田代 浩平 学 位 の 種 類

氏 名 ^{たしろ こうへい}

田代 浩平

学 位 の 種 類

博士（医学）

報 告 番 号

甲第

号

学位授与の日付

令和

年

月

日

学位授与の要件

学位規則第

条第

項該当（課程博士）

学 位 論 文 題 目

Sacubitril/Valsartan Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy in Angiotensin II-Induced Hypertensive Mice Independent of a Blood Pressure-Lowering Effect

（サクビトリル/バルサルタンは、アンジオテンシンⅡ誘発性高 血圧マウスの心筋細胞肥大を血圧降下作用とは独立して抑制す る）

論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授

藤田 孝之

（副 査） 福岡大学 教授

鍋島 一樹

福岡大学 教授

大倉 義文

内 容 の 要 旨

【目的】

効果的な降圧薬が利用できるようになったにもかかわらず、高血圧は依然として心不 全、筋梗塞、脳卒中、腎臓病の主要な危険因子である。高血圧が持続すると心臓の後負 荷が増大し、左室壁の肥厚が生じることが知られている。左室肥大は、初期は壁ストレ スを最小化するための代償メカニズムとして発生するにもかかわらず、心血管系リスク の増加と関連している。

アンジオテンシン受容体ネプリライシン阻害薬であるサクビトリル/バルサルタンは PARADIGM-HF 試験で心不全患者の死亡リスクや入院リスクを軽減することが示されたが、

その作用機序は十分には解明されていない。しかし、幾つかの研究ではサクビトリル/バ ルサルタンが血圧の低下とは無関係に左室肥大を減少させている可能性が示唆されてい る。

そこで我々は、アンジオテンシン II 誘発性心肥大マウスモデルにおいて既存の高血圧 治療薬とサクビトリル/バルサルタンが左室リモデリングに及ぼす影響を調べた。

【対象と方法】

8 週齢の雄の C57BL/6J マウスを高血圧群（サクビトリル/バルサルタン群、バルサルタ

ン群、エナラプリル群、コントロール群）と Sham 群に振り分けした。イソフルランで吸

入麻酔を行い、高血圧群にアンジオテンシンⅡ(3.2mg/kg/日)、Sham 群に生理食塩水を封 入した浸透圧ポンプを背側の皮下へ植え込みを行った。

浸透圧ポンプ埋め込みから７日後に各種薬剤をコーン油に懸濁し、２週間の強制経口 投与を行った。薬剤投与量はそれぞれサクビトリル/バルサルタン 60mg/kg/日（サクビ トリルとバルサルタンを 1:1 で混合した）、バルサルタン 30 mg/kg/日、エナラプリル 12 mg/kg/日であった。コントロール群および Sham 群ではコーン油のみを強制経口投与 した。

一週間ごとに Tail cuff を用いて血圧の測定を行い、浸透圧ポンプ埋め込み前と植え 込み３週間後に心臓超音波検査を行った。心臓超音波検査では、乳頭筋レベルで M-モー ドを用いて左室壁厚、左室内腔、心拍数を計測し、それらから左室心筋重量係数も算出 し心機能評価を行った。

浸透圧ポンプ植え込み３週間後にマウスを屠殺し心臓を摘出した。摘出した心臓は組 織学的解析を行い、HE 染色で心筋細胞の大きさ、picro-sirius red 染色で心筋の線維化 を評価した。また、摘出した心臓の一部から mRNA を抽出し ANP、BNP、TGF-βの発現を評 価した。

統計学的解析は SAS(ver. 9.4)を用いて行った。同グループの血圧や心臓超音波所見は unpaired t-test、各グループ間の項目は ANOVA test にて検定を行い、有意水準は p<0.05 とした。

【結果】

アンジオテンシンⅡは Sham 群と比較して全群において血圧を上昇させ、サクビトリル/

バルサルタン群、バルサルタン群、エナラプリル群いずれにおいても血圧上昇抑制効果 に有意差は認められなかった。

心臓超音波検査では、Sham 群と比較してコントロール群、バルサルタン群、エナラプリ ル群では左室壁肥厚を認めたのに対してサクビトリル/バルサルタン群のみ左室壁肥厚の 抑制が有意に認められ、左室質量を減少させる傾向にあった。

組織学的解析では、サクビトリル/バルサルタンはアンジオテンシンⅡによる心筋細胞 の肥大を有意に抑制し、サクビトリル/バルサルタン群の心筋細胞はバルサルタン群、エ ナラプリル群に比べて小さくなった。細胞間質および血管周囲の線維化は Sham 群と比較 して全群において緩徐に増加したが、各薬剤間での有意な差は認められなかった。

ANP や BNP といった転写因子の活性化は心臓に対する圧負荷増大を反映しており、アン

ジオテンシンⅡはコントロール群と比較してサクビトリル/バルサルタン群、バルサルタ

ン群、エナラプリル群全てで ANP の遺伝子発現レベルを有意に上昇させた。BNP の遺伝子

発現レベルは、コントロール群と比較しバルサルタン群とエナラプリル群では有意に上

昇したがサクビトリル/バルサルタン群では有意に上昇しなかった。TGF-βは線維化に関

わるレギュレーターとして知られているが、TGF-βの mRNA レベルは Sham 群と比較して

全群で上昇し、各薬剤間での有意な差は認められなかった。これは組織学的な解析とも

矛盾しない結果であった。

以上の結果より、サクビトリル/バルサルタンがアンジオテンシンⅡ誘発性高血圧マウ スの心肥大を抑制することを示した。血圧が同程度であっても、サクビトリル/バルサル タン投与により従来の治療薬（エナラプリル、バルサルタン）と比較して左室壁肥厚と 心筋細胞の肥大が有意に抑制された。さらにサクビトリル/バルサルタンの抗肥大作用は 心筋の線維化とは無関係であった。

【結論】

サクビトリル/バルサルタン、バルサルタン、エナラプリルはマウスのアンジオテンシ ン II による心筋細胞の肥大を抑制した。その中でも、サクビトリル/バルサルタンは血 圧低下作用と心筋線維化の進行とは無関係に最も強い心筋肥大抑制作用を示した。我々 の知る限りでは、本研究はサクビトリル/バルサルタンが高血圧性心疾患の初期段階で有 益な効果を有することを示した最初の研究である。

審査の結果の要旨

本論文は、Sacubitril/Valsartan の心血管疾患抑制効果は心肥大抑制作用による、とい う仮説について、マウスを用いた動物実験で検証した結果を報告したものである。

心筋肥大と心血管疾患発症には関連性があることが複数報告されている。また

PARADIGM-HF 試験では、ネプリライシン阻害薬とアンジオテンシン受容体拮抗薬の合剤で ある Sacubitril/Valsartan が、従来の心不全治療薬である Enalapril と比較して左室収 縮能の低下した心不全患者の心血管死を 20%、心不全による入院を 21%低減させたと報告 された。しかしその詳細なメカニズムは明らかではなく、本研究はそれを解明すべく行 われたものである。

研究方法としては、8 週齢の雄性 C57BL6/J マウスにアンジオテンシンⅡの持続皮下投与 を行い、Control 群、Sacubitril/Valsartan 群（60mg/kg/day） 、Valsartan 群

（30mg/mg/day） 、Enalapril 群(12mg/kg/day)に割り付け、アンジオテンシンⅡ投与開始

7 日後から各薬剤の経口投与を行った。また、アンジオテンシンⅡと経口薬の投与を行わ

ない Sham 群も設定した。薬剤経口投与は 14 日間行い、マウスを安楽死させた後に心臓

を摘出した。実験期間中は、7 日ごとに血圧測定をし、実験開始前と安楽死前に心エコー

検査を行った。結果、Control、Sacubitril/Valsartan、Valsartan、Enalapril 群は

Sham 群と比較すると血圧が上昇したが、アンジオテンシンⅡを投与した 4 つの群の間で

は有意差を認めなかった。また心エコーでは、Sacubitril/Valsartan 群でのみアンジオ

テンシンⅡによる左室肥大が有意に抑制されていた(vs. Control 群、p<0.05)。心筋の組

織学的解析では、Sacubitril/Valsartan、Valsartan、Enalapril 群はいずれもアンジオ テンシンⅡによる心筋細胞肥大を抑制したが、Sacubitril/Valsartan の効果が最も強力 であった(vs. Valsartan 群, p<0.05、vs. Enalapril 群, p<0,05)。また、心筋組織の線 維化に関しては各群間で有意差を認めなかった。心筋肥大マーカーである BNP の mRNA は、左室心尖部心筋から抽出した mRNA を鋳型とした cDNA を用いて qPCR 法で測定した。

Control、Valsartan、Enalapril 群は Sham 群と比較して有意に BNP の mRNA の発現が亢進 したが（vs. Control 群, p<0.05） 、Sacubitril/Valsartan 群のみ BNP の発現が Sham 群 と比較して有意差を認めなかった。今回の実験では、高用量のアンジオテンシンⅡを投 与したためか、各薬剤の有意な血圧低下作用は認められなかったが、心筋肥大に対して は抑制的に働いていることが確認された。また、心筋の線維化は軽度に留まっており、

心肥大の原因としては間質の線維性組織増生よりも心筋細胞の肥大が主な要因であると 考えられた。今回使用した各薬剤の中でも Sacubitril/Valsartan は他の薬剤より強く心 筋肥大を抑制しており、強力な心肥大抑制作用を持つことが示された。したがってこの 心肥大抑制作用が、臨床研究における Sacubitril/Valsartan による心血管疾患発生抑制 に寄与した可能性が示唆された。

以上より、Sacubitril/Valsartan はアンジオテンシンⅡ誘発性心肥大マウスにおいて 血圧非依存性に心筋細胞の肥大を抑制したと申請者らは報告した。

1. 斬新さ

Sacubitril/Valsartan は臨床的には左室収縮能の低下した心不全症例が適応になっ ており、過去に報告された Sacubitril/Valsartan の作用を検討する動物実験は、心 筋梗塞モデルや虚血再灌流モデルなど左室収縮能障害を呈する動物モデルで実施さ れていた。本研究では、高血圧モデルおよび心肥大に対する Sacubitril/Valsartan の効果を、アンジオテンシンⅡ誘発性心肥大マウスにおいて検証した点に斬新さが ある。

2. 重要性

Sacubitril/Valsartan の臨床における心血管疾患抑制効果は、過去の大規模臨床試 験において証明されている。また、心肥大と心血管疾患の関連性は過去に複数報告 されている。本研究では、Sacubitril/Valsartan の心肥大抑制作用が示されてお り、これは Sacubitril/Valsartan の心血管疾患抑制の機序解明の一助となるものと して重要である。

3. 実験方法の正確性

本研究は、福岡大学動物実験委員会の承認（承認番号 1814112）を受けた研究であ

る。また、Cardiology Research にも掲載された論文であり、研究方法は評価されて

いる。

4. 表現の明確さ

目的、方法、結果は正確かつ詳細に表現している。結果に基づいた考察について は、過去の論文などを十分に検討し、Sacubitril/Valsartan の心筋肥大に対する影 響についての結果を示すと共に、文献的考察も行われている。

5. 主な質疑応答

Q1:研究において、どういった部分に自身が関与したか。

A1:研究のデザイン、各種実験手技、データ収集、データの分析と解釈、論文の執筆を行 った。

Q2:モデルについて、アンジオテンシンⅡの投与期間や投与量は人間の高血圧患者として はどういった状態を想定しているのか。

A2:過去の報告では C57BL6/J マウスは 0.5mg/kg/day のアンジオテンシンⅡでも血圧が上 昇することが確認されているが(Kawada N. J Am Soc Nephrol. 2002, 13)、今回は 3.2mg/kg/day という高用量を投与している。さらに各種薬剤を経口投与しても Control 群と比較して血圧低下作用が確認できなかったことと、アンジオテンシンⅡによる心筋 肥大が生じていたことから、単一クラスの降圧薬ではコントロールができない治療抵抗 性の高血圧、かつ左室肥大を生じている高血圧性心臓病を合併している状態と想定し た。しかし、心筋の線維化は生じていたが軽度であったことから比較的早期段階の高血 圧性心臓病であるとも考えられる。

Q3:Fig.2 の LV mass index に有意差が出なかったのはなぜか。

A3:LV mass index は論文中に記載している計算式を用いており、心エコーの左室拡張末 期径、収縮期末期径、左室中隔壁厚、左室下壁厚、体重を元に算出している。左室拡張 末期径と収縮期末期径、体重は群間差を認めておらず、左室中隔壁厚と左室下壁厚のみ 群間差を認めていたため LV mass index に関しても同様の結果でよいと予想される。そ れにも関わらず有意差がつかなかったのは n 数が少なかったためと考えられる。

Q4:心筋細胞肥大の実態とは何か。細胞内小器官でどういうことが起こるのか。

A4:左室肥大に関しては心筋細胞の肥大と細胞間質の線維性組織増生が寄与すると考えら れるが、今回の実験では線維化は強く誘導しておらず心筋細胞肥大が主な要因であった と考える。細胞内小器官に関しては、アンジオテンシンⅡ刺激によって心筋ミオシン重 鎖の遺伝子発現が亢進していたと報告されている(Wang B. Can J Physiol Pharmacol.

2006, 84)ことから、本実験でもミオシンなどの筋原線維を形成する器官が増加したので

はないかと考えられる。

Q5:Fig.5 における BNP と ANP の結果の違いは何か。

A5:共にナトリウム利尿ペプチドであるが、BNP は主に心室、ANP は主に心房の心筋細胞 から分泌されている。今回、左室肥大を反映した形で BNP では群間差が生じたが、心房 に関しては左室よりも壁が薄いことから群間差が生じなかったのではないかと考える。

Q6:体重や左室重量はどうだったか。

A6:動物モデルにおいてアンジオテンシンⅡは異化を亢進させて体重を減少させることが 知られており(Brink M. J Clin Invest. 1996, 1)、今回の実験でもアンジオテンシンⅡ を投与した 4 つの群では体重が有意に減少した。各群間差は認めなかった。左室重量は 測定していないが心臓全体の重量は測定しており、5 群間で有意差は認めなかった。

Q7:Sacubitril/Valsartan の 1:1 はモル比あるいは重量比か。

A7:臨床的には重量比で使用されており、それに準じて重量比で実験を行った。

Q8:Sacubitril の効果としてネプリライシン阻害効果が関与していると考えられるが cGMP についての評価は行ったか。

A8:cGMP についての評価は行っていない。過去に Sacubitril/Valsartan を用いた動物実 験で尿中の cGMP 濃度を測定したもの(Kusaka H. Am J Hypertens. 2015, 28)もあり、同 様の手法で測定を行うとより詳細なデータが得られた可能性がある。

Q9:ナトリウム利尿ペプチドの mRNA 評価は産生量を見るためではなく、負荷の指標とし て見ていたのか。血中の BNP 濃度は測定したか。

A9:BNP の mRNA は心筋肥大マーカーとしても頻繁に使用されており、今回も肥大の指標と して用いた。血中の BNP 濃度は ELISA 法などで測定可能であり今後の検討課題とした い。

Q10:実臨床ではどのような患者への投与が望ましいか。

A10:現時点では Sacubitril/Valsartan は慢性心不全のみに対して適応があり、

PARADIGM-HF 試験および PARAGON-HF 試験の結果から左室収縮能の低下した心不全患者に のみエビデンスが認められている。しかし、今回の実験結果を考慮すると、左室収縮能 が保たれていても高血圧性心臓病の早期段階には心肥大抑制効果が認められるかもしれ ない。

Q11:ネプリライシンはナトリウム利尿ペプチド以外の因子へ影響するのか。

A11:ネプリライシンは様々なペプチドを分解しており、血管拡張や利尿など心血管系に

保護的な作用を持つ BNP や ANP 以外に、本研究で使用したアンジオテンシンⅡや非常に

強力な血管収縮因子であるエンドセリンなども分解している。

Q12:Sacubitril/Valsartan の心肥大抑制効果が血圧と独立しているとする根拠は何か。

A12:今回の実験ではアンジオテンシンⅡの投与により血圧が上昇し、

Sacubitril/Valsartan、Valsartan、Enalapril いずれを内服させても血圧は低下しなか った。その中で、Sacubitril/Valsartan は他の薬剤と比較して強力な心肥大抑制効果を 発揮したため血圧とは独立した心肥大抑制効果があったと判断した。PARADIGM-HF 試験で は、Sacubitril/Valsartan 群は Enalapril 群よりも僅かではあるが血圧が低下していた ものの、統計学的解析の結果、血圧低下が心血管系イベント抑制には寄与していないと 結論づけられており大規模臨床試験とも矛盾しない結果であると考えた。

Q13:血圧が関与していないとすると何が関与しているか。

A13:ネプリライシン阻害による BNP の分解抑制が関与していると考えられる。また、ネ プリライシン阻害による PTEN/PI3K/AKT シグナル伝達抑制は心肥大を抑制すると報告さ れており(Iborra-Egea O. NPJ Syst Biol Appl. 2017, 18) 、レニン・アンジオテンシ ン系やナトリウム利尿ペプチドを介さないシグナル伝達系も心肥大抑制に寄与している 可能性がある。

Q14:心肥大モデルはなぜ大動脈縮窄モデルではなくアンジオテンシンⅡモデルにしたの か。

A14:大動脈縮窄モデルは一度開胸した後に大動脈に狭窄を作成し、再度閉胸する手技で あり侵襲度が非常に高い。アンジオテンシンⅡモデルは浸透圧ポンプの皮下埋込のみで 作成することができ、比較的侵襲度が低いため手術侵襲による影響を小さくできると考 えた。

Q15:容量負荷に関してはどう考えるか。またどうやって評価するか。

A15:レニン・アンジオテンシン系は水と Na

を再吸収する方向に働くため容量負荷は生じ ていたと考えられる。しかし、アンジオテンシンⅡを投与した群間で体重に有意差はな く著明な体液貯留は来していなかったと考える。

その他の質問についても、申請者は適切に答えた。本研究では、

Sacubitril/Valsartan がアンジオテンシンⅡ誘発性心肥大モデルマウスにおいて、血圧

非依存的に心筋細胞の肥大を抑制したことが示唆され、Sacubitril/Valsartan が高血圧

性心臓病の早期治療に有効である可能性を示したものであり、学位論文に値すると評価

された。