分析機器・試薬アナリストのための Web 勉強会資料
Ⅱ
比色分析における分析精度と測定限界の関係
－分析装置の性能から考えた精度と限界－
生物試料分析科学会
１ 測定上限はどうして決まる
比色分析の場合、測定限界（測定下限、測 定上限）は使用する比色計の限界に左右され ることは言うまでもありません。どこまで高 い吸光度の測定が可能か、どこまで小さな吸 光度の測定が可能かで、測定下限と上限が決 定します。この吸光度によって、検出物質の モル吸光係数とサンプル量、試薬量で、測定 上限と測定下限が決定します。 では、具体的に測定上限を求めてみます。 サンプル20μl、試薬Ａ250μl、試薬Ｂ50μlで、 分子量200の物質を測定したとします。この 時 の 検 出 物 質 の モ ル 吸 光 係 数 が 8×103l/mol/cmで、使用する吸光度測定装置 の測定上限の吸光度が1.5であったとすると、 式（１）は以下のように計算できます。 測定上限= ２ Absから試料のmol濃度を求めるには、 この式で、分子量は変えることができませ ん。変えることができるのは、①測定物質の モル吸光係数（発色させる物質を変えれば変 更できる）、②サンプル量、③試薬量の３つ です。測定上限を高くしたければ、①モル吸 光係数の小さな発色物に変更する（発色感度 の悪い試薬に変える）、②サンプル量を減ら す、③試薬量を増やす、の３点です。 なお、測定上限吸光度は迷光によって決ま ります（比色計に関する項を参照）。２ 測定下限と分析分解能とは
測定下限も測定できる最小の吸光度で決定 され、式（２）で計算できます。分析できる 最小の吸光度が0.01で、測定条件が同じであ れば、測定下限は0.4mg/dlとなります。 測定下限= =0.4 mg/dl 式（２） 測定下限と有意な差で測定仕分けることの 出来る吸光度差とは相違します。後者は吸光 度測定の分析分解能と称します。もし、吸光 度0.250と0.251の差を正確で、有意な差とし て測定できるとすると、吸光度測定の分析分 解能は0.001となります。測定に使用する装置 の分析分解能が0.001であった場合、分析分解 能を濃度で計算すると式（３）のようになり ます。 分析分解能= =0.04 mg/dl 式（３） すなわち、この濃度以下を正しく測定仕分け ることはできないことになります。もし、こ の濃度を高くしたければ先ほどの逆で、①モ ル吸光係数の大きな発色物に変更する（発色 感度の高い試薬に変える）、②サンプル量を 増やす、③試薬量を減らす、ようにすればよ いわけです。 この分析分解能は測定精度そのものを表し ており、分析分解能を小さくすれば精度の高 い分析ができ、大きくすると精度が悪くなり ます。 バーネットは医学的意志決定濃度における 測定精度を具体的に記述しています。例えば 血糖値120mg/dlを4.2%以下の再現性で測定 すべきことを提言しています。そこで、この 要望を満たす測定方法を組んでいるのかを考 1.5 8 × 10ଷ× 20 + 250 + 50 20 × 200 × 1000 × 1 10 ＝60 mg/dl 式（１） ① 吸光度（Abs） モル吸光係数（ε）の単位はmol/l Abs ε × TV SV × MW × 1000 × 1 10･････（１） ちょっとBreak
② 終濃度or分析時の試料濃度（mol/l） は①に試料希釈倍数（総反応液量(TV) ／サンプル量(SV)）を乗じたもの。 ③ モル濃度からmg/dlへの変換は分子 量（MW）を乗じてg/lとし、これに 1000を乗じてmg/lとし、さらに10で 除してmg/dlとします。 ④ Absから試料濃度（mg/dl）を求める 一連の式は下記のとおりです。 0.01 8 × 10ଷ× 20 + 250 + 50 20 × 200 × 1000 × 1 10 0.001 8 × 10ଷ× 20 + 250 + 50 20 × 200 × 1000 × 1 10察してみましょう。測定方法はヘキソキナー ゼ－グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ法 （HK法）で、吸光度の分析分解能は0.001、 NADHのモル吸光係数は6.3×103l/mol/cm、試 薬Ａ250μl、試薬Ｂ50μl、サンプル量1.0μlとし、 グルコースの分子量は180として計算しま す。 まず、120mg/dlの試料を4.2%以下の再現性 で測定するために、分析分解能をどの様に設 定すべきかを計算します。120mg/dlの4.2% は次の濃度です。 120mg/dl×0.042=5.04mg/dl このことから、分析分解能が5.04mg/dlより小 さくする必要があります。 これを式（３）にあてはめると =0.86mg/dl（≦5.04mg/dl） となり、この条件においては分析分解能が 0.86 mg/dlで、バーネットの要望より、5.8倍 も精度良く測定できることになります。
３ 測定精度と測定上限の関係
測定上限を求める式と、分析分解能を求め る式は同じでした。ということは測定上限を ２倍に上昇させることは測定精度を半分に落 とすことになります。つまり、両者は切って も切れない関係にあるのです。よって、分析 システムを構築する時は先ず測定の精度を決 定します（バーネットの考え方だけでなく、 自施設の診療医の要望する精度で、組み立て ること。測定精度は分析分解能だけでなく、 吸光度によって測定精度が変化する。後述す る項目参照）。次いで、測定上限から再検査 率を求め、検査に携わる方々の納得できる測 定上限（試薬の限界によって測定上限が決ま ることもあるため、試薬の限界の項を参照下 さい）となるように設定すべきです。４ 分析段数とは何？
吸光度を測定する装置には測定下限、上限、 分析分解能（一定の精度で測定できる最小の 吸光度差）のあることを前術しました。この ３者が決まれば、分析段数が決定します。測 定できる最大の吸光度を1.5とし、測定下限の 吸光度を0.01、分析分解能を0.001とすると測 定できる段階は次のように計算できます。 要するに比色分析法では測定装置の問題か ら分析できる段数が決定されています。一つ の階段の高さが分析分解能、階段の数が分析 段数、一番最初の階段の高さが測定下限、階 段の一番上の高さが測定上限となります。こ れをある程度自由に動かすことで、測定精度 とダイナミックレインジ（測定可能範囲）を 決定します。５ レートアッセイでも同じか？
レートアッセイもほぼ同様な計算が成り立 ちます。測定できる最大の吸光度変化量、最 小の変化量があり、分析分解能としての検出 限界もあります。１分間に0.3/minの吸光度変 化を測定できる装置があったとします。また、 分析分解能としての検出限界は0.0001/min とします。すると、分析段数としては30,000 段となります。 エンドポイント法でも同様ですが、試薬の 限界も存在します。試薬の限界についてはそ の内容を試薬の項で詳細に解説します。６ 再現性と分析分解能の関係
分析分解能は吸光度測定の立場で、これ以 上小さな吸光度差を測定できないことから生 0.001 6.3 × 10ଷ× 1 + 300 1 × 180 × 1000 × 1 10 分析段数=1.5 − 0.01 0.001 = 1490段 測定上限 測定下限 （吸光度測定下限） （吸光度測定上限） 分析分解能（吸光度分析の最小値） ダイナミックレンジ （測定可能範囲） 図1 分析段数と分析分解能の関係まれた数値です。たとえば、分析分解能が 1.0mg/dlの分析システムを用い、50mg/dlの 管理試料により同時再現性を測定した場合に CVがほぼ2%になることを意味しています。 もう少し具体的に記述してみましょう。次 のような測定系でAST活性をJSCC勧告案に準 じて測定したとします。血清2.0μl、試薬Ａ 100μl、試薬Ｂ20μl、分析分解能としての最小 速度が0.0001/minであるとすると、分析分解 能は次のように計算できます。 分析分解能（U/l）= この様な測定システムで40U/lの管理血清 の測定を実施した場合、同時再現性のCVは、 2.5%（1.0/40×100=2.5%）以下を期待しては ならないことを意味しています。
７ グルコース測定法の組み立て
血糖値を測定する方法において具体的な測 定法を組み立ててみましょう。医師の要望、 分析装置の性能、試薬の能力、および検査技 師の要望の全てを満たすことができる測定法 が構築できるかを考えたいと思います。ただ し次に示す性能と要望があるものとします。 １．吸光度の測定できる範囲は0.01から1.0 の範囲であること。 ２．正確に測定仕分けることの出来る吸光 度差は0.001であること。 ３．最も正確に測定できる吸光度は0.34で あること。 ４．サンプルの採取量は1.0μl刻みで、50μl 以下であること。 ５．試薬は１種類であること。 ６．吸光度測定には最低でも反応液量が 2.5ml必要で、3.5mlを超えないこと。 ７．800mg/dlを超える濃度を測定すること は1.0%以下、600mg/dlを超える測定は 2.0％以下、500mg/dlは4.0％以下とする こと。 ８．医師から要望されている再現性は50 mg/dl付近で10%、100mg/dl付近で 5.0%、120mg/dl付近で4.2%以下である こと（Barmett)。 ９．再検査率は検査技師の中で、5.0%以 下となるように要望されていること。 １０．総反応液量は3.0mlとすること。 以上の条件をなるべく満足できる試薬調整法 を、次に示す条件から順次考えることにしま しょう。 １）800mg/dlまで希釈することなく測定 できる。 ２）医師が要求する精度を満足させる測 定方法を構築する。 ３）測定下限を30mg/dlとする。 ４）反応を５分以内に終了させる。 ① GODの添加量を考える。 ② 測定原理に出てこなかった試薬で、 添加すべき試薬はあるのか考える。 ５）PODは300U/l添加するものとして考 える。 ６）4-アミノアンチピリン(4-AA)は1.0 mmol/l、フェノールは10.0mmol/l（終濃 度）とする。 ７）試薬は１試薬系とする。１）
800mg/dlまで、希釈することなく測
定する方法を考える
この目的を達成するためのサンプル量(SV) と総反応液量(TV)を考えます。ただし、SVを 3.0ml、MW180とします。 ε：1.26×104l/mol/cm（キノン体のモル吸光 係数） すなわちサンプル量を10.7μl以下とすれば良 いことになります。 （注）GOD/POD法の場合は、下記の反応式の よ う に グ ル コ ー ス1molから過酸化水素が 1molできますが、キノン色素1molは過酸化水 素2molから生じます。したがって、キノン色 素濃度からグルコースの濃度を求める際に は、キノン色素濃度を２倍する必要がありま 0.0001/min 6.3 × 10ଷ × 122 2 × 10= 1.0U/l 800mg/dl =ΔAbs ε × TV SV × MW × 1000 × 1 10 × 2 =1.26 × 101.0 ସ×3.0SV × 180 × 100 × 2 SV=0.0107ml=10.7μlす。 α-D-Glucose β-D-Glucose β-D-Glucose＋O2＋H2O H2O2＋Gluconic acid 2H2O2＋4-Aminoantipyrine＋Phenol [Red pigment]＋4H2O 図2 GOD/POD法によるグルコース測定原理
２）医師に要求される精密度を満足させ
る測定方法を構築する
医師が最も精度良く測定して欲しいと要望 する濃度は120mg/dlであり、この濃度におけ る再現性が4.2%以下であることであり、言い か え れ ば 標 準 偏 差 （ SD ） を 5.0mg/dl （120mg/dl×0.042）以下にして欲しいという ことです。 測定者の立場からすると、整数値で測定値 を 報 告 す る の で す か ら 、 分 析 分 解 能 が 5.0mg/dlで良いと言われても納得できませ ん 。 も っ と 精 度 を 上 げ て 、 分 析 分 解 能 を 1.0mg/dlとし、10%以下の精密度で測定する ためする方策を立案するための具体策とし て、サンプル量（SV）と総反応液量（TV）の 比を計算します。 このことより、サンプル量が8.57μl以上であ れば良いことが分かります。 前述の条件１）の要望とこの精度の両方から、 サンプル量は9μlか10μlを選択するしかあり ません。そこでサンプル量を10μlとした時の 測定下限を計算すると（吸光度変化量0.01の 時）測定下限は8.57mg/dlとなり、要望の測定 下限30mg/dlも測定できることとなります。 以上の結果より、条件１）～３）を満足させ る測定操作はサンプル量を9もしくは10μlと し、総反応液量を3.0mlとすることが適切とい うことになります（以下は10μl（0.01ml）と して記述します）。 この条件で、臨床上精度良く測定したい濃度 がどの程度の再現性となるか考えます。要す るに、50、120mg/dl付近の吸光度を計算しま す。 50mg/dlを発色させた吸光度が0.058Abs、 120mg/dlを発色させた時で0.140Absとなり、 最も再現性良く測定できる濃度は290mg/dl 付近の濃度であることになります。なお、 30mg/dlの試料を測定した時のΔAbsは同様な 計算から0.0348と演算でき、測定下限の吸光 度0.01を上回っているため、十分測定できる と判断されます。３）５分以内に反応を終了させるための
GOD活性添加量の決定
反応を所定の時間までに終了させるために 考慮しなければならない点は次の事項です。 ① ムタロターゼの添加 ② GODの添加活性 ③ PODの添加活性 GODはβ-D-グルコースにのみ反応し、α-D-グルコースには反応しないため、化学平衡反 応が終了するまで、反応は終了しません。こ のため、図2に示すムタロターゼを添加する必 要があります。この反応とGODの２段階の反 応解析を演算することは難しいのですが、ム タロターゼ反応は素早く終了するため、演算 からは除外して考えることができます。 そこで、５分以内に反応を終了させるため に必要なGOD活性添加量を演算します。なお、 酵素反応は一次速度定数にしたがって進行す 1.0mg/dl =ΔAbs ε × TV SV × MW × 1000 × 1 10 × 2 =1.26 × 100.001 ସ×3.0SV × 180 × 100 × 2 SV = 0.00857ml = 8.57μl Mutarotase GOD POD 0.01 1.26 × 10ସ× 3.0 0.01 × 180 × 100 × 2 = 8.57mg/dl 50mg/dl = ΔAbs 1.26 × 10ସ× 3.0 0.01 × 18000 × 2 ΔAbs = 0.058 120mg/dl =1.26 × 10ΔAbs ସ×0.01 × 18000 × 23.0 ΔAbs = 0.140ると考えます。初期基質濃度をC、t時間後の 基質濃度をCとし、この反応が99%進行したと すれば、次のように一次反応式を記すことが できます。 5分間で反応を終了させたいので、t=5を代入 し、また、݇ = ܸ/ܭmなので、これに今回使用 したGODのܭm値、3.3×10-2mol/lを代入しま す。 V が30.393U/mlとシミュレートされたので、 GODは、終濃度で30.393U/ml以上の活性が添 加されていれば、5分間で反応が終了できると 予測されます。なお、PODの反応はとても早 いため、計算は割愛できます。
