了 1 博士（医学） 藤枝雄一郎

     了     1

博士（医学）   藤枝雄一郎

学 位 論 文 題 名

    The elucidation of the prothrombotlCmeChaniSm mediatedbyprothrombininantiphOSph01ipidSyndrome    （プロトロンビンを介する抗リン脂質抗体症候群の血栓形成機序解析）

第一部

学位論文内容の要旨

目 的 ： 本 邦 に お け る 抗 リ ン 脂 質 抗 体 症 候 群

(APS)

の 臨 床 的 像 を 明 ら か に す る 方 法：

1988

年 から

2010

年 まで に北 海道 大学 病 院リ ウマ チ膠原病外来 を受診し、APS分類基準（札 幌 ク ラ イ テリ アシ ド ニ一 改変 ）を 満た し た141例 を、 診断 時か ら2010年ま で観 察し 、 血栓 症の り スク 因 子に つい て解 析 した 。また観察 期間中におけるイベント（死 亡、血栓症再発、重篤な出 血合 併症）の有無について後ろ向 き研究をおこなった。

結 果 ：

APS

と 診 断 し た

141

例 （ 女 性

119

例 、 男 性

22

例 ） の 平 均 年 齢 は

44

歳 （ 範 囲 ：

9‑79

歳 ） で 、

70

例

(49.6

％ ） が 原 発 性

APS

で あ り 、

71

例

(50.4

％ ） が 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス

(SLE)

を 合 併 し てい た。 血 栓症 は121例

(85.8

％ ）の 患者 に認 め 、動 脈血 栓症 は93例

(66.0

％ ）、 静脈 血栓 症は46例(32.6％）に認めら れた。最も頻度が高い血栓症 は、脳梗塞86例(86/141 (61.0％））

で あ り 、 続い て深 部 静脈 血栓 症33例(33/141 (23.4％ ）） であ った 。

70

例 の女 性が 妊 娠し 、45 例

(64.3

％ ）が

APS

によ る 妊娠 合併 症を 認め た 。抗 リン 脂質 抗体 の 内訳 は、 ルー プスアンチコア グラ ントが116例(82.3％）、ホス ファチジルセリン依存性抗プロトロンピン抗体が98例(69.5％）、

抗 カ ル ジ オリ ピン 抗 体が

83

例

(58.9

％ ）、 抗p2グ リコ プロ テイ ンI抗体 が73例

(51.8

％ ）で あっ た 。

APS

患 者 を動 脈血 栓症 の 有無 で比 較し 、リ ス クフ ァク ター を解 析 した とこ ろ、 年 齢10歳毎

(OR

：

1.82

、95％C.I：［1.30‑2.54]）、高血圧(OR：3.26、95％C.I：[1.16‑ 9.14]）がりスクファ ク ター と して 示さ れた 。 予後 に関 して は、

10

年生 存率 が93％であり 、血栓症の再発は3.5回/100 人 年で あ った 。糖 尿病 合 併患 者は、非糖 尿病合併患者と比較して有意 にイベント発生率が高かっ た(Log‑rank p=0.04)。

結 論： 本 研究 によ り日 本 人の

APS

患 者 の臨 床像 が明 ら かとなった。ま たホスファチジルセリン依 存 性抗 プ 口ト ロン ピン 抗 体は 多く のAPS患 者に 認め ら れ、診断マーカ ーとして非常に重要な抗体 であ る

第 二 部

背 景 ： 抗 リ ン 脂 質 抗 体 症 候 群(APS)は 、 血 中 に 抗 リ ン 脂 質 抗 体(aPL)が 証 明 さ れ 、 動 脈 血 栓 症 、 静 脈 血 栓 症 、 妊 娠 合 併 症 を き た す 自 己 免 疫 疾 患 で あ る 。APSで 認 め ら れ るaPLは 直 接 、 向 凝 固 細 胞 （ 血 管 内 皮 細 胞 、 単 球 、 血 小 板 ） を 活 性 化 す る 病 原 性 自 己 抗 体 と 考 え ら れ て い る 。 我 々 は ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン 依 存 性 抗 プ 口 ト 口 ン ビ ン 抗 体(aPS/PT)がAPSの 診 断 に お い て 感 度 、 特 異 度 が 高 い こ と を 示 し 、aPS/PTの モ ノ ク 口 ー ナ ル 抗 体 で あ る231Dを 作 成 しaPS/PTに よ っ て 向 凝 固 細 胞 活 性 化 が 起 こ る こ と を 確 認 し た 。 以 上 か らaPS暦TはAPS患 者 の 病 態 に 関 わ っ て い る 病 原 性 自 己 抗 体 で あ る と 考 え ら れ る が 、aPS暦Tが 刺 激 を 細 胞 内 部 に 伝 達 す る 受 容 体 に つ い て は 不 明 で あ る 。

目 的 ： プ 口 テ オ ミ ク ス の 手 法 を 用 い て プ 口 ト 口 ン ピ ン お よ びaPS暦Tの 結 合 に 関 与 す る タ ン パ ク の 同 定 を 行 い 、APSの 血 栓 病 態 を 明 ら か に す る 。

方 法 ：FLAG夕 グ 付 加 リ コ ン ピ ナ ン ト ヒ ト プ 口 ト 口 ン ピ ン （rhnAG．PT） を 作 製 し 、rhFIAG．PT とRAW264．7細 胞 を イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 抗FIAG抗 体 で ア フ イ ニ テ イ 一 精 製 し た も の を SDS・f AGE後 、 銀 染 色 し た 。 ゲ ル 上 で 分 離 し た い く っ か の 候 補 蛋 白 をonlme・nanoLC．MS／MS お よ びnrNCBIdatabaseMASCOTalgorit11mに よ っ て 解 析 し 、 プ ロ ト ン ピ ン 結 合 夕 ン パ ク を 同 定 し た 。 プ 口 ト 口 ン ピ ン お よ びRiboph0・rinu（RPN2） と の 結 合 を 確 認 す る た め に 、His夕 グV5 夕 グ 付 加 リ コ ン ビ ナ ン ト ヒ トRPN2（His・V5．RPN2） を 作 製 し 、cotransfectionassay、 酵 素 免 疫 測 定 法 （ELISA） 、 表 面 プ ラ ズ モ ン 核 磁 気 共 鳴 （SPR） を お こ な っ た 。 単 球 の 活 性 化 にRPN2が 関 与 し て い る こ と を 検 討 す る た め に 、RPN2のRNA干 渉 （s皿NA） を 用 い て 、231Dで 誘 導 さ れ る 組 織 因 子 （TF） の 発 現 を り ア ル タ イ ムPCRに よ っ て 確 認 し た 。

結 果 ： 質 量 分 析 に よ り 糖 転 移 酵 素 で あ るRibophor血II（RPN2） が プ ロ ト ロ ン ピ ン と 結 合 す る 膜 夕 ン バ ク と し て 同 定 さ れ た 。 プ 口 ト ロ ン ピ ン とRPN2の 結 合 をcotransfectionassay、ELIs A、 SPRに よ り 確 認 し た 。RPN2siRNAで ノ ッ ク ダ ウ ン し たRAW264．7細 胞 を 、 プ 口 ト 口 ン ピ ン お よ び231Dで 刺 激 し た と こ ろ 、TF発 現 が 有 意 に 低 下 し た 。

結 論 ：RPN2を プ 口 ト 口 ン ピ ン 結 合 膜 夕 ン バ ク と し て 同 定 し た 。RPN2はAPS患 者 に お い て 血 栓 症 の 病 態 生 理 に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る 。

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学位論文審査の要旨 主 査    教 授    有 賀    正 副査   准教授   松本美佐子 副 査    准教授    森松組子 副 査    教 授    渥 美 達 也

学 位 論 文 題 名

    The elucidation of the prothrombotic mechanism mediated by prothrombin in antiphospholipid syndrome

（プロトロンビンを介する抗リン脂質抗体症候群の血栓形成機序解析）

   抗リン脂 質抗体症候群（antiphospholipid syndrome ，APS) は、血中に抗リン脂質抗体（

antiphospholipid antibodies; aPL) とよばれる自己抗体が証明され、動脈血栓症、静脈血栓症、

妊娠合併症をきたす自己免疫疾患である。現在aPL はりン脂質を直接認識するのではなく、[32‑

グリコプロ テイン I ([32GPI) やプロトロンビン(PT) などりン脂質に結合し構造変化を来した 血漿タンパクを認識することがわかっており、32GPI 依存性抗カルジオリピン抗体(aCL/ p2GPI

）、ホスファチジルセリン依存性抗プロ卜ロンビン抗体(aPS/PT) と呼ばれている。近年aPS/PT が APS の新しいaPL として注目されている。本研究では、第一部で、 日本人APS 患者のデータ ベ ース 構築、および aPS/PT の 陽性率と血栓症や妊娠合併症との関連を検討し、第二部 では aPS/PT に よ る 血 栓 症 形 成 に 関 与 す る 新 規 分 子 の 発 見 に つ い て 述 べ る 。    第一部：本邦におけるAPS のデーターべースを構築し、血栓症のりスク因子および観察期間中 におけるイベント（死亡、血栓症再発、重篤な出血合併症）の有無について後ろ向き研究をおこ なった。APS と診断した141 例（女性119 例、男性22 例）の平均年齢は44 歳（範囲：9‑79 歳）

で、血栓症 は 121 例(85.8 ％）の患者に認め、動脈血栓症は 93 例 (66.0 ％）、静脈血栓症は46 例 (32.6 ％）に認められた。最も頻度が 高い血栓症は、脳梗塞86 例(61.0 ％）であった。また aPS/PT が98 例 (69.5 ％）陽性であり、他 の抗リン脂質抗体と比較して高頻度であった。 APS 患 者を動脈血栓症の有無で比較したところ、高血圧 (OR ：  3.26 、95 ％C.I ：L1.16‑9.14l) がりスク ファクターとして示された。予後に関しては、10 年生存率が93 ％であった。本研究により日本人 の APS 患 者の臨床像が明らかとなった。またaPS/PT は多く の APS 患者に認められ、診断 マー カーとして非常に重要な抗体であることが示された。

   第二部：aPS/PT は直接、向凝固細胞（血管内皮細胞、単球、血小板）を活性化する病原性自 己抗体と考えられるが、aPS/PT が刺激を細胞内部に伝達する受容体については不明であるため、

プロテオミクスの手法を用いてプロトロンビンおよびaPS/PT の結合に関与するタンパクの同定

‑ 257 ‑

を 行 な っ た 。 質 量 分 析 に よ り 糖 転 移 酵 素 で あ るRibophorinII (RPN2)が プ ロ ト ロ ン ビ ン と 結 合 す る 膜 タ ン パ ク と し て 同 定 さ れ 、 プ ロ ト ロ ン ビ ン とRPN2の 結 合 をcotransfection assay、ELISA、 SPRに よ り 確 認 し た 。 次 い で 、Flowcytometryを 用 い てRPN2が ヒ ト 単 球 お よ びRAW264.7細 胞 膜 表 面 に 存 在 し て い る こ と を 確 認 し た 。 最 後 にRPN2 siRNAを 用 い て 、RAW264.7細 胞 膜 表 面 のRPN2を ノ ッ ク ダ ウ ン し 、 そ の 後 プ ロ ト ロ ン ビ ン お よ び マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ルPS/PT抗 体 (231D)で 刺 激 し た と こ ろ 、 組 織 因 子(TF；Tissue factor)のmRNA発 現 が 有 意 に 低 下 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 。RPN2はAPS患 者 に お い てaPS/PTが 誘 導 す るTF発 現 に 関 与 し て お り 、APS患 者 の 血 栓 形 成 機 序 に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る 。

  質 疑 応 答 で は 、 副 査 松 本 准 教 授 よ り 、 な ぜ 自 己 抗 体 が 作 ら れ て し ま う の か 、 プ ロ ト ロ ン ビ ン お よ びp2GPIに お け る 知 見 に つ い て 、 ル ー プ ス ア ン チ コ ア グ ラ ン ト の 陽 性 率 とELISAの 陽 性 率 （ 特 にa[32GPDが 乖 離 し て い る 理 由 に つ い て 、 妊 娠 合 併 症 と の 関 連 に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 次い で 、 主 査 有 賀 教 授 よ り 、aPS/PTの モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 をwholeの ヒ 卜 の プ ロ ト ロ ン ビ ン を 免 疫 し 作 製 し た ニ と に 関 し て 、PS/PTの 複 合 体 を 特 異 的 に 認 識 す る 抗 体 を っ く る 方 法 と し て 、 別 の 方 法 が あ っ た の で は な い か と の 指 摘 、 抗 リ ン 脂 質 抗 体 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 投 与 に よ るAPSモ デ ル マ ウ ス の 可 能 性 に つ い て 、 リ ツ キ シ マ ブ な ど の 抗 体 除 去 療 法 のAPSに 対 す る 有 効 性 に っ い て 、 p38MAPKがTFの 発 現 に 一 番 重 要 と い え る 根 拠 に 関 し て 質 問 が あ っ た 。 次 い で 、 副 査 森 松 准 教 授 よ り 、PSと の 関 連 に つ い て 、ER膜 に 存 在 す る は ず のRPN2が 細 胞 膜 に 発 現 す る 生 物 学 的 意 義 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 次 い で 副 査 渥 美 教 授 よ り 、 高 血 圧 と 抗 リ ン 脂 質 抗 体 の 出 現 の 関 連 に つ い て 、APSの 治 療 戦 略 に つ い て 、 研 究 成 果 を 踏 ま え て 今 後 の 臨 床 応 用 へ の 展 望 に つ い ての 質 問 が あ っ た 。 い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 申 請 者 は 概 ね 適 切 に 回 答 し た 。

  こ の 論 文 は 、APSの 血 栓 形 成 メ カ ニ ズ ム に 関 与 す る 新 規 分 子 を 発 見 し た こ と で 高 く 評 価 さ れ 、 本 論 文 の 成 果 か ら 今 後 の APSの 病 態 解 明 と 新 し い 治 療 開 発 が 期 待 さ れ る 。   審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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