博 士 （ 農 学 ） 姜 希 曝
学位論文題名
Molecular Structures and Catalytic Mechanisms of Glycosyltransferases from Leuconostoc 7nesenteroides and Dextranase from 工ip07nyces starkeyi
(Leuconostoc mesenteroides グ リ カ ン 合 成 酵 素 と LiPomyces starkeyi デキストラナーゼの構造と機能に関する研究）
学位論文内容の要旨
乳酸 菌Leuconostoc mesenteroidesは 、シ ョ糖 を多 糖類に転換する2っの有用な グルカン合成酵素 を 菌 体 外に 分泌 する 。デ キス ト ラン 合成 酵素(DSaseと 略） とフ ラク タン 合成 酵素(FSaseと略 ） である。デキストラン(DXTと略）はa‑l，6結合を主鎖とするば・グルカンであるが、の‐1，2、の‐
1，3やa‑l，4結合 の分 岐 を有 する 。分 岐はDXTの物 性 を決 定し 、か っそ の頻度 、鎖長や結合は生 産す るDSaseの 生成 物特 異性 に起 因す るが 、分 子機 構 の詳 細は 不明 であ る。一 方、本乳酸菌が産 す るFSase活 性 は 微 量 で あ り 、 そ の 本 体 はDSase由 来 で あ る と 提唱 され た。 フラ クタ ン(FRTと 略） は、DXTと とも に産 業利 用が 高い ため 、そ れら を 高生 産す る菌 株や 合成酵 素は重要である。
我々 は、 軟X線 を本 菌や 酵素 遺伝 子を 含む プラ スミ ッ ドに 照射 する こと で、両 多糖を高生産する 変 異 株 や 構 造 の 異 な るDXTを 与 え る 変異 株を 取得 して きた 。そ れら が生 産す るFSaseやDSaseの 構 造 な ら ぴ に 分 子 機 構 の 解 明 は 興 味深 い。 本研 究で は、 変 異株 からFSaseお よぴ2つのDSaseの 遺 伝 子 や 組 換 え 酵 素 を 単 離 し 、 機 能 解 析 な ら ぴ に 触 媒 ア ミ ノ 酸の 決定 を行 った 。特 に 、工 ． mesenteroides由来のFSaseは初めての報 告であり、微量の活性が本酵素由来であることが究明され た。 また 、DSaseに 関し ては 、a‑l，3やa‑l，4結合 の 分岐 を与 える 構造 エレメ ントを解明した。
歯 垢の 除去 は、 う蝕 形 成を 防止 する 。歯 垢を 構成 する 多糖 類の 分解 は、 効果的な手法の1っで ある 。本 多糖 の1っ であ るa‑グルカンはa‑l，6やロ‐1，4結合を有する。従って 、両結合を効率良 く 分 解 する 酵素 は、 利用 価値 が 高い 。従 来、a‑l，6結 合を 分解 する デキ スト ラナ ーゼ(DXaseと 略； カビ 由来 ）が 用い ら れて きた が、 より 安全 性の高い微生物からの酵素が要 求された。我々は 酵母(Lipomyces starkeyi)が生産するDXaseを発見した。a‑l，6結合 の他にaー1，4結合をよく分解 する 点が 他の 酵素 にな ぃ 優れ た性 質で ある 。本 研究 では 、異 種宿 主発 現に よる本DXaseの大量生 産を行い、組換え酵素の性質を明らかに した。
(1)工 ，mesenteroides B‑512 FMC由 来FSaseの 解析
FSaseの 高発 現株(B‑512 FMC株 ） から ショ ット ガン クロ ーニ ング法で形質転換体（大腸菌 ）を ―147―
得 た 。選 抜は 、菌 体外 にお けるFRT形 成を 指標 に行 った 。424アミ ノ酸 から なる 推定 配列 はレ バ ン スク ラー ゼと 高い 相同 性を 示し た。 組換 え酵 素の 至適pHや温 度は それぞれpH 6.2と37゜Cであ り 、pH 4.5‑7．0お よぴ37°Cで安定で あった。1mMのAg゛とHg゛は 強い阻害を与えた。生成された 多 糖はNMRおよ ぴ抗 体の 解析 か らレ バン であ り、 本酵 素は レバ ンシ ュク ラーゼと決定された。本 多 糖合 成の 他に ケス トオ リゴ 糖を 生産 した 。キシロース、セロビ オース、ラクトース、マルトー ス とメ リビ オー スが 糖転 移の 受容 体と なり 、そ れぞ れの 還 元末 端残 基のCl‐OHにFruがロ型で結 合した非還元オリゴ糖を与え た。これらのオリゴ糖は還元カがないため反応性が低い 。すなわち、
還 元糖 をよ り反 応性 に乏 しい 非還 元糖 に導 くことができ、食品な どに添加した場合に有用成分を 損 な わ ず 安 定 性 が 高 い 。 触 媒 残 基と 予想 され るD53、D216とE294に点 突然 変異 を与 えた 酵素 は 活 性を 消失 した 。D210を 含む 保存 配列 （208｜FIめP．211）が214‐FRDPー217に認められたが、
D216Aが 約 10％ の 活 性 を 示 し た こ と か らD216は 触 媒 残 基 で は な い と 判 断 し た 。
(2)工 ．mesenteroides B‑742CB由 来DSaseの 軟X線照 射 変異 体の 解析
B‑742CB株 のDSase遺 伝 子 を 含 む プ ラ ス ミ ッ ド に 軟X線 照 射 を 行い 、大 腸菌 に導 入し た。DXT 生 産で 選抜 し、 構成 的過 剰発 現株 の取 得に 成功 した 。 精製 した 組換 え酵 素が生産するDXTの構造 を 調 べ た。NMR分 析でa‑l，3結 合の 存在 が見 出さ れた 。エ ン ド型DXase消 化で 分岐 型オ リ ゴ糖 が 確 認さ れ、 親酵 素のDXTよ りa‑l，3結合 の度 合い が高 いこ とが 判明 した 。本組 換え酵素遺伝子の プ ロモ ータ ー領 域に 塩基 置換 があ り、 高発 現に 関与 す ると 推測 され た。 構造遺伝子にも2つの塩 基 置換 が見 出さ れた がサ イレ ント 突然 変異 であ り、親酵素との生成物特異性の 相違は、翻訳後修 飾 や三 次構 造の 違い によ ると 考え られ た。
(3)工．mesenteroides B‑1299CB4由来DSaseの解析
B‑1299CB4株 からDSase遺伝 子（1，505ア ミノ 酸をコード）を単離し、大腸 菌で発現させた。精 製 し た 組換 え酵 素は 、至 適pH 5.2お よぴ30゜C以 下お よ ぴpH 5.2から6.0の安 定域 を 示し た。 活 性は1 mM Fe゛とHg十で強く阻害され、Ca2゛により約2倍に増加した。点置換法で触媒残基をD530、 E568とD641と 推 定 し た 。DSaseが 属 す グ リ コ シ ド ヒ ド ラ ー ゼ フ ァミ リー70の 酵素 には6つの 保 存 領 域 が 有 り 、 DS aseで 高 く 保 存 さ れ た 領 域IIの2ア ミ ノ 酸(V532とV535)と 領 域IVの3ア ミ ノ 酸(S642、E643とV644)をレウテランスクラーゼ （a‑l，4/1，6ーグルカンを 生産）型に変異させ た 。 す な わ ち 、2重 置 換 体(V532PN535I)、3重 置 換 体(S642NIE643NIV644S)お よ び そ れ ら を 併 せ た5重 置 換 体(V532PN535IIS642NIE643NN 644S)を 作 製 し 、 転移 反応 とDXT合 成 を行 った 。 親 酵 素 と2重 置 換 体 は 同 様 な オ リ ゴ 糖 （a‑l，6結 合 ） やDXT（ 水溶 性） を与 えた 。3重 およ ぴ5 重置換体はaー1，6やロ・1，4結合からなるオリゴ糖を生成した。両変異酵素は難溶性DXTを生産し、
前者はぱ‐1，3結合を有 し後者はさらにa‑l，4結合も含むことが認められた。領 域IIとIVに生成物 特異性を決定する構造エ レメントが存在すると推定した。
(4)工．starkeyi KSM22由 来DXaseの解析
cDNAラ イ ブ ラ リ ー か らDXase遺 伝 子(608ア ミ ノ 酸 を コ ー ド ） を 単 離 し た 。 サ ザ ン 解 析で 染 色体 に単 一に 存在 する こと がわ かっ た。 異種 宿主発現で得られ た組換え酵素の性質を調べた。pH 6.0と37°Cに 反応 の至 適を 示し 、安 定域 はpH 5.0から7.0お よぴ37゜C以下 であ った 。用 いた 全 ての重金属イオン（l mM Ag十、Cd2十、Hg2゛とMn2゛で70％〜 90％の残存活性、lmM Cu2十、Fe3十、
Sr12゛と2n2゛で は活 性 低下 なし ）やSDS（1mM)に 対 し安 定で あっ た。DXTの他に可溶性澱粉やム タン にも 分解 活性 を示した。異種宿 主発現に成功し、a‑l，4結合とa‑l，6結合に作用できるDXase の大量供給が可能になった。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 木村 淳夫 副 査 教 授 伴戸 久徳 副 査 教 授 横田 篤 副査 助教授 森 春英
学 位 論 文 題 名
Molecular Structures and Catalytic IVIechanlSmSOf GlyCOSyltranSferaSeSfron1工 ￠ 冴C〇 髭 〇SめC刀2￠S￠ 刀 た ダ 〇 えdゑS andDeXtranaSefromEゆ 〇 勿 り ′C￠SS勿 ア た ￠yZ
（ 己 ￠ 鉗 C〇 髭 〇 SめC所 ￠ S￠ 髭 た 朋ZぬSグ リ カ ン 合 成 酵 素 と 己 ゆ 〇 挧 ッcピss勿 ぬ りZデ キ ス ト ラ ナ ー ゼ の 構 造 と 機 能 に 関 す る 研 究 ）
本 論 文 は 、 英 文179頁 、 図42、 表32、6章 か ら な り 、 参 考 論 文3編 が 添 え ら れ て い る 。 Leuconostoc mesenteroidesは、ショ糖を多糖類にする2つの有用なグルカン合成酵素を生産する。
デ キ ス ト ラ ン 合 成 酵 素(DSase)と フ ラ ク タ ン 合 成 酵 素(FSase)で あ る 。 デ キ ス ト ラ ン(DXT) はa‑l，6結合を主鎖とするの゜グルカンであるが、a‐1，4結合などの分岐を有する 。DXTの物性を 決定 する 分岐 構造 は、DSaseの生成物 特異性に因るが、分子機構の詳細は不明である。一方、 本菌 が 産 す るFSase活 性 は 微 量 で あ り 、DSase由 来 で あ る と 提 唱さ れた 。フ ラク タン(FRT)は、DXT とと もに 産業 利用 が高 いた め、 高生 産株 や合 成酵素は重要である。我々は、本菌や酵素遺伝 子を 含 むプ ラス ミッ ドに 軟X線照 射 し、 両多 糖の 高生 産変 異株 や構 造の 異な るDXTを与 える 変異 株を 取 得 し た 。 本 研 究 で は 、 変 異 株か らFSaseおよ ぴ2つ のDSaseの 遺伝 子や 組換 え酵 素を 単離 し、
機能解析ならぴに触媒残基の決定を行った。特に、工， mesenteroides由来のFSaseは初めての報告で あり、微量活性が本酵素由来であることを究明した。DSaseに関しa‐1，3やa‑l，4結合の分岐を与 える構造エレメントを解明した。
歯 垢を 構成 する 多糖 類の 分解 は、 う蝕 形成 を防止する手法である。歯垢多糖であるa‑グル カン はa‑l，6やa‑l，4結合を有するため、両結合を分解する 酵素は利用価値が高い。従来、デキストラ ナー ゼ(DXase；カ ビ由 来） が用 いら れて きた が、より安全性の高い微生物からの酵素が要求 され た。 我カ は酵 母(Lipomyces starkeyi)が生産するDXaseを発見した。a‑l，6結合の他にa‑l，4結合
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を分解する点が優れた性質である。本研究では、異種宿主発現による本DXaseの大量生産を行い、
組換え酵素の性質を明らかにした。
（1）工， mesenteroides B‑512 FMC"由来FSaseの解析
B‑512 FMC株からショットガンクローニング法で本酵素の発現株を得た。組換え酵素に対する pH、温度や重金属イオンの影響を明らかにした。生成多糖の構造から本酵素はレバンシュクラー ゼと決定された。本多糖合成の際にケストオリゴ糖を生産した。キシロース、ゼロビオース、ラ クトース、マル卜ースとメリビオースが糖転移の受容体となり、それぞれの還元末端残基のCl‑
OHにFruがロ型で結合した非還元オリゴ糖を与えた。これらのオリゴ糖は還元カがない。すなわ ち、還元糖をより反応性に乏しい非還元糖に導くことができ、食品などに添加した場合に有用成 分 を 損 な わ ず 安 定 性 が 高 い 。 触 媒 残 基 を D53、 D216と E294と 推 定 し た 。 (2)工．mesenteroides B‑742CB由来DSaseの軟X線照射変異体の解析
B‑742CB株DSaseの軟X線照射変具体（構成的過剰発現株）取得に成功した。組換え酵素が生 産するDXTにa‑l，3結合の存在が見出され、、親酵素のものよりa‑l，3結合の度合いが高かった。
本組換え酵素遺伝子のプロモーター領域に塩基置換があり、高発現に関与すると推測された。構 造遺伝子にも2つの塩基置換が見出されたがサイレント突然変異であり、親酵素との生成物特異 性の相違は、翻訳後修飾や三次構造の違いによると考えられた。
(3)工．mesenteroides B‑1299CB4由来DSaseの解析
B‑1299CB4株からDSase遺伝子の単離と発現を行い、組換え酵素の性質(pH、温度や重金属の 影響）を解明した。触媒残基をD530、E568とD641と推定した。本DS aseに存在する保存領域II の2アミ ノ酸と領 域IVの3アミ ノ酸をレ ウテラン スクラーゼ 型に変異 させた。S642N/E643N/
V644SおよぴV532PN535I/S642N/E643NN644Sは親酵素と異なる反応を示した。a‑l，6やa‑l，4 結合からなるオリゴ糖や難溶性DXTを生産した。前者はば．1，3結合を有し後者はさらにa‑l，4結 合も含むことが認められた。領域IIとIVに生成物特異性を決定する構造エレメントが存在すると 推定した。
(4)工，starkeyi KSM22由来DXaseの解析
DXase遺伝子を単離し、染色体に単一に存在することが確認した。異種宿主発現で得られた組 換え酵素の性質を調べた。重金属イオンやSDSに対し安定な酵素であった。DXTの他に可溶性澱 粉やムタンにも分解活性を示した。異種宿主発現に成功したことからa‑l，4結合とa‑l，6結合に作 用できるDXaseの大量供給が可能になった。
以上のように本研究は、ショ糖を基質とする多糖合成酵素やその合成多糖であるDXTの分解酵 素にっいて構造と機能を明らかにしたものである。いずれの酵素もユニークな性質を示しており、
ショ糖の利用形態に新たな提案を行っている。特に、微量活性であったFSaseをレバンスクラー ―151ー
ゼと決定し、DSaseにおいて分岐型DXTを与える構造エレメントを明らかにした点は学術的に重 要な基礎的知見である。a‑l，4結合とa‑l，6結合を分解できるDXaseなどいずれも産業利用に貢 献できる酵素について大量供給を可能にした。
よって審査員一同は、Hee‑Kyoung Kangが博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有する ものと認めた。
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