Microsoft PowerPoint - ⑦大上講師説明資料.ppt

(1)

胃癌診断のための

高感受性血清腫瘍マーカー

広島大学

大学院医歯薬学総合研究科

分子病理

講師

大上

直秀

教授

安井

弥

8/20

大阪

広島大学「新技術説明会」

Department of Molecular Pathology

(2)

研究背景

胃癌は近年減少してきているとはいえ、尚、最も頻

度の高い癌の一つであり、この克服は現代社会の最大

の課題である。

分子病理学研究室では、胃癌の発生・進展のメカニ

ズムを解析し、胃癌の病態解明を行っている。さらに、

そこから得られた知見をもとに、胃癌の診断・治療に

有用な標的分子を同定し、実際の診断・治療への有用

性について検討している。

(3)

従来技術とその問題点

現在、癌の確定診断には主として病理形態学的診断が

用いられいる。しかし、多数の検体に対して病理形態

学的診断を行うことは困難であり、血液検査等の簡便

な方法で癌の存在を調べる検査が必要とされている。

既に実用化されている胃癌の血清腫瘍マーカーとして、

CEA、CA19-9があげられるが、陽性率は10-20%程度で、

早期の癌を検出するのに不適切である。さらに偽陽性

も多いことが問題点として指摘されている。

従って、感受性の高い血清腫瘍マーカーの開発が必要

とされている。

(4)

Serial Analysis of

Gene Expression

Velculescu et al.

Science 270:484, 1995

cDNAマイクロアレイとともに代

表的な

網羅的遺伝子発現解析法

（1995年

Kinzlerらが考案）

CATG 下流の 10-12bp の tag を

sequenceすることによりその出

現頻度と種類を解析し、NCBIの

databaseにより対応する遺伝子

を知ることができる

定量性・再現性に優れる

未知の遺伝子の解析が可能

現在までに約300種類の組織ある

いは細胞のSAGE libraryが登録

されており、それらのデータと

directに比較することができる

(5)

Sample

Histology

clone

tag

W226T

tub1 (Early cancer)

2,592

43,908

W246T

tub1 (Advanced cancer) 2,867

32,174

P208T

por1 (Primary tumor)

2,701

11,582

P208L

por1 (LN metastasis)

1,034

15,382

S219T

por2 (Scirrhous type)

2,441

34,660

Total

5 samples

11,635

137,706

38,903 unique tags

NCBI

G

ene

E

xpression

O

mnibus:

GEO accession: GSE545 (SAGE Hiroshima gastric cancer tissue)

Hiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences

Invasion

Lymph node metastasis

Frequently overexpressed genes (tumor/normal ratio>2)

Stage

COL1A1 (78.3%), CDH17 (73.9%), APOC1 (67.4%), COL1A2 (58.7%), YF13H12 (52.2%),

CEACAM6 (50.0%), APOE (50.0%), REGIV (47.8%), S100A11 (41.3%), FUS (41.3%)

CDH17 (P=0.0060), APOE (P =0.0139)

FUS (P =0.0416), APOE (P =0.0006)

FUS (P =0.0414), COL1A1 (P =0.0156), COL1A2 (P =0.0395), APOE (P =0.0125)

Real time RT-PCR analysis in 46 GC samples

YF13H12

>10 1 3 2 4 5 6 7 8 9 0 T/N rati o 11 12 1 314 15 16 10 1718 1 9201 222 2342 25 2627282930313233 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 123 4567 8 9

YF13H12 protein expressed in

thyroid

_CDH17

>10 1 3 2 4 5 6 7 8 9 0 ₁ ₂₃ _{4 5 6 7 8 9} ₁₀_{11 12 13 14 15 16}_{1 1 1 20 21 22 2 24 2 5 26 27 28 29 30 3 32 3 3 3 35 36 3 38 39 40 41 42 43 44 45 46}7 8 9 3 1 4 7 T/N ra tio

W226T

P208T

胃癌関連遺伝子の同定

W246T

P208L

S219T

(6)

Liver

Kidney

Heart

Colon

Brain

Bone marrow

Skeletal muscle

Lung

Small intestine

Spleen

Spinal cord Stomach

Pancreas

Leukocyte

DEF5

OLFM4

MIA

DKK4

REG4

MMP10

TRAG3

HORMAD1

ATE1

BRD4

ETS2

MLL4

CCT3

GPP34R

LMO6

Gastric cancer

Normal tissue

_{Candidate gastric cancer specific genes}

胃癌特異的遺伝子の探索

胃癌のSAGEライブラリーと生命維持に重要な14の臓器（心臓、肝臓等）のSAGEライブラリーを比較し、胃癌のSAGEライブラ

リーのみで発現している遺伝子を抽出した。

抽出された54遺伝子すべてについて、realtime RT-PCR法で遺伝子発現を測定した。

正常臓器で最も発現が高かった遺伝子発現量と、胃癌で最も発現が高かった遺伝子発現量を比較し、胃癌で10倍以上高かっ

た遺伝子を癌特異的遺伝子と定義した。

(7)

全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析

Real time RT-PCR analysis

全身正常組織

Stomach

Small intestine

Pan

cr

eas

Col

o

n

胃癌

大腸癌

肺癌

乳癌

0

10

20

30

40

50

60 REGIV mRNA exp

ression

level

TMK-1-Reg TMK-1-empty

Cell

Medium

Western

blot

Cell

Medium

-

β-actin

- V5-Reg IV

全身正常組織ではReg IVの発現はほとんどなかったが、胃癌、

大腸癌において高いレベルのReg IVが検出された。

Reg IV培養液中に分泌される

Oue N, Yasui W, et al. J Pathol, 2005.

・

Reg IVは2001年に炎症性腸疾患にて発現が亢進している遺伝子としてクローニングされた。

・

EGFRを活性化し、アポトーシスを抑制することが知られている。

Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4)

(8)

胃癌組織におけるReg IVの免疫染色

30%の胃癌でReg IVの発現が認められた。

(9)

胃癌患者の血清におけるReg IVの検出

n = 101

n = 36

n = 6

n = 10

n = 9

2

4

6 Serum Reg IV level

ng/ml

0 健常人

Stage I

Stage II

Stage III

Stage IV

胃癌

特異性は99%、感受性は36%であった。

胃炎患者

n = 20

1

3

5

7

(10)

別名、GW112、hGC-1

・

骨髄芽球からクローニングされた遺伝子である。分泌蛋白をコードする。510-

amino acids

・

正常では、骨髄、小腸、大腸、前立腺に発現する。

・

潰瘍性大腸炎、大腸癌、肺癌、乳癌などにおける発現が確認されている。

・

GRIM-19、cadherin、lectinと結合し、アポトーシスや細胞接着を制御する。

Li ve r Kidn e y He art Colon Brai n Bone m arro w S k el et al mu s cl e Lung S m al l in te st in e S p leen Spi n al cord S to m ach Pa nc reas L e uk oc yt es GC 1 GC 2 GC 3 GC 4 GC 5 GC 6 GC 7 GC 8 GC 9 CRC1 CRC2 CRC3 CRC4 CRC5 CRC6 CRC7 CRC8 CRC9

胃癌

正常組織

大腸癌

0

2

4

6

8 >10

Fold differ

en

ce

(Tumor/Norm

al)

Stage I

Stage II

Stage III

Stage IV

P = 0.0070

--6/19

(32%)

23/31

(74%)

T/N>2

Gastric cancer

T/N>2: 29 / 50 (58%)

全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析

Real time RT-PCR analysis

OLFM4 (Olfactomedin 4)

全身正常組織ではOLFM4の発現はほとんどなかったが、胃癌

において高いレベルのOLFM4が検出された。

(11)

OLFM4の局在・発現とその機能

小腸

胃癌

59%の胃癌でOLFM4の発現を認めた。

胃癌

(12)

胃癌患者の血清におけるOLFM4の検出

健常人

Stage I

Stage II

Stage III

Stage IV

胃癌

n = 101

n = 36

n = 6

n = 10

n = 9

50

100 Serum OLFM4 level

ng/ml

0

150

200

250 胃炎患者

n = 76

n = 60

n = 8

n = 15

n = 40

n = 20

特異性は95%、感受性は31%であった。

(13)

OLFM4

Reg IV

CA19-9

CEA

OLFM4+Reg IV

胃癌患者 123例、健常人 76例

OLFM4

Reg IV

CA19-9

CEA

Specificity

95%

97%

100%

95%

Sensitivity

31%

37%

15%

14%

57%

特願

2008-005023

「

消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法

」

Reg IVとOLFM4の血清診断マーカーとしての有用性

Reg IVとOLFM4の組合わせは、胃癌の高感度の血清診断マーカー

である。

(14)

新技術の特徴・従来技術との比較

胃癌の血清マーカーであるCEA、CA19-9の陽性率はそれ

ぞれ10%程度であったのに対し、Reg IVの陽性率は36%、

OLFM4の陽性率は31%であり、従来のマーカーよりも検

出感度が高かった。

さらに、Reg IVとOLFM4陽性例は一致しない傾向にあっ

た。両者を組み合せると陽性率は57%であり、半数以上

の胃癌を検出できた。

(15)

想定される用途・業界

胃癌の新規血清マーカーであるReg IV、OLFM4、あるい

は両者の組み合わせは陽性率が高いことから、胃癌の

スクリーニングに使用すれば、簡便にこれらの癌を検

出できる。血清を材料に用いるので、被検者への負担

も少ない。

上記以外に、抗がん剤の効果判定にも使用できる可能

性がある。

検査センター、病院において、これらの検出試薬が使

用されるものと考えられる。尚、血清腫瘍マーカーの

測定はELISA法であり、導入は容易である。

(16)

実用化に向けた課題

Reg IV、OLFM4ともELISAの系は完成しており、胃癌

患者の血清解析も終了している。

実用化に向けて標準化された方法を確立すると共に、

多数の胃癌患者、健常人の血清を解析する必要があ

る。

(17)

企業への期待

Reg IVとOLFM4の標準化されたELISAの系を開発す

る。

標準化されたELISAの系があれば、多数例の胃癌

患者、健常人の血清を材料にReg IVとOLFM4の濃

度を測定することができる。

抗体作成技術を持つ企業との共同研究を希望。

(18)

本技術に関する知的財産権

発明の名称

：消化器癌検出用血清腫

瘍マーカー、消化器癌検出キット、お

よび消化器癌検出方法

出願番号

：特願2008-005023

出願人

：国立大学法人広島大学

発明者

：安井

弥、大上直秀

(19)

お問い合わせ先

広島大学

大学院医歯薬学総合研究科

分子病理学教室

講師

大上直秀（おおうえ

なおひで）

TEL: 082-257-5147

FAX: 082-257-5149

e-mail: [email protected]

Microsoft PowerPoint - ⑦大上講師説明資料.ppt

胃癌診断のための

高感受性血清腫瘍マーカー

広島大学

大学院医歯薬学総合研究科

分子病理

講師

大上

直秀

教授

安井

弥

8/20

大阪

広島大学「新技術説明会」

研究背景

胃癌は近年減少してきているとはいえ、尚、最も頻

度の高い癌の一つであり、この克服は現代社会の最大

の課題である。

分子病理学研究室では、胃癌の発生・進展のメカニ

ズムを解析し、胃癌の病態解明を行っている。さらに、

そこから得られた知見をもとに、胃癌の診断・治療に

有用な標的分子を同定し、実際の診断・治療への有用

性について検討している。

従来技術とその問題点

現在、癌の確定診断には主として病理形態学的診断が

用いられいる。しかし、多数の検体に対して病理形態

学的診断を行うことは困難であり、血液検査等の簡便

な方法で癌の存在を調べる検査が必要とされている。

既に実用化されている胃癌の血清腫瘍マーカーとして、

CEA、CA19-9があげられるが、陽性率は10-20%程度で、

早期の癌を検出するのに不適切である。さらに偽陽性

も多いことが問題点として指摘されている。

従って、感受性の高い血清腫瘍マーカーの開発が必要

とされている。

Serial Analysis of

Gene Expression

Velculescu et al.

Science 270:484, 1995

cDNAマイクロアレイとともに代

表的な

網羅的遺伝子発現解析法

（1995年

Kinzlerらが考案）

CATG 下 流 の 10-12bp の tag を

sequenceすることによりその出

現頻度と種類を解析し、NCBIの

databaseにより対応する遺伝子

を知ることができる

定量性・再現性に優れる

未知の遺伝子の解析が可能

現在までに約300種類の組織ある

いは細胞のSAGE libraryが登録

されており、それらのデータと

directに比較することができる

Sample

Histology

clone

tag

W226T

tub1 (Early cancer)

2,592

43,908

W246T

tub1 (Advanced cancer) 2,867

32,174

P208T

por1 (Primary tumor)

2,701

11,582

P208L

por1 (LN metastasis)

1,034

15,382

S219T

por2 (Scirrhous type)

2,441

34,660

Total

5 samples

CATG 下流の 10-12bp の tag を

_CDH17

_{Candidate gastric cancer specific genes}