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アクセス（2 ページ）
STEP 1： 製品検索・注文ページへのアクセスからユーザー認証まで
ユーザー認証（2-3ページ）
E-mailアドレスおよびパスワードを入力製品を検索・選択しカートへ移動（4 - 46ページ）
カートページで注文を確定（47 - 48ページ）
注文製品ならびにTerms and conditionsを確認して注文を確定
STEP 2： 製品の検索・選択からカートへの移動まで
STEP 3： カートページから注文完了まで
STEP1： 製品検索・注文ページへのアクセスからユーザー認証まで
1-1) ホームページ（dharmacon. horizondiscovery.com）にアクセスしてください。ページ上部の「ログイン」 （赤実線枠）をクリックし、ログインページに進んでください。 1-2) ご登録のメールアドレスとパスワードを入力し、ログインボタン（青点線枠）をクリックしてユーザー 認証してください。 注1） ユーザー認証後に右上に日の丸マーク(赤実線枠）が出ていることを確認してください。 注2） パスワードを忘れた場合には、「パスワードをお忘れですか」を押して新しいパスワードを発行してください。 新しいパスワードはご登録のメールアドレスに届きます。 21-3) ログインすると、「ログイン」の表示が「登録メールアドレス」（赤実線枠）になり、ユーザー登録情報のページ が表示されます。プロファイル（青点線枠）をクリックするとユーザー登録情報が表示されます。 [email protected] Horizon大学 医学部 Suzuki Ichiro 様 [email protected] [email protected] XXX-XXXX-XXXX
STEP2： 製品の検索・選択からカートへの移動まで
お求めの製品により、以下のページをご覧ください
<RNA干渉>
A. デザイン済みsiRNA
5 - 7 ページ
B. カスタムsiRNA
8 - 9 ページ
C. デザイン済みshRNA発現ベクター
10 ページ
D. デザイン済みmicroRNA研究用試薬
11 ページ
E. RNAi コントロール試薬
12 - 13 ページ
F. トランスフェクション試薬
14 - 15 ページ
G. ウイルスパッケージング試薬
15 ページ
H. その他の試薬（5 x siRNA Buffer等）
15 ページ
<ゲノム編集（CRISPR-Cas9）>
Edit-R CRISPR-Cas9 ゲノム編集アプリケーション概要
16 - 17 ページ
I. デザイン済みcrRNA/sgRNA
18 - 20 ページ
J. Cas9 ヌクレアーゼ
21 - 22 ページ
K. dCas9-VPR
23 - 24 ページ
L. 遺伝子ノックアウト用のカスタムガイドRNA
25 - 28 ページ
M. DNA配列挿入・欠失・置換用のカスタムガイドRNA＆ssDNAドナー
29 - 34 ページ
N.蛍光レポーター遺伝子/カスタム配列導入用のカスタムガイドRNA＆PCRプライマー
35 - 40 ページ
<遺伝子過剰発現>
O. cDNA/ORFクローン
41 ページ
P. 酵母クローン（ノックアウト株等）
42 ページ
<カスタムCherry-pick ライブラリー>
Q. siRNA/microRNA/crRNAカスタムライブラリー
43 - 46 ページ
4A. デザイン済みsiRNA
2-A-1) ヒト・マウス・ラット用（Lincodeはヒト・マウスのみ）のデザイン済みsiRNA（siGENOME、ON-TARGETplus、 Accell、Lincode）をご注文いただくには、ページ上部にあるウィンドウ（赤実線枠）に、以下の項目のいずれか一 つを入力し、検索ボタン（ ）をクリックしてください。
Ref Seq Accession (例：NM_002969、NR_002802) Gene ID (例：6300、283131)
Gene Symbol (例：MAPK12、NEAT1)
Catalog No. (例：L-003590-00、R-188237-00) 下の画面は「MAPK12」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する学術情報が「遺 伝子」のフィールドに表示されます。siRNAのリンク（青点線枠）から各製品リストのページに移動してください。
◆デザイン済みsiRNA製品ラインアップ
あらかじめ配列がデザインされたsiRNAは、siGENOME、ON-TARGETplus、Accell、Lincodeの4種類の製品タイプがあります。いずれの製 品も、NCBI RefSeqデータベースに登録されているヒト・マウス・ラットの遺伝子をほぼ完全に網羅しています（Lincodeはヒト・マウスのみ ）。2-A-2)下の画面はヒトMAPK12遺伝子に対するsiRNAを検索した結果が表示された状態です。+（赤実線枠）をクリック すると、詳細な製品リストが表示されます。（siRNA製品ラインアップについては5ページを、製品フォーマットについて は7ページをご参照ください）。 2-A-3) タブ（赤実線枠）をクリックすることで、各容量を選択できます。希望の容量を選択後、「ショッピングカ ートに入れる」ボタン（青点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。 6
SMARTpool
1つの遺伝子に対して配列デザインの異なる4種類のsiRNAをPool （混合物）として1本のチューブに入れた製品です。個々のsiRNAが 変異遺伝子や未知SNP部分をターゲットとした場合には、他の siRNAがそれを補うため、1アッセイで確実なノックダウンを実現で きます。また、PoolすることによりsiRNAあたりの実濃度を低くでき るため、オフターゲット効果の低減にも効果的です。Set of 4
1つの遺伝子に対して配列デザインの異なる4種類のsiRNAをそれ ぞれ個別のチューブに入れ、チューブ4本で1セットとした製品です 。Set of 4 upgrade
同一のターゲット遺伝子に対するSMARTpoolを購入した方のため に、価格を抑えたアップグレード用製品です。内容はSet of 4と同じ です。 （以前にSMARTpool製品をご購入のお客様に限り、同一遺伝子の 「Set of 4 upgrade」製品を購入できます。同一遺伝子の 2-A-4) ショッピングカートに製品が入ると、ショッピングカート内のカッコ内の数字が変わります。数字はアイテム数を 示しています。ショッピングカートの上をマウスオーバーすると、ショッピングカートの中味（赤実線枠）が表示されます 。また、「ショッピングカートに入れる」ボタンが「追加する」（青点線枠）に変わります。◆デザイン済みsiRNA製品フォーマット
B. カスタムsiRNA
2-B-1) カスタムsiRNA製品をご注文いただくには、ホームページ（http://dharmacon.horizondiscovery.com ）のトップページのカスタムRNA合成（赤実線枠）にアクセスしてください。 2-B-2) カスタムsiRNA製品をご注文いただくには、Productタブ（緑実践枠）から、Order siRNA（赤実線枠） をクリックして進んでください。 82-B-4) Step Oneではオリゴの名前、タイプ、Processingオプション、合成スケール、Step Twoではターゲット配列など を入力します。オーバーハングはデフォルトの状態ではUU が選択されています。dTdTなど他のオーバーハングを 選択する場合には、オーバーハングの項目で選択してください。下の図は、siRNAの名前をtest、タイプをAccell、 ProcessingオプションをStandars(A4)、合成スケールを0.05 µmol Scale、ターゲット配列を「
UGGUUUACAUGUUCCAAUA」、オーバーハングをUUとして入力した場合です。入力確認後、「Populate」ボタン（赤 実線枠）をクリックするとStep Threeに価格が表示されます（緑実線枠）。 「ショッピングカートに入れる」ボタン（青 点線枠）を押すと製品がショッピングカートに入ります。
C. デザイン済みshRNA発現ベクター
2-C-1)ヒト・マウス・ラット用のデザイン済みshRNA発現ベクターを検索いただくには、ページ上部にあるウィ ンドウ（赤実線枠）に、以下の項目のいずれか一つを入力し、検索ボタン（ ）をクリックしてください。 Ref Seq Accession (例：NM_007299)
Gene ID (例：672) Gene Symbol (例：BRCA1) Catalog No. (例：SK-003461-00) 下の画面は「NM_007299」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する学術情 報が「遺伝子」のフィールドに表示されます。shRNAのリンク（青点線枠）から各製品リストのページに移動し てください。 2-C-2) 各種デザイン済みshRNA発現ベクターの+（赤実線枠）をクリックすると、さらに詳細な製品リストが表示されま す。希望の製品を選択後、「ショッピングカートに入れる」ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります 。
注) SMARTvector Lentiviral shRNAの購入に際しては SMARTchoice Promoter Selection Plate（製品コード SP-001000-01）を、SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA の購入に際してはSMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Pack（製品コード VSC6847）用いて、使用 する細胞に最適なプロモーターを事前に検討・選択することをおすすめします。
D. デザイン済みmicroRNA研究用試薬
2-D-1)ヒト・マウス・ラット用のデザイン済みmicroRNA研究用試薬（miRIDIAN microRNA Mimicおよび Hairpin Inhibitor）をご注文いただくには、ページ上部にあるウィンドウ（赤実線枠）に、以下の項目のい ずれか一つを入力し、検索ボタン（ ）をクリックしてください。
miRBase Mature Accession (例：MIMAT0000065、MIMAT0000246) miRBase Precursor Accession (例：MI0000065、MI0000256) miRBase ID (例：hsa-let-7d、mmu-mir-122)
Catalog No. (例：C-300478-07、C-310464-07、IH-300478-08)
下の画面は「MIMAT0000065」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する 学術情報が「遺伝子」のフィールドに表示されます。microRNAのリンク（青点線枠）から各製品リストのペ ージに移動してください。 2-D-2)下の画面はhas-let-7d-5pに対するmicroRNA試薬を検索した結果が表示された状態です。+（赤実線枠）をクリ ックすると、詳細な製品リストが表示されます。希望の製品を選択後、「ショッピングカートに入れる」ボタンをクリック すると製品がショッピングカートに入ります。
E. RNAi コントロール試薬
2-E-1) RNAi コントロール試薬をご注文いただくには、ホームページ（http://dharmacon.horizondiscovery.com）の トップページのRNA干渉（赤実線枠）にアクセスしてください。
2-E-2) RNAi Controls（赤実線枠）をクリックしてください
2-E-3) ご希望のRNAi コントロール試薬にアクセスしてください。以下に、「ON-TARGETplus Controls」 （赤実線枠）を 例に説明します。
2-E-4)下の図は、各種ON-TARGETplus コントロール試薬を表示した画面です。ご希望のON-TARGETplus コントロール にアクセスし、ショッピングカートに入れてください。ターゲット遺伝子に対するsiRNAとしてON-TARGETplus をご使用 の場合は、ネガティブコントロールとしてON-TARGETplus Non-targeting コントロールを必ずご選択ください。
F. トランスフェクション試薬
2-F-1) トランスフェクション試薬（DharmaFECT等）をご注文いただくには、 2-E-1)と同様にDharmacon本社Webサ イト（http://dharmacon.horizondiscovery.com）のトップページからRNA干渉に進み、「Transfection」（赤実線枠） にアクセスしてください。 2-F-2) 下の図は、Productsタブ（赤実線枠）をクリックして各種トランスフェクション試薬（DharmaFECT等）を表示 した画面です。ご希望のトランスフェクション試薬にアクセスし、ショッピングカートに入れてください。Cell Line Data（緑実線枠）をクリックすると、細胞株ごとに最適なDharmaFECT試薬を検討した例が表示されますので、製 品選択のご参考にしてください（15ページ参照）。 14G. ウイルスパッケージング試薬
2-G-1) ウイルスパッケージング試薬（Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit等）をご注文いただくには、 2-E-1)と 同様にホームページ（http://dharmacon.horizondiscovery.com）のトップページからRNA干渉に進み、「Viral Packaging」（赤実線枠）にアクセスしてください。
H. その他の試薬（5 x siRNA Buffer等）
2-H-1) その他の試薬（5X siRNA Buffer、 Accell siRNA Delivery Media、RNase-free Water等）をご注文いただくに は、 2-E-1)と同様にホームページ（http://dharmacon.hirizondiscovery.com）のトップページからRNA干渉に進み 、「Ancillary Reagents」（赤実線枠）にアクセスし、ご希望の試薬を選択してショッピングカートに入れてください。
Horizon Discovery社では、下記3つのアプリケーションに合わせて、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編 集に必要なコンポーネントであるガイドRNA（guide RNA）・Cas9ヌクレアーゼ・ドナーDNA（donor DNA）をご 用意しています。 ➢ 遺伝子ノックアウト ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを使用して、ターゲット遺伝子の機能をゲノムDNAレベルで欠損さ せる手法です（A）。この手法は、塩基配列は既知だが機能のよくわかっていない遺伝子を研究 する際に用いられます。RNA干渉によるmRNAレベルでの遺伝子ノックダウンでは表現型の違 いが検出されない遺伝子の機能研究に有効です。 ➢ 遺伝子ノックイン＆塩基配列の挿入・欠失・置換 ガイドRNA・Cas9ヌクレアーゼ・ドナーDNAを使用して、ゲノム上のターゲット部位に、タンパク質 をコードする遺伝子を導入したり、塩基配列の挿入・欠失・置換を行う手法です（B）。 ➢ 遺伝子の転写活性化 ガイドRNAと改変Cas9ヌクレアーゼを使用して、ターゲット遺伝子の転写を活性化させる手法で す（C）。この手法では、遺伝子過剰発現用プラスミドの使用を回避しつつ、内在性の遺伝子の 転写活性化を実現します。RNA干渉による遺伝子ノックダウンや、遺伝子ノックアウトによる機 能欠損では表現型の違いが検出されない遺伝子の機能研究に有効です。
Edit-R CRISPR-Cas9 ゲノム編集アプリケーション概要
Cas9 ヌクレアーゼが、ターゲット配列に相補的なガイドRNAと複合体を形成してゲノムDNAのターゲット配列を認識し、 PAM配列より上流の二本鎖DNAを切断します。切断されたゲノムは修復機構が働いて再結合しますが、切断されたゲノ ムの末端は高頻度で欠損あるいは変異します。したがって再結合してもDNAのフレームがシフトし、切断個所の遺伝子 がノックアウトされます。ガイドRNAとしてCRISPR RNA (crRNA) : trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) ハイブリッドを用 いる方法と、シングルガイドRNA（single guide RNA、sgRNA）を用いる方法があります。A. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子ノックアウトのメカニズム
A. crRNA : tracrRNA ハイブリッドを用いる方法 B. sgRNA を用いる方法
C. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子の転写活性化のメカニズム
Edit-R CRISPR-Cas9システムを使用した遺伝子の転写活性化（CRISPR activation, CRISPRa）は、野生型のCas9ヌクレアーゼの持 つDNA切断活性を欠失させたdead Cas9 （dCas9）に3種類の転写活性化因子（VP64、p65、Rta）を融合させた改変Cas9 ヌクレ アーゼ（dCas9-VPR）と、ターゲット遺伝子のプロモーターあるいは転写開始点（TSS）に近接した領域に配列設計したガイドRNA （guide RNA）を細胞内に導入し、ターゲット遺伝子の転写を活性化する手法です。dCas9-VPRは、ターゲット配列に相補的な CRISPR RNA (crRNA) : trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) ハイブリッドあるいは、シングルガイドRNA（single guide RNA、 sgRNA） と複合体を形成してゲノムDNAのターゲット配列に結合します。そして、ターゲット遺伝子の転写開始点に転写活性化 因子が作用することで転写を活性化します。
A; crRNA : tracrRNA ハイブリッドを用いる方法 B; sgRNA を用いる方法
CRISPR-Cas9による二本鎖切断に続いて起こる相同組み換え修復（homology-directed repair: HDR）は、特定 のゲノム改変位置に隣接した配列に相同性を持つドナーDNA（donor DNA）を必要とする修復経路です。適切 に設計されたドナーDNAを使用することで、遺伝子ノックインや塩基配列の挿入・欠失・置換を正確に行うこと ができます。Dharmacon Webサイト（dharmacon.horizondiscovery.com）のWebツールであるEdit-R HDR Donor Designer （dharmacon.horizondiscovery.com/gene-editing/crispr-cas9/edit-r-hdr-donor-designer/）の使用によ り、ヒト・マウス・ラットの遺伝子について、ドナーDNAの設計を直感的で簡便に行うことができます。
ドナーDNA設計ワークフロー
CRISPR Design Tool でカスタム設計。あるい は、デザイン済みガイドRNA （knockout用) から選択。
①ガイドRNA配列の決定 ②切断したいゲノム配列位置の決定 ③ドナーDNAの設計
一本鎖DNAドナーオリゴを使用して塩基配列（ 長さ50 nt以下）を挿入・欠失・置換する場合 Edit-R HDR Donor Designer – oligo に、ステップ ①で決定したガイドRNA配列を入力し、切断位 置および挿入・欠失・置換する配列を設計。 ドナープラスミドを使用して、蛍光レポーター遺 伝子あるいは塩基配列（長さ50 nt以上）を挿 入する場合
Edit-R HDR Donor Designer – plasmid に、ステ ップ①で決定したガイドRNA配列を入力し、挿 入位置を決定。 一本鎖DNAドナーオリゴを使用して塩基配列（ 長さ50 nt以下）を挿入・欠失・置換する場合 ステップ②で設計した一本鎖DNAドナーオリゴ の配列が自動で設計されるので注文へ。 ドナープラスミドを使用して、蛍光レポーター 遺伝子あるいは塩基配列（長さ50 nt以上）を 挿入する場合 ステップ②で決定した遺伝子挿入位置を反映 した、ドナープラスミド作製時に必要なホモロ ジーアームPCRプライマーの配列が自動で設 計されるので注文へ。
B. CRISPR-Cas9 システムによる遺伝子ノックインや塩基配列の挿入・欠失・置換
I. デザイン済みcrRNA/sgRNA
2-I-1) ヒト・マウス・ラット用のデザイン済みcrRNAおよびsgRNAをご注文いただくには、ページ上部にあるウィンドウ（赤実線 枠）に、以下の項目のいずれか一つを入力し、検索ボタン（ ）をクリックしてください。
Ref Seq Accession (例：NM_004985.4 ) Gene ID (例：3845)
Gene Symbol (例：KRAS) Catalog No. (例：CR-005069-01)
下の画面は「NM_004985.4 」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する学術情報が「遺伝子」 のフィールドに表示されます。crRNA/sgRNAのリンク（青点線枠）から各製品リストのページに移動してください。
2-I-2)下の画面はヒトKRAS遺伝子に対するcrRNA/sgRNAを検索した結果が表示された状態です。遺伝子ノック アウトにはEdit-R CRISPR (knockout) crRNA/sgRNAを、遺伝子の転写活性化にはEdit-R CRISPR (activation) crRNA/sgRNAを選択してください。+（赤実線枠）をクリックすると、詳細な製品リストが表示されます。
2-I-3) タブ（赤実線枠）をクリックすることで、各容量を選択できます。希望の容量を選択後、「ショッピングカ ートに入れる」ボタン（青点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。
2-I-4) ショッピングカートに製品が入ると、ショッピングカート内のカッコ内の数字が変わります。数字はアイテム数を示 しています。ショッピングカートの上にマウスオーバーすると、ショッピングカートの中味（赤実線枠）が表示されます。 また、「ショッピングカートに入れる」ボタンが「追加する」（青点線枠）に変わります。
crRNA:tracrRNAの修飾によるヌクレアーゼ耐性
➢ Edit-R crRNAの5’末端とEdit-R tracrRNAの3’末
端に修飾
➢ ヌクレアーゼ耐性をもつガイドRNAとして機能
➢ Cas9へのリクルートは問題なし
➢ RNA分解が遅延 - 特にElectroporationによる
導入で編集効率UP
20J. Cas9 ヌクレアーゼ
2-J-1) Cas9 ヌクレアーゼ試薬をご注文いただくには、Dharmacon本社Webサイト
（http://dharmacon.horizondiscovery.com）のトップページの「ゲノム編集」（赤実線枠）にアクセスしてください。
2-J-3) Productsタブ（赤実線枠）から、ご希望の製品にアクセスしてください。
2-J-4) 下の画面は2-J-3) において Edit-R Cas9 Nuclease Expression reagentsを選択した結果が表示された状態です。 Edit-R Cas9 Expression Plasmidsについてはプロモーター（赤実線枠）と選択マーカーを選択することができます。 「シ ョッピングカートに入れる」ボタン（青点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。
K. dCas9-VPR
2-K-1) dCas9-VPRをご注文いただくには、Dharmacon本社Webサイト
（http://dharmacon.horizondiscovery.com）のトップページ上部バナーの「アプリケーション」から、「CRISPR Activation」（赤実線枠）にアクセスしてください。
2-K-3) 「ショッピングカートに入れる」ボタン（青点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。
2-L-1) Dharmacon本社Webサイト（
http://dharmacon.horizondiscovery.com）の各ページの下にあ るツールバーからCRISPR デザインツール（赤実線枠）にアクセス してください。
L.遺伝子ノックアウト用のカスタムガイドRNA
2-L-3) ターゲット遺伝子全体を対象としてノックアウト用のガイドRNAを設計するには「Input gene ID or gene symbol: design anywhere within gene」（赤実線枠）を選択して下さい。“Next”（青点線枠）をクリックしてください。
2-L-4) ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（Gene IDや生物種）を入力し（赤実線枠）、ターゲット領域 を選択します（緑実線枠）。下図は、ウシのBRCA1遺伝子のタンパク質コード領域に対してガイドRNAを設計 する場合です。“Next”（青点線枠）をクリックしてください。
2-L-5) “Next”（青点線枠）をクリックしてください。
2-L-6) 設計したガイドRNAのターゲット配列候補がエクソン順に表示されます（本デザインオプションでは、タン パク質の機能的なノックアウト能力の順位付けはされません）。使用したガイドRNA設計アルゴリズム（Edit-R algorithm）で予測した各ガイドRNAの特異性は”Specificity”（緑実線枠）に表示されます。希望するガイドRNAの ターゲット配列の□（例えば、赤実線枠）に✔を入れた後、“Next”（青点線枠）をクリックしてください。
2-L-7)タブ（赤実線枠）をクリックすることで、各容量を選択できます。希望の容量を選択後、「ショッピングカート に入れる」ボタン（青点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。（赤点線枠のタブからsgRNA をご注文いただけます）
M. DNA配列挿入・欠失・置換用のカスタムガイドRNA＆ssDNAドナー
2-M-3) 一本鎖DNA（ssDNA）ドナーを用いたDNA配列挿入・欠失・置換用のガイドRNAを設計するには「Input gene ID or gene symbol: precise cleavage for HDR」（赤実線枠）を選択して下さい。“Next”（青点線枠）をクリック してください。
2-M-1) Dharmacon本社Webサイト（
http://dharmacon.horizondiscovery.com）の各ページの下にあ るツールバーからCRISPR デザインツール（赤実線枠）にアクセス してください。
2-M-4)ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（Gene ID等）を入力し（赤実線枠）、生物種を選択します（緑 実線枠）。下図には、ヒトのEGFR遺伝子に対してガイドRNAを設計する場合を例として示しました。設定後、 “Next”（青点線枠）をクリックしてください。 2-M-5) 転写産物を選択します（緑実線枠）（デフォルト設定では主要な転写産物が表示されます）。拡大（小） 鏡とカーソル（緑点線枠）を用いて、編集したいゲノム領域付近を表示させクリックします（例えば、青点線枠）。 表示される赤枠内のゲノム領域が下のパネルに表示されます。下図はヒトのEGFR遺伝子内のエクソン21付近 が例として表示された状態です。ゲノム編集したい塩基配列付近（例えば、赤点線枠）をクリックします。 赤枠 30
2-M-6) 下図はヒトのEGFR遺伝子について、エクソン21にコードされる858番めのアミノ酸であるロイシンをコー ドする塩基配列をクリックした結果が表示された状態です。候補となるガイドRNAのターゲット配列が下のパネ ルに表示されます。希望するガイドRNAのターゲット配列（例えば緑実線枠）をクリックして選択し、NEXT（青点 線枠）をクリックします。 注）各ガイドRNAのターゲット配列には、数字（1、2、3…）と英字（High、Medium、Low）が記載されています。数字は、各ガイドRNAのターゲ ット配列について、タンパク質の機能的なノックアウト能力および特異性の両方を総合的に評価したランキングを示します。ここで、“1”が ランキングが一番高いことを示唆します。なお、英字（High, Medium, Low）は特異性を示します。
2-M-7)ガイドRNAのターゲット配列が表示されます（赤実線枠）。タブ（緑実線枠）をクリックすることで、各容量を 選択できます。希望の容量を選択後、ショッピングカートに入れる（青点線枠）をクリックすると製品がカートに入 りcrRNAをご注文いただけます（赤点線枠のタブからsgRNAをご注文いただけます）。引き続きDNA配列の挿入・ 欠失・置換用のssDNA ドナーをデザインするにはガイドRNAのターゲット配列をメモ（あるいはコピー）した後、 Edit-R HDR Donor Designer（緑点線枠）をクリックしてください。
2-M-8)DNA配列の挿入・欠失・置換用のssDNA ドナー（150ヌクレオチド以下の長さ）を設計する場合は、Edit-R HDR Donor Designer - oligo（赤実線枠）をクリックしてください。
2-M-9)ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（生物種、Gene ID、転写産物等）を、2-M-4)および2-M-5)と同 様に設定し（赤実線枠）、2-M-7)でメモ（あるいはコピー）したガイドRNAのターゲット配列を入力します（緑実線枠 ）。設定後、“Display target region”（青点線枠）をクリックしてください。
2-M-10) ① DNA配列を挿入する場合は、オレンジのスライド（赤実線枠）を、DNA配列を挿入したい箇所までドラ ッグして移動させます。挿入したい塩基（緑実線枠：下図では例としてAGG）を入力後、Get sequence（青点線枠） をクリックします。② DNA配列を欠失・置換させる場合は、オレンジのスライド（赤実線枠）のカギをクリックして 外した後、DNA配列を欠失・置換させたい箇所まで左右のオレンジのスライドをドラッグして移動させます。置換 したい塩基（緑実線枠：下図では例としてT⇒Gへ置換する場合です）を入力後（配列を欠失させる場合はブラン クとしてください）、Get sequence（青点線枠）をクリックします。以降は②の場合を例として説明します。 ① DNA配列を挿入する場合 ② DNA配列を欠失・置換 させる場合
2-M-11)候補となるssDNAドナーの配列が下のパネルに表示されます。推奨されるssDNA ドナー配列が赤実線 枠内に表示されます。青色でハイライトされている塩基は、ガイドRNAによる切断を回避するために導入したサ イレント変異です。希望のssDNA ドナーの□に✔を入れ、ssDNAドナーの名称や合成スケール、合成後の精製 の有無、安定化修飾の有無を入力・選択します（緑実線枠）。「Add to cart」ボタン（青点線枠）をクリックすると製 品がショッピングカートに入ります。 34
N. 蛍光レポーター遺伝子/カスタム配列導入用のカスタムガイドRNA＆PCRプライマー
2-N-3) Edit-R HDR Plasmid Donor Kit システム（40ページ）を用いた蛍光レポーター（EGFP、mKate2）遺伝子ある いはお客様の希望するカスタム配列導入用のガイドRNAを設計するには「Input gene ID or gene symbol: precise cleavage for HDR」（赤実線枠）を選択して下さい。“Next”（青点線枠）をクリックしてください。 2-N-1) Dharmacon本社Webサイト（
http://dharmacon.horizondiscovery.com）の各ページの下にあ るツールバーからCRISPR デザインツール（赤実線枠）にアクセス してください。
2-N-4) ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（Gene ID等）を入力し（赤実線枠）、生物種を選択します（緑 実線枠）。下図は、ヒトのSEC61B遺伝子に対してガイドRNAを設計する場合です。設定後、“Next”（青点線枠） をクリックしてください。 2-N-5) 転写産物を選択します（緑実線枠）（デフォルト設定では主要な転写産物が表示されます）。拡大（小） 鏡とカーソル（緑点線枠）を用いて、編集したいゲノム領域付近を表示させクリックします（例えば、青点線枠）。 表示される赤枠内のゲノム領域が下のパネルに表示されます。下図はヒトのSEC61B遺伝子内のエクソン1付 近が例として表示された状態です。ゲノム編集したい塩基配列付近（例えば、赤点線枠）をクリックします。 赤枠 36
2-N-6) 下図はヒトのSEC61B遺伝子について、エクソン1にコードされる開始コドンをコードする塩基配列をクリッ クした結果が表示された状態です。候補となるガイドRNAのターゲット配列が下のパネルに表示されます。希 望するガイドRNAのターゲット配列（例えば緑実線枠）をクリックして選択し、NEXT（青点線枠）をクリックします。
注）各ガイドRNAのターゲット配列には、数字（1、2、3…）と英字（High、Medium、Low）が記載されています。数字は、各ガイドRNAのターゲ ット配列について、タンパク質の機能的なノックアウト能力および特異性の両方を総合的に評価したランキングを示します。ここで、“1”が ランキングが一番高いことを示唆します。なお、英字（High, Medium, Low）は特異性を示します。
2-N-7) ガイドRNAのターゲット配列が表示されます（赤実線枠）。タブ（緑実線枠）をクリックすることで、各容量を 選択できます。希望の容量を選択後、ショッピングカートに入れる（青点線枠）をクリックすると製品がカートに入 りcrRNAをご注文いただけます（赤点線枠のタブからsgRNAをご注文いただけます）。引き続きmKate2蛍光レポ ーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーアームPCRプライマーを デザインするには、ガイドRNAのターゲット配列をメモ（あるいはコピー）した後、Edit-R HDR Donor Designer（緑点 線枠）をクリックしてください。
2-N-8) mKate2蛍光マーカー遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーア ームPCRプライマーを設計する場合は、Edit-R HDR Donor Designer - plasmid（赤実線枠）をクリックしてください。
2-N-9) ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（生物種、Gene ID、転写産物等）を、2-N-4)および2-N-5)と同 様に設定し（赤実線枠）、2-N-7)でメモ（あるいはコピー）したガイドRNAのターゲット配列を入力します（緑実線枠 ）。挿入する遺伝子を選択します（緑点線枠）。設定後、“Show Insert Region”（青点線枠）をクリックしてください。 以下は、mKate2蛍光レポーター遺伝子を挿入する場合の例です。
2-N-10) 赤色のスライド（赤実線枠）を、mKate2蛍光レポーター遺伝子を挿入したい箇所までドラッグして移動さ せます。下図にはヒトのSEC61B遺伝子のN末端にmKate2蛍光レポーター遺伝子を導入する場合を例として示し ました。開始コドン直後に読み枠をあわせて挿入しています。Get primers（青点線枠）をクリックします。
注）弊社のEdit-R HDR Plasmid Donor Kit システム（40ページ下）は、内在性遺伝子の転写産物上の開始および終止コドンを利用するように デザインされています（すなわち、蛍光レポータータンパク質は、ターゲット遺伝子のコードするタンパク質との融合タンパク質として発現さ せます）。そのため、カスタムホモロジーアームPCRプライマーは、内在性遺伝子の転写産物領域内に蛍光レポーター遺伝子挿入部位が 位置するように設計する必要があります。理想的には、蛍光レポーター遺伝子の挿入部位は、ターゲット遺伝子のN末端に挿入する場合 には開始コドンの直後、C末端に挿入するには終止コドンの直前に設定します。蛍光レポーターDNA配列の直前には4アミノ酸残基、直後に は3アミノ酸残基のリンカーが挿入されています。
2-N-11) mKate2蛍光レポーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジー アームPCRプライマーの候補が表示されます。青色でハイライトされている塩基は、ガイドRNAによる切断を回避 するために導入したサイレント変異です。希望のプライマーの□（例えば、赤実線枠）に✔を入れ、プライマーセッ トの名称を入力します（緑点線枠）。Edit-R HDR Plasmid Donor Kit – mKate2（本製品の概要については本ページ 下の説明をご覧ください）も同時に注文する場合は緑実線枠にチェックを入れてください。「Add to cart」ボタン（青 点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。
◆Edit-R HDR plasmid donor kit の概要 蛍光レポーター（EGFP、mKate2）遺伝子、あるいは、お客様 の希望するカスタム配列＊1をゲノムのターゲット部位に導 入するために用いるドナープラスミドを、迅速かつ高効率で 構築するために必要な試薬をキット化した製品です。ドナー プラスミドのバックボーン・蛍光レポーター配列（EGFPおよび mKate2キットの場合）・ドナープラスミド構築を確認するため に用いるコロニーPCR用プライマーを含みます。製品形態は 凍結乾燥品です。 ドナープラスミドの構築には、本キットの他に、カスタムホモ ロジーアームPCRプライマーや、DNA Assembly cloning Kit 等々が別途必要です。詳しくは本キットのテクニカルマニュ アルをご覧ください。 ＊1 カスタム配列はお客様自身で別途ご用意ください。 ◆カスタムホモロジーアームプライマーを用いた ゲノムDNAからのホモロジーアームのPCR増幅 40
O. cDNA/ORFクローン
2-O-1) cDNA/ORFクローンを検索いただくには、ページ上部にあるウィンドウ（赤実線枠）に、以下の項目 のいずれか一つを入力して検索ボタン（ ）をクリックしてください。
Ref Seq Accession (例：NM_007299) Gene ID (例：672)
Gene Symbol (例：BRCA1)
Catalog No. (例：MHS6278-211691078) 画面は「NM_007299」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する学術情報 が「遺伝子」のフィールドに表示されます。cDNA/ORFのリンク（青点線枠）から各製品リストのページに移 動してください。 2-O-2) 各種cDNA/ORFクローンの+（赤実線枠）をクリックすると、さらに詳細な製品リストが表示されます。 希望の製品を選択後、「ショッピングカートに入れる」ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入り ます。
P. 酵母クローン（ノックアウト株等）
2-P-1) 酵母クローンを検索いただくには、ページ上部にあるウィンドウ（赤実線枠）に、ORF名を入力して 検索ボタン（ ）をクリックしてください。 下の画面は「YAL067C」と入力して検索した結果が表示された状態です。製品ならびに関連する学術情 報が「遺伝子」のフィールドに表示されます。Non Mammalianのリンク（青点線枠）から各製品リストのペ ージに移動してください。 2-P-2) 各種酵母クローンの+（赤実線枠）をクリックすると、さらに詳細な製品リストが表示されます。希望の製品を 選択後、「ショッピングカートに入れる」ボタンをクリックすると製品がショッピングカートに入ります。 42Q. siRNA/microRNA/crRNAカスタムライブラリー
2-Q-1) siRNA/microRNA/crRNAカスタムライブラリーは、興味のある遺伝子を標的とするデザイン済みsiRNAや microRNA研究用試薬、crRNAをプレートに自在にレイアウトできる製品です。最少20ウェルからプレートにレイ アウトできます。小容量包装のため、コストを抑えたRNAi実験が可能です。 siRNA/microRNA/crRNAカスタムライブラリーをご注文いただくには、Dharmacon本社Webサイト （http://dharmacon.horizondiscovery.com）の各ページの下にあるツールバーからCherry-pickライブラリープレ ーター （赤実線枠）にアクセスしてください。2-Q-3) Product から製品のタイプを選択します。 2-Q-4) 検索キーワードの種類を選択します。 2-Q-5) 検索キーワードを入力します。検索方法は、以下の①あるいは②から選択ください。 ① 検索キーワードをウィンドウに入力します。 検索キーワードは1行に1つずつ入力します。 ② 検索キーワードを収めたファイルをアップロードする場合は、Upload Fileタブ（赤線実線枠）からファイ ルを選択してアップロードしてください。アップロードできるファイル形式はcsv形式です。 44
2-Q-6) タブ（赤実線枠）から生物種を選択し「Next」（青点線枠）をクリックします。
2-Q-7) 遺伝子を確認して□ （赤実線枠）に✔を入れた後、「Next」（青点線枠）をクリックします。
2-Q-8) ＋（赤実線枠）からご希望に製品タイプおよびフォーマットを選択後、「Next」（青点線枠）をクリックします。 以下に遺伝子あたり4つのindividual: siGENOME siRNA Reagentを選択した場合の例を示します。
2-Q-9) ご希望の容量（赤実線枠）等のライブラリー仕様を設定後、ショッピングカード（青点線枠）をクリックします 。
STEP3： カートページから注文完了まで
3-1) ページ右上の「ショッピングカート」（赤実線枠）をクリックすると、カートのページに移動します。このペー ジで注文した製品の製品番号、注文個数を確認できます。 - 製品の注文個数を変更したい場合には、直接数字を入力して、「ショッピングカートを更新する」ボタンを押 してください。製品を削除する場合は「カートを空にする」ボタンをクリックしてください。注文をこのまま進める には、「注文する」（青枠点線）をクリックしてください。 注1) 複数の製品をご注文いただく場合、一番納期の遅い製品にあわせてまとめ て出荷されます。早めに納品を希望される場合は、別々にご注文ください。 注2） 表示される納期に、日本への輸入、通関、輸送の時間が追加されます。実 際の予定納期は販売店様にご連絡ください。3-2) 製品を購入する代理店を選択後（赤実線枠）、Terms and conditionsに同意される場合はボックスにチェックを 入れ（緑実線枠）、「注文する」ボタン（青枠点線）をクリックすると注文が完了します。 ＊特に代理店を複数登録されているお客様は、代理店選択項目にご注意ください。 [email protected] Horizon大学 東京都XX区XXX A株式会社 東京営業所
3-3) 注文が完了すると以下のページが表示されます。お客さまには受注のお知らせメールを、販売店様には注文 受領のご案内メールが届きます。注文完了後、ご注文に関するご連絡・お問い合わせは、販売店様にお願いいた します。ご連絡・お問い合わせには受付番号が必要となりますので、表示された番号（赤実線枠）を記録していただ きますよう、よろしくお願いいたします。 ■
