Hepatitis C virus (HCV) NS5A binds
RNA‑dependent RNA polymerase (RdRP) NS5B and modulates RNA‑dependent RNA polymerase
activity
著者 Shirota Yukihiro
著者別名 代田, 幸博
journal or
publication title
博士学位論文要旨 論文内容の要旨および論文審査 結果の要旨／金沢大学大学院医学研究科
volume 平成15年7月
page range 7‑7
year 2003‑07‑01
URL http://hdl.handle.net/2297/15754
学位授与番号 学位授与年月日 氏名 学位論文題目
甲第1546号 平成14年９月30日 代田幸博
HepatitisCVirus（ＨＣＶ）NS5ABindsRNA-dependentRNAPolymerase（RdRP）
NS5BandModulatesRNA-dependentRNAPolymeraseActivity
(Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ５ＡのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RdRP）である
NS5Bへの結合能ならびにＲｄＲＰ活性に対する影響に関する検討）
論文審査委員 主査 副査
教授 教授 教授
市村宏 福田龍二 佐藤博
内容の要旨及び審査の結果の要旨
ｃ型H千炎ウイルス(HCV)の非構造タンパク質Ｎｓ５Ａはウイルス複製において重要な役割を果たして いることが示唆されているが詳細は明らかでない．今回ＮＳ５Ａが複製酵素の一構成因子である可能性 を検討するため、複製の中心的酵素、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５Ｂとの関係を検討し た．NS5AとＮＳ５Ｂの工ｎｖｉｔｒｏでの結合能を検討するため、それぞれをｍｋＧとＧＳＴにて梼職し た大腸菌組み替えタンパク質として精製しGSTpuU-down法を行った．なおＮＳ５ＢはＣ末端膜結 合ドメインを切断し可溶化したNS5Btを用いた．さらにｍｖｍｏでの結合ならびに結合領域の検 討のため，Ｃ末端ＦｴZAG標識ＮＳ５Ａ野生体あるいはＮ末端、Ｃ末端切断、中抜き変異体とGST-NS5B をＣｏＳエ細胞に一過性共発現させ、ＧＳ面レジンにて共沈し、Wes上ernB1otting法にてＮＳ５Ａを検 出した．またＮＳ５Ａに対するＦＬＡＧ標識の影響を検討するためＮ末端ＦＬＡＧ標識ＮＳ５Ａを用いた検討 も行った．更にＮＳ５ＢのＲＭ依存性ＭＨポリメラーゼ活|生に対するＮＳ５Ａの影響を検討するため、
po1y(Ａ）aependentUMPmcorporationassayを行った．ＦｍＧあるいはＧＳＴ標識ＮＳ５Ａの 大腸菌組み替えタンパク質は充分量の精製が困難であったため、この検討にはＨｉｓ標識ＮＳ５Ａを用 いた．得られた結果は以下のように要約される．
NS5AとNS5Btはｍｖｉ亡ｒｏで直j妾的かつ特異的に結合する．
NS5AとＮＳ５Ｂはｉｎｖｉｖｏにおいても相互作用する．
ｉｎｖｉｖｏ，ｉｎⅦ亡Ｚ。ともに両者の結合にはＮＳ５Ａ内の105-ｴ６２と277-334アミノ酸領域
が必須である．両者の相互作用はNS5BtとＮＳ５Ｂ間で差はなく，ＮＳ５Ａに対する標識も影響しない．
NS5AはＮＳ５ＢのＭＡ依存性RNAポリメラーゼ活性を修飾し，この修飾は両蛋白の結合を介
した反応である．●●●『‐‐一〔“〃』《少、） ●●□列』△戸』，）
以上より、ＮＳ５Ａが二つの領域を介してＮＳ５Ｂと直接結合しＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を
●修飾することが示され、ＮＳ５ＡがＨＣＶ複製酵素の一構成因子であることが明らかとなった．
本研究は，ｃ型肝炎ウイルス複製機構を説明する新しい知見であり、学位に値すると判断された．
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