博 士（ 医 学 ） 丸谷 真 守 美
学位 論文 題名
Dominant‑NegatiVeMutationS OftheTumorSuppreSSOrp53Relating toEarlyonSetofGlioblastomaMultiforme
（ヒト多形膠芽腫において癌抑制遺伝子p 53 の dominant‑negative 変異は低い発症年齢と関係する）
学位論文内容の要旨
（背景・目的）
癌抑制遺伝子p53は， ヒ卜の悪性腫瘍の半数以上に おいて最も変異，欠失がみられる遺伝子である。p53は、
主と して 四量 体 を形 成し て特 異的DNA配列に結 合する転写因子として働き 、細胞周期の停止，アポトー シス の誘導などの機能を発揮 する。最近p53の変異のいく っかはdominant‑negative（以下DNと略）効果により野生 型p53の 機能 を阻 害す る 可能 性が 示さ れた ． これ は細 胞内 で1対のp53対立 遺伝 子の一方にDN変異が起 こっ た場 合、 他方 の 対立 遺伝 子が 正常であっても 細胞レベルではp53の機能が 喪失することを示唆する。従 って p53の変 異がDN変 異で あ るか 否か は癌 化と 密 接に 関わ る事 象 であ ると 考え られ る。レかし、DN変異の 解析 は少 数のp53変異に ついてしか行われておらず 、しかもその野性型p53機能 の抑制効果の解析法が多様で ある ため 、現 時点 で はそ の癌 化に 果 たす 役割 を検 討す る 事ができない。著者 らはADE2をレポ一夕ー遺伝子 とし て酵 母内 でp53の 転写 活 性化 能をテストするp53の機能的変異のアッセイ系 を確立し様々な癌のp53変異 を同 定し てき た。 酵 母内 に野 生型p53が発 現す る とp53認 識配列に結合し、そ の下流のADE2遺伝子の転写が 活性 化され正常の白いコ口ニ ーが形成される。しかし、 変異型p53が発現するとADE2遺伝子が転写活性化されず、
アデ ニン 合成 の 中聞 代謝 産物 が 蓄積 し赤 いコ 口ニ ー が形成される。酵母 の中では2種類のp53発現ベク 夕一 を等 量ずつ維持す ることが可能なので、野性型p53と変異p53を等量発現さ せることが理論的に可能であ る。
酵母 内で 発現 し た変 異p53が 野性 型p53の 持つDNA結合 能を阻害するか否か は、同じ酵母に組み込んだp53結 合部 位と 連結 し たレ ポ一 夕ー 遺伝子の活性化 を指標として評価する事が可 能である。この研究の目的 は1） 上述した方針に基づきヒ トp53のDN変異の簡便かつ敏感な変異検出法(transdominanceassay）を構築すること。
2） 著者らがすでに 数多くのp53変異を同定した 脳腫瘍、乳癌、口腔扁平上 皮癌について、DN変異が臨床 的各 種バラメーターと関係が あるかどうかを検討するこ とである。
（結 果・ 考察 ）
1）Transdominance assayの 構築
野 性型 ヒ卜p53発現ベク ターpLS72のロイシン非要求 性マーカーをpGBT9由来のト リプトファン非要求性 マー カーTRP1に置 換した 野性型p53発現ベク夕‑pTSHP53を作成した。変異型p53発 現ペクターはyeast p53
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functional assayに 用 い る 遺伝 子 相 同 組 み換 え 用 ベ ク ターpSS16を 用 い た 。pSS16はpLS72の 派 生 体 で 口イ シ ン 非 要 求 性 マ 一 力‑LEU2を も つ も の で 栄 養 非 要 求 性 マ ー カ ー を 除 い て はpTSHP53と 同 一 で あ る 。 こ の 両 者 を 同 時に 酢 酸 リ チ ウ ム方 に よ り 酵 母yIG397に 導 入 し 、Trp‑／ Leu‑ア デ ニ ン 欠 乏プ レ 一 卜 で培養 する。 この結 果、
既 知 の 野 生 型p53の 機 能 を 阻 害 し な い 変 異(recessive mutation)で はADE2遺 伝子 が 発 現 さ れ白 コ ロ ニ ー を 呈 し た 。 ま た 、 野 生 型p53の 機 能 を 阻 害 す るDN変 異 で はADE2遺 伝 子 が 発 現 し な い た め 赤 又 は ピ ン ク コ 口 二 ー を 呈し た 。 次にtransdominance testの 酵母内 におけ るp53蛋白の 発現 レベル を確認 するた め、Western blotting 法 を 用 い て 検 討 し た 。p53のC末 端 の51ア ミ ノ 酸 を 欠 失 さ せ た 変 異(p53△51） とp53のC末 端 の57ア ミ ノ 酸を 欠 失 さ せ た 変 異(p53△57)の 変異 型p53に つ い て そ れぞ れtransdominance testを 行 っ た 。 それ ぞ れ の 酵 母よ ル グ ラ ス ビ ー ズ 法 に て 蛋 白 を 抽 出 し 、lOa/oSDS‑PAGEで 電 気 泳 動 ・ ブ 口 ッ テ ィ ン グ し 、p53特 異 的モ ノ ク 口 ー ナ ル 抗 体PAb1801で 染 色 し た 。 そ の 結 果 、 酵 母 内 で 野 生 型p53蛋 白 と 変 異 型p53蛋 白 は どち ら も 十 分 量 発現 し てい ること が確認 された 。
2） 脳 腫 瘍 ・ 乳 癌 ・ 口 腔 扁 平 上 皮 癌 あ る い は そ の 前 癌 病 変 に お け るp53 Transdominance Test 著 者 ら がp53 yeast functional assay法で 同 定 し て きた 悪 性 脳腫 瘍患者 組織29検体（ 多形膠 芽腫17検体、 未分 化 星 状 細 胞 腫11検 体 、 リ ン パ 腫1検 体 ） 、 乳 癌 患 者 組 織29検 体 、 口 腔 扁 平上 皮 癌 患 者 組織10検 体 、前 癌 性 白 斑 症患 者 組 織4検体 、5種 類 のヒ ト 多 形 膠 芽 腫細 胞cell line、31種 類のp53 mutagenesisの計108検 体のp53変異 に つ い て 、 そ れ ら の 変 異p53の 組 み 込 まれ たpSS16ベ ク タ ーを 単 離 し てtransdominace testを 行 っ た． さ ら にTaq polymeraseに よ る 人 工 的 変 異 に つ い て も 検 討 し た 。 そ の 結 果 、DN変 異 はp53のDNA結 合domainに位 置 す る ア ミノ 酸変異 が大部 分を占 めた。
こ れ ら の 実 験 結 果 が ア ッ セ イ に 用 い た 酵 母 の レ ポ ー タ ー の 感 度 やDNA結 合 配 列 等 ア ッ セ イ 法 に 依 存 し な い こ と を 確 か め る た め 、 他 の 類 似 し た 酵 母 ア ッ セ イ法 や 全 く 別 の 酵母 ア ッ セ イ 法の 結 果 と 比 較し た 。 そ の 結 果 、 同 じ 変 異 の ア ッ セ イ 結 果 に つ い て は 殆 ど 同 様 の 結 果 が 示 さ れ て い た 。 ま た 、 共 通 し な いDN変 異 に つい て も そ れ ら の 多 く がp53のDNA結 合domainの ア ミ ノ 酸 変 異 で あ る と い う 特 徴 で 一 致 し て い た 。 こ れ ら のこ と はp53のDNA結 合 能 に 関 す るDN変 異 はp53のDNA結 合 に 物 理 的 に 関 与 す る 部 位 の 変 異 に 起 因 す るp53四 量 体 の 構造 の 変 化 で あ ると の 仮 説 と 矛盾 し な い 。 以上 よ り ， 著 者ら の 確 立 し たtransdominant testlri普遍的 なアッ セイ 法とし て妥当 である と考え 実験 結果と 生物学 的意義 との 検討を 試みた ．
3） 癌の発 症年 齢とdominant rtegative変 異の関 係
Transdominance Testで同 定 し たp53のdominant negative変異 が ど の よ う な臨 床 的 意義 があ るか各 種臨床 的パ ラ メ 一 夕 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 予 後 な ど のバ ラ ヌ ー タ と は有 意 な 関 係 は認 め ら れ な かっ た が 、 ヒ ト 多形 膠芽腫 におい てDN変 異（n〓7）とrecessIve変異（n＝9）とp53変異のないもの（n＝24）を比較するとDN変異の発症 年 齢(30.4土14.7 years)は 、recesslve変異(55.2士18.6 years，pく0.012)やp53変異 を 伴 わ な いも の(54.7土 17.1 years，pく0.003） に比 べて有意に低かった。一方、乳癌(49.5土9.8 years，n=6 versus 50.3土10.3years，n=23) や口 腔扁平 上皮癌(64.7土11.5 years，n=6 versus 57.0土13.9 years,n=8)においてはDN変異とrecessive変異の間で発 症 年 齢 に 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ は 、 グ リ ア 細胞 の よ う に 限 られ た 時 期 に 遺伝 子 変 異 が 導入 さ れ る 細 胞 を 発 生 母 地 と し て い る 腫 瘍 で は 、 細 胞 増 殖 が 盛 ん に起 こ り 若 年 発 症の 傾 向 と な るた め で あ る と考 え ら れ た 。
（ 結 論 ）
p53のDN変 異 を 簡 便 に検 出 で き るtransdominance testを 確 立し た 。 そ し て、 多 形 膠 芽 腫で はp53 DN変異 を伴 う こ と は 低 し 、 年 齢 す な わ ち 早 期 に 腫 瘍 発 生 が 起 こ る こ と を 初 め て 明 ら か に し た 。
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