2

Serum SeP levels (µg/mL) 250

200 150

Fating Plasma Glucose (mg/dL)

300 R = 0.17 (p=0.014)2 2.0 4.0 6.0 8.0 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 8.0 6.0 HbA (%) 10.0 R = 0.27 (p=0.002)2 1c

Serum SeP levels (µg/mL)

E

1.0 0.5 ** 1.5 KK KKAy

0.0

2.0

1.0

*

LETO OLETF

0.0

2.0

1.0

Relative Sepp1 mRNA levels normalized to 18s rRNA

*

3.0

OLETF LETO OLETF LETO

0.0

1.0

0.5

*

1.5

KKAy KK SeP CBB stain SeP CBB stain Relative Sepp1 mRNA levels normalized to 18s rRNA DM Healthy

8.0

4.0

2.0

6.0

Serum SeP levels ( µg/mL)

0.0

*

F

H

G

C

SEPP1 mRNA levels in liver

0.5 1.0 1.5 240

160 120 80

Fasting Plasma Glucose (mg/dL)

200 R = 0.13 (p=0.054)2 Relative SeP protien levels normalized to CBB stain

I

J

Relative SeP protien levels normalized to CBB stain KKAy KK

Figure 1. Elevation of Serum SeP Levels

and Hepatic Sepp1 Expression in Type 2

Diabetes

(A–C) Individual correlations between hepatic SEPP1 mRNA levels and metabolic clearance rate (MCR) of glucose (A), postloaded plasma glucose levels (B), and fasting plasma glucose levels (C) in humans (n = 12–17). MCR equals the glucose infusion rate divided by the steady-state plasma glucose concentration, and is a measure of systemic insulin sensitivity. MCR values were determined by glucose clamp. SEPP1 mRNA levels were quantified with DNA chips.

(D and E) Correlations between serum levels of SeP and fasting plasma glucose levels (D) and HbA1c (E) in people with type 2 diabetes (n = 35).

(F) Serum levels of SeP in people with type 2 dia-betes and healthy subjects (n = 9–12). Age and body weight were not significantly different between the two groups. Data represents the means ± SEM from two groups. *p < 0.05.

(G and H) Hepatic Sepp1 mRNA levels in an animal model of type 2 diabetes (n = 5–6).

(I and J) Serum SeP levels in an animal model of type 2 diabetes. SeP was detected by western blotting. Coomassie brilliant blue (CBB)-stained gel is used as a control for protein loading. Graphs display the results of densitometric quantification, normalized to CBB-stained proteins (n = 5).

Data represent the mean ± SEM from five to six mice per group. *p < 0.05, **p < 0.01. See also

Tables S1–S5.

Knockdown of Sepp1 in Liver

Improves Glucose Intolerance

and Insulin Resistance in Mice

with Type 2 Diabetes

To determine whether knockdown of

endogenous Sepp1 enhances insulin

signaling, we transfected H4IIEC

hepato-cytes with Sepp1-specific small

inter-fering RNA (siRNA), and we observed a

reduction in endogenous Sepp1 mRNA

and SeP protein levels (

Figures 4

A and

4B). Insulin-stimulated serine

phosphory-lation of Akt was enhanced in these

treated cells (

Figure 4

C). Similarly, delivery

of Sepp1-specific siRNAs into KKAy mice

via a hydrodynamic transfection method (

McCaffrey et al., 2002;

Zender et al., 2003

) resulted in a 30% reduction in SeP protein

levels in the liver and blood (

Figures 4

D–4G and

Figure S2

).

Knockdown of Sepp1 improved both glucose intolerance (

Figures

4

H and 4I) and insulin resistance (

Figures 4

J and 4K) in KKAy mice.

SeP-Deficient Mice Show Improved Glucose Tolerance

and Enhanced Insulin Signaling in Liver and Muscle

We further confirmed the long-term effects of lowered SeP using

Sepp1 knockout mice (

Hill et al., 2003

). SeP knockout mice were

viable and displayed normal body weights when maintained on

a selenium-sufficient diet. Body weight, food intake, and O

₂

consumption were unaffected by SeP knockout (

Figures S3

A

Cell Metabolism

Hepatokine Selenoprotein P and Insulin Resistance

Cell Metabolism 12, 483–495, November 3, 2010

ª2010 Elsevier Inc. 485

and S3B). Lipid accumulation in the liver and adipose tissues

was also unaffected (

Figure 5

A). However, postprandial plasma

levels of insulin were reduced in Sepp1

!/!

mice, although blood

glucose levels remained unchanged (

Figures 5

B and 5C).

Glucose loading test revealed that Sepp1

!/!

mice showed

improved glucose tolerance (

Figure 5

D). Insulin loading test

revealed that Sepp1

!/!

mice showed lower blood glucose levels

60 min after insulin injection (

Figure 5

E). Insulin signaling,

including phosphorylation of Akt and insulin receptor, was

enhanced in the liver and skeletal muscle of Sepp1

!/!

mice

(

Figures 5

F–5K). Additionally, Sepp1

+/!

tended to show

enhanced insulin sensitivity. Plasma levels of glucagon, active

GLP-1, and total GIP were unaffected by the loss of SeP in

both fasted and fed mice (

Figure S3

C), suggesting that SeP

dysregulated glucose metabolism in vivo primarily by modulating

the insulin pathway, but not by affecting other hormones,

including glucagon, GLP-1, and GIP.

SeP Deficiency Attenuates Adipocyte Hypertrophy

and Insulin Resistance in Dietary Obese Mice

To determine whether SeP deficiency reduces insulin resistance

caused by diet-induced obesity, we fed SeP knockout mice

0.0 0.4 0.2 Relative Sepp1 mRNA levels normalized to 18s rRNA ** 30 mM Glucose 0.6 30 mM Mannitol 0.0 0.4 0.2 ** 0.6 0.8 0.25 mM Palmitate Vehicle 0 1.0 mRNA

levels normalized to 18s rRNA

Sepp1 * 0.5 Ad libitum Refed 1h Fast Refed 3h Refed 2h Pck1 G6pc * * ** ** ** ** ** ** ** _** 30 mM Glucose

30 mM Mannitol 5m M Glucose 25 mM Glucose

SeP

GAPDH

Insulin (µg/mL) 0 0.25

0.5

1.0

0.0 0.5 1.0 * * * Relative mRNA levels normalized to 18s rRNA 0.0 0.2 0.1 ** 0.3 0 0.5 0.4 ** Time of insulin (h) ** 12 6 3 Relative Sepp1 mRNA levels normalized to 18s rRNA Relative Sepp1 mRNA levels normalized to 18s rRNA

SeP

GAPDH

SeP

_GAPDH

0.25 mM Palmitate Vehicle Vehicle Insulin 1.0 µg/mL Insulin 0.1 µg/mL Insulin 2.0 µg/mL * * * Sepp1 Pck1

A

B

C

D

E

F

G

H

Primary hepatocytes Primary hepatocytes

Primary hepatocytes

Figure 2. SeP Expression Is Regulated by Glucose, Palmitate, and Insulin

(A) Sepp1 mRNA levels in H4IIEC hepatocytes treated with glucose or mannitol (30 mM) for 6 hr (n = 4). (B) SeP protein levels in primary hepatocytes treated with glucose or mannitol for 6 hr.

(C) Sepp1 mRNA levels in H4IIEC hepatocytes treated with palmitate (0.25 mM) for 16 hr (n = 5). (D) SeP protein levels in primary hepatocytes treated with palmitate (0.25 mM) for 16 hr.

(E) Sepp1 and Pck1 mRNA levels in H4IIEC hepatocytes treated with various concentrations of insulin for 6 hr (n = 4). (F) Sepp1 mRNA levels in H4IIEC hepatocytes treated with insulin (0.1 mg/ml) for the indicated periods of time (n = 4). (G) SeP protein levels in primary hepatocytes treated with various concentrations of insulin for 6 hr.

(H) Liver Sepp1, Pck1, and G6pc mRNA levels in C57BL/6J mice following fasting for 12 hr and subsequent refeeding (n = 4).

Data in (A), (C), (E), and (F) represent the means ± SEM from four to five cells per group, and data in (H) represent the means ± SEM from four mice per group. *p < 0.05, **p < 0.01.

Cell Metabolism

Hepatokine Selenoprotein P and Insulin Resistance

糖尿病の発症・進展

糖尿病発症へと至る

SePを介した負のスパイラル

 

カロリー過多や

 

糖分の取り過ぎ

高血糖

SePの増加

インスリン

 

抵抗性の増加

高セレン食や

 

サプリメント？

セレノプロテインＰのセレン運搬作用と糖尿病

_!

脳

精巣

リンパ球

骨格筋

SeP

diabetes

SeP

SeP

SeP

肝臓

過剰セレノプロテインＰによるインスリン抵抗性増加機構

 

Insulin

IR

Gene    

Expression

Glut4

_NOX4

H

₂

O

₂

GPx,  glutathione  peroxidase;  SeP  R,  SeP  receptor;  IR,  insulin  receptor;    

Glut4,  glucose  transporter  type  4;  NOX4,  NADPH  oxidase  4;  H2O2,  hydrogen  peroxide  

AMPK,  AMP-­‐ac[vated  protein  kinase  

AMPK

SeP

SeP  R

GPx

インスリン抵抗性の増加

セレンの供給

Insulin

IR

Gene    

Expression

Glut4

_NOX4

H

₂

O

₂

SeP

SeP  R

GPx

インスリン抵抗性の増加

SePの結合  

阻害

 

インスリン抵抗性

 

の改善

 

　　　血漿

SePを標的とした

2

型糖尿病治療薬の創出（作用仮説）

AMPK

過剰

SePによる血管新生の抑制*  

*K Ishikura, H Misu, Y Saito, S Kaneko, and T Takamura et al (2014) Diabetologia, 57, 1968-1976

SeP増加マウスにおける損傷治癒

の遅延

control

+SeP

後肢虚血後の血流回復ー

_SeP

+/-­‐

_{マウスにお}

ける回復亢進

WT

SeP

+/-­‐

想定される用途

 

糖尿病治療用の抗体医薬

糖尿病治療用

SeP結合阻害剤（低分子化合物・ペプチド）の

探索

糖尿病・血管合併症治療用の抗体医薬

研究試薬・サプリメント・予防薬への展開など

実用化に向けた課題

 

抗体医薬としては、ヒト化が必要

低分子化合物・ペプチド化

動物実験にて、

SeP結合阻害薬の糖尿病・血管合併症治療

企業への期待

 

ヒト化抗体作成のノウハウ

低分子化合物・ペプチドのライブラリー

糖尿病・血管合併症のモデル等、研究実績

本技術に関する知的財産権

 

発明の名称：２型糖尿病の治療及び／又は予防薬

 

出願番号：特願

2013-­‐175612  

出願人：同志社大学

 

発明者：斎藤芳郎、吉岡佑弥、中山華穂、西藤有希奈、

 

　　　　　三田雄一郎、野口範子

発明の名称：２型糖尿病の治療及び／又は予防薬

 

出願番号：特願

2014-­‐165695（優先権主張出願）  

出願人：同志社大学

 

発明者：斎藤芳郎、中山華穂、三田雄一郎、野口範子

産学連携の経歴

 

・

2003年-­‐2004年　三菱電機と共同研究実施  

・

2007年-­‐2008年　東亞合成株式会社との共同研究実施  

・

2010年-­‐2011年　株式会社同仁化学との共同研究実施  

・

2010年-­‐2011年　株式会社アルフレッサファーマ社と  

 

 

 

 

 共同研究実施  

・

2011年-­‐2012年　JST  A-­‐STEP  FSシーズ顕在化タイプに採択  

・

2012年-­‐2013年　JST  A-­‐STEP  FSシーズ探索タイプに採択  

・

2012年-­‐　　　　　  JST  A-­‐STEP  ハイリスク挑戦タイプに採択  

・

2014年-­‐　　　　　株式会社ファンケルと共同研究実施

お問い合わせ先

 

同志社大学

 

リエゾンオフィス　産官学連携コーディネーター

 

尾崎　安彦

 

 

TEL：0774-­‐65-­‐6223  

FAX：0774-­‐65-­‐6773  

E-­‐mail：rs-­‐[email protected]