SOP番号 GEN113-2 Ver.2
標
準
操
作
手
順
書
GeneChip
のスキャニング（
AutoLoader
）
（
AGCC
）
承認
年
月
日
目 次 分類 項目 ページ GEN113 Ver.2 作業手順の流れ図 1. 序 2. 試薬・器具 3. スキャニングの方法 4. グリッドの確認 5. データ解析 6. Scal検量線のプリントアウト 7. QCレポートの設定 8.データのアップロード 8.補足 1 2 2 2－7 7－8 9－12 13－14 15－17 17―18 18－19
作業手順 作業手順 作業手順 作業手順
1 1 1 1 序序序序
本SOPは、GeneChip Autoloaderによるスキャニングについて記載する。 2
2 2
2 試薬試薬試薬試薬・・・・器具器具器具器具
1) Wash A液（Non-Stringent Wash Buffer） GEN112参照 3 3 3 3 スキャニングのスキャニングのスキャニングのスキャニングの方法方法方法方法 3-1 洗浄・染色後のスキャニング 1) スキャナーのスイッチをONにする（使用可の状態になるには15分程度必要。ス イッチは①PC、②スキャナー、③Fluidics Stationの順に入れる。通常は、洗浄・ 染色の前に付けておく）。 2) PCにログインする。 3) 電源を入れてから10分程経過後、スキャナーの左の緑色ランプのみ点灯してから、 Launcher を起動しAGCC Scan controlをクリックする。
（緑色と黄色が点灯している場合は準備中である。AGCC Scan controlの起動は 行わない）
Affymetrix GeneChip Scanner 3000 AutoLoader Affymetrix GeneChip Scanner 3000 AutoLoaderAffymetrix GeneChip Scanner 3000 AutoLoader Affymetrix GeneChip Scanner 3000 AutoLoader
( ( ( ( 起動前起動前起動前 )起動前))) (((( 起動起動起動起動 直後直後 )直後直後))) (( 待機中((待機中待機中 )待機中))) 点滅時 点滅時 点滅時 点滅時 はエラーはエラーはエラーはエラー ( (( ( スキャンスキャンスキャン ＯＫスキャンＯＫＯＫ )ＯＫ))) 点滅時 点滅時点滅時 点滅時 はスキャニングはスキャニングはスキャニングはスキャニング中中中中 ( ( ( ( 起動前起動前起動前 )起動前))) (((( 起動起動起動起動 直後直後 )直後直後))) (( 待機中((待機中待機中 )待機中))) 点滅時 点滅時 点滅時 点滅時 はエラーはエラーはエラーはエラー ( (( ( スキャンスキャンスキャン ＯＫスキャンＯＫＯＫ )ＯＫ))) 点滅時 点滅時点滅時 点滅時 はスキャニングはスキャニングはスキャニングはスキャニング中中中中
4) 洗浄及び、染色の終わったGeneChipをFluidics Stationから取り出し、GeneChip の中がWash A液 ※ で完全に満たされていること、泡が入っていないことを確認す る（Wash A ※ に泡が入っているなど完全に満たされていない場合は、Wash A液 ※ を追加補充する）。
※ HWS Kitを使用した場合は、Array Holding buffer
5) 液漏れしたチップは、チップの外側に付着した液を完全に拭き取る。GeneChip裏 面のSeptaをTough Spotsシールで塞ぐ。Tough Spots (3/8diameter)は、必ず2 つのSeptaに貼る（片方だけ貼るとスキャンの際にフォーカスがずれる可能性が ある）。Tough Spotsは、外側又は内側にはみ出さないようにして貼る。外側には み出すとスキャナーに詰まる恐れがある。内側にはみ出すと、オートフォーカス が合わない恐れがある。 6) 洗浄染色後、スキャニングまで時間があく場合は、GeneChipを保冷庫（15℃）で 保存する。 注）洗浄染色後、すぐにスキャニングを行う場合は、保冷庫に保存する必要はない。 7) フタを両手で開け､中からCarouselを取り出す。 8) GeneChipをCarouselの1番（赤い印）から順にセットしていく(順番を間違えて もバーコードが正常に登録されていれば問題なし)。その際、GeneChipのガラス 表面にゴミの付着やチップ内に泡がないことを確認する。必要に応じて、エアー ダスター等で埃を除去する。 なお、チップ登録時にGeneChipに貼ってあるチップIDシールは実験記録書に貼 っているため、チップIDシールは付いていない。
9) Carouselを再び本体にセットする。Carouselの底の部分を合わせてCarouselを 回して完全にはまる様取り付ける（完全にセットされると「カチッ」と音がする）。 (Autoloaderの底の部分とCarouselの底の部分を合わせて取り付ける。下図の番 号を参照にしてはめる)
10) LauncherからAGCC Scan control softwareを起動しStartアイコンをクリック してScannerの画面（下図）を開く。
［Arrays in carousel positions 1-4 at room temperature］ 一回目のスキャニングする場合に選択する。 （室温に戻すため約10分間必要） ［Allow rescans] 一度スキャンしたGene Chipを再スキャニングする場合に選択する。 （その場合、新しいDATファイルは別の名前で保存され、以前のDAT ファイルは上書きされない） 11) OKボタンをクリックする。 Autoloaderのドアがロックされ、スキャニングが開始される。
（AutoLoaderがChipの位置とGeneChip IDを認識するのに約2分間必要） 12) 全部のGeneChip のスキャン終了後、GeneChipを取り出す (Autoloaderのドア
部分のランプが消える)。
13) スキャニング終了後、AGCC Viewer から必要なサンプルのDAT ファイルをク リックし、グリッドのチェックを行う 。 14) 画像を確認して異常（染色が薄い、染色むら、白く抜けているなど）が見られる 場合は工程責任者に連絡し、記録を残すためにこの画像をクリップボードへコピ ー し 、ペ イン トへ 貼り 付け 印 刷す る。 打ち 出し 用紙 に 、日 付、 チッ プＩ Ｄ及 び WorkingＩＤを記入する。 また、工程責任者の指示に従い、スキャンイメージをCD-Rに保存する（CD-Rへ の保存については、GEN115に記載）。
スキャンのみを行う場合（染色洗浄を伴わない場合） ::::サンプルサンプル情報サンプルサンプル情報情報情報ののの入力後の入力後入力後入力後、、サンプル、、サンプルサンプル情報登録サンプル情報登録情報登録情報登録するするするする。。。。 15) バーコードリーダーを使用し、テンプレートにサンプル情報の入力を行う。サン プルIDとチップIDは、DENSO製のバーコードリーダーでしか読み取ることは 出来ない。 Gene Chipのバーコードラベルは、原則としてスキャナーに付属しているバーコ ードリーダーで読み取りを行う。その際バーコードリーダー上部のランプを中央 又は左に点灯させ(頭のボタンを押す)、バーコードを読み取る。 ただしTGPにおいてはDENSO製のバーコードリーダーを使用する。 16) AGCC Portal→SAMPLES→ Batch Register
17) Browseをクリックして、Choose Fileダイアログボックスを開く。
18) ファイルを選択してオープンをクリック。 19) アップロード を押し、入力済みのファイルをアップロードする。 20) 確認画面が表示されるので内容を確認しsaveを押す。（Cancelをクリックすると 内容を修正できる。） 21) 完了画面が表示される。 22) GeneChipのスキャナーへのセット及びスキャニングを行う。 3-2 マニュアルモードでスキャニングを行う場合
1) 「EditEditEditEdit」→「OptionOptionOptionOption」をクリックして、Scanner Option画面を表示する。
2) 「Enable Manual ModeEnable Manual ModeEnable Manual ModeEnable Manual Mode」をチェックし、OKをクリックする。 3) Startアイコンをクリックし、Scannerの画面を開く。
Sample File Name Sample File Name Sample File Name
Sample File Name、、、、ArrArrArrArray Nameay Nameay Nameay Nameを選択タブを使って選択し、バーコードを確認 し、Startボタンを押す。
3-3 GeneChipが室温の状態であれば、Arrays in carousel positions 1-4 at room temperatureにチェックをしてOKボタンを押す（以下3-1.13～16参照）。
スキャナーのランプが準備中(緑色と黄色が点灯)のままで、スキャニング可能(緑色) にならない場合
1) 「EditEditEditEdit」→「OptionOptionOptionOption」をクリックして、Scanner Option画面を表示する。 2) 「Turn on Turn on LTurn on Turn on LLasLaser at startupasaser at startuper at startuper at startup」にチェックを入れ、「OKOKOKOK」をクリックする。
4 4 4 4 グリッドのグリッドのグリッドのグリッドの確認確認確認確認 1) 各コーナーのアイコンをクリックしてグリッドがずれていないか確認する（拡大 する場合は拡大アイコンをクリックする。クリックする毎に拡大する）。
2) 四隅の確認を行ったら、「FullFullFullFull ImageImageImageImage」をクリックして、元の大きさの画面に戻す。
3) ボタンを押してから、スキャンイメージ中央の十字をマウスでドラッグして囲む。 画面を拡大し、グリッドがずれていないことを確認する。 4) グリッドがずれている場合は、マニュアル操作でグリッドを合わせる。 グリッドの グリッドのグリッドの グリッドの合合合合わせわせわせわせ方方方方 • 下図のようにグリッド線がコーナーの白い四角に合っていない場合
Image Processing→Realign All Griadsであわせる。それでだめな場合は 手動でグリッドを合わせる。
• チップ本体のゴールドの枠がずれているため、グリッドがずれている場合
下図のようにチップ本体のゴールドの枠がずれているため、グリッドが完全に合わ ない場合がある。
5 5 5 5 データデータデータデータ解析解析解析解析 PivotData 以 下 へ フ ォ ル ダ を 作 成 す る 。フ ォ ル ダ 名 は”ワ ー キ ン グ ID” (例 ； W00123) とする。
Expression Console (ECと記載)を起動する。 user profileはデフォルトのままでよい。
5-1 Studyの作成
EC では、同時に解析・評価する複数のデータ（CEL ファイル、CHP ファイル） の組をStudyという名前で管理する。通常、StudyはWorking IDごとに作成する。 な お 、EC で は 、CEL フ ァ イ ル の こ と を intensity file、CHP フ ァ イ ル を summarization fileと呼んでいる。
登録できるのは同じ Array のデータのみ。（Human と Mouse のデータを１つの Studyに登録はできない。）
1) Study の作成は、File → New Study または Toolbox の Study → (1) Create New Studyで Affymetrix Study windowを表示して行なう。
既存のStudyは、File → Open Studyまたは ToolboxのStudy → (2) Open Existing Studyで開く。
2) StudyへのCELファイルやCHPファイルの登録は、「Add intensity Files」、「Add Summarization Files」を実行してフォルダ-ファイルを選択することで行なう。 ここではC:¥Command_Console¥Data¥DefaultからCELファイルを呼び出す。
CELファイルを登録する場合は、ECで設定したLibrary pathにそのアレイのライブラリ ファイルが無い場合はエラーが表示される。
5-2 3’IVT Arrayの解析 1) 発現解析アレイの解析
• Study画面で解析したいCELファイルにチェックを入れ、Run Analysisボタンを クリックする。
• 解析アルゴリズムの選択画面が表示されるので、MAS5を選択する。
Defaultは一番上にリストされているRMAになっているので注意すること。
• 解析はメニューからAnalysis → 3’ Expression Arrays → アルゴリズムの選択。 あるいは、ToolboxからAnalysis → (1) Run Analysisでも可能。
• CHP ファイルのファイル名に suffix を設定する画面が表示されるが、ブランクの まま、OK をクリックする。アルゴリズム名はここでの設定にかかわらず自動的に 付加される。
• 解析を開始すると、画面下部に実行中のインジケータが表示される。
• 解析が完了するとCHPファイルのリストがStudy画面に表示される。設定された report thresholdから外れた値があるCHPファイルはThreshold Test欄にOutside Boundsと表示されハイライトされる。正常な場合はWithin Boundsと表示される。
5-3 GCOSのPivot表示に相当するデータの保存（CHPファイル） 1) Study画面でグラフを表示したいCHPファイルにチェックを入れる。 2) (解析の終了したCELファイルのチェックは外す。)
4) 表 示 す る 項 目 は 、 メ ニ ュ ー か ら Edit →Probe level Summarizations Report Options…で設定する。
5) ここではSignalとDetection (MAS5) にチェックを入れる。
5-4 Pivotテーブルのテキストファイルへの書き出し
他のソフトウェアで利用するために、デスクトップに作成したフォルダへ Pivot
表示のデータをテキストファイルとして出力する。Pivot データのファイル名は"
ワーキングID_PivotData" (例；W00123_PivotData.TXT) とする．
1) Pivotの表（Probe Set Results）で右クリックして表示されるメニューからExport Table As TXTを実行する。
• メニューから選択する場合は、Study画面で出力したい CHPファイルにチェック してExport → Export Prove Set Results (pivot table) to TXT … を選択する。
• ToolboxからはExport Results → (2) Results to TXT。
2) 「TGPSC」を起動しSplitタブを選択。そこへPivotDataファイルをへドラッグ ＆ドロップしStart Splitを実行すると、PivotDataファイルが分割され同じフォ ルダ内に作成される．
分割後のファイル名は"バーコードID" (例；003017345001.TXT) のみであるため、 ファイル名を右クリックし、「Rename」を選択してバーコード IDの前にサンプ ルID を入力（バーコードでスキャン）し、ファイル名を"サンプル ID-バーコー
6 6 6
6．．．．ScalScalScalScal検量線検量線検量線検量線のプリントアウトのプリントアウトのプリントアウトのプリントアウト
1) Scal3のアイコン（Shortcut to SVL.exeShortcut to SVL.exeShortcut to SVL.exeShortcut to SVL.exe）をクリックする (SCal3 Managerのウ ィンドウが表示されたままの状態にしておく)。
5-4,2) でデスクトップに作成したフォルダから，Scal補正を行うテキストファ イルをまとめてまとめてまとめてまとめて選択し、SCal3 Managerのウィンドウへドラックアンドドロップ する）。
2) All Save ボタン及び、All Printボタンを押して、保存とプリントアウトを行う。
ここへ ここへここへ ここへ目的目的目的目的のファイルをのファイルをのファイルをのファイルを ドラックアンドドロップする ドラックアンドドロップするドラックアンドドロップする ドラックアンドドロップする ここへ ここへここへ ここへ目的目的目的目的のファイルをのファイルをのファイルをのファイルを ドラックアンドドロップする ドラックアンドドロップするドラックアンドドロップする ドラックアンドドロップする
3) Scalデータ（下図）が印刷される。Scalデータを工程責任者に報告し、判断を仰 ぐ（すべてのGeneChipについて行う）。SSSSccccalalalalデータデータ用紙データデータ用紙用紙用紙にはには、にはには、、通、通通通しししし番号及番号及番号及び番号及びびび Working ID Working ID Working ID Working IDををを記入を記入記入記入しししし、、、、実験記録書実験記録書に実験記録書実験記録書ににに添付添付添付添付するするする。する。。。 4) 補足) 上記のシートについて、下記に各Scalデータの判定(色)の意味を記載する。 １ Spikes Flag スパイクのFlag情報で、Present (P)数が4～5個で青色、3個で黄色、2個以下で赤色。 ２ R2 of Fitting Curve スパイク検量線について、R2＞0.95で青色、R2＞0.85で黄色、それ以下で赤色。 ３ Reaction Efficiency 各プローブセットのシグナル強度が3'＞M かつ M＞5'であるプローブセットの数が4また は5個で青色、3個で黄色、2個以下で赤色。 ４ Segment Slope 各セグメントでの傾きが近似曲線の傾きと比べ±1以下であるかどうかをチェックし、4つ 全てが範囲内ならば青色、3つのみが範囲内なら黄色、それ以下ならば赤色。 ５ Spike Distribution スパイクのシグナル強度の分布が全シグナルの80%以上の領域をカバーしていれば青色、 60%以上なら黄色、それ以下ならば赤色。 １ ２ ３ ４ ５ ６
7 7 7 7 QQQQCCCCレポートのレポートのレポートのレポートの保存保存保存保存 1) QC Full レポートの表示 Study画面でQCレポートを表示したいCHPファイルを選択する。
メニューからReport → View Full Reportを実行するとTabular reportを表示す る。
Toolboxから選択する場合は、QC：Array Metrics → (1) Tabular Report 。
• 使用したアルゴリズムによって表示される項目は異なる。Thresholdから外れた項 目はハイライトされる。 2) QCレポートの保存 • 表示されたQCレポートの上で右クリック→Export Table As TXTで、5で作成し たフォルダへテキストファイルとして保存する。 3) QCレポートに出力するControlの設定。 • 解析時にどのControlをチェックするかを設定する。ここで設定したControlしか QC レポートで表示されない。デフォルトの設定はライブライファイルとしてダウ ンロードされている。 • ここで行った設定変更は、それ以前に解析済みのデータには影響しない。 • メニューから Edit → 3’ Expression Report Controls…. を実行。 • ToolboxからはConfiguration → (5) Specify report controls。
• Report Controls画面でArray Typeを選択し、出力するControlを選択する。
4) QCレポートの表示をカスタマイズする。
• QCのFullレポートから必要な項目のみを表示させる設定。
• 項目の設定。Study画面でCHPファイルを選択し、メニューからReport → New report を実行。
• Fullレポートの項目が表示されるので必要な項目を選択する。 • Up・Downボタンで表示順を設定。
• 既存の設定を編集する場合は、メニューから Report → Open Report で設定を開 く。
• カスタマイズしたレポートの表示はメニューからReport → View report を実行。 • 保存された設定のリストから選択する。
8 8 8
8 データのアップロードデータのアップロードデータのアップロードデータのアップロード
1) AGCC PortalからDATA→Upload Dataを選択する。
3) 完了画面が表示される。 9 9 9 9 補足補足補足補足 9-1 【スキャニング中にGeneChipを追加する場合】
1) 「ScannerScannerScannerScanner」→「Add ChipsAdd ChipsAdd ChipsAdd Chips」を選択するか、またはAdd Chipsのアイコンをクリ ックする。
以 下 の警 告 画面 が表 示され る。
2) 今すぐChipを追加する場合は、「Add NowAdd NowAdd NowAdd Now」スキャニング後にChipを追加する 場合は、「Add after ScanAdd after ScanAdd after ScanAdd after Scan」を選択する。「Add NowAdd NowAdd NowAdd Now」を選択するとスキャニング 中のChipのDATファイルが消去されるので、通常は「Add after ScanAdd after ScanAdd after ScanAdd after Scan」を選択 する。
9-2 【途中でスキャニングを中止する場合】
1) 「ScannerScannerScannerScanner」→「Stop ScannerStStStop Scannerop Scannerop Scanner」を選択するか、またはStopのアイコンをクリッ クする。
9-3 【スキャニングを再開する場合】
1) 「ScannerScannerScannerScanner」→「Resume AutoloaderResume AutoloaderResume AutoloaderResume Autoloader」を選択するか、またはResumeのアイコ ンをクリックする。
