2-N-3) Edit-R HDR Plasmid Donor Kit システム（40ページ）を用いた蛍光レポーター（EGFP、mKate2）遺伝子ある いはお客様の希望するカスタム配列導入用のガイドRNAを設計するには「Input gene ID or gene symbol:
precise cleavage for HDR」（赤実線枠）を選択して下さい。“Next”（青点線枠）をクリックしてください。
2-N-1) Dharmacon本社Webサイト（
http://dharmacon.horizondiscovery.com）の各ページの下にあ るツールバーからCRISPR デザインツール（赤実線枠）にアクセス してください。
2-N-2) 「CRISPR Design Tool –Get started now!」（赤実線枠）をクリックしてください。
2-N-4) ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（Gene ID等）を入力し（赤実線枠）、生物種を選択します（緑 実線枠）。下図は、ヒトのSEC61B遺伝子に対してガイドRNAを設計する場合です。設定後、“Next”（青点線枠）
をクリックしてください。
2-N-5) 転写産物を選択します（緑実線枠）（デフォルト設定では主要な転写産物が表示されます）。拡大（小）
鏡とカーソル（緑点線枠）を用いて、編集したいゲノム領域付近を表示させクリックします（例えば、青点線枠）。
表示される赤枠内のゲノム領域が下のパネルに表示されます。下図はヒトのSEC61B遺伝子内のエクソン1付 近が例として表示された状態です。ゲノム編集したい塩基配列付近（例えば、赤点線枠）をクリックします。
赤枠
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2-N-6) 下図はヒトのSEC61B遺伝子について、エクソン1にコードされる開始コドンをコードする塩基配列をクリッ クした結果が表示された状態です。候補となるガイドRNAのターゲット配列が下のパネルに表示されます。希 望するガイドRNAのターゲット配列（例えば緑実線枠）をクリックして選択し、NEXT（青点線枠）をクリックします。
注）各ガイドRNAのターゲット配列には、数字（1、2、3…）と英字（High、Medium、Low）が記載されています。数字は、各ガイドRNAのターゲ ット配列について、タンパク質の機能的なノックアウト能力および特異性の両方を総合的に評価したランキングを示します。ここで、“1”が ランキングが一番高いことを示唆します。なお、英字（High, Medium, Low）は特異性を示します。
2-N-7) ガイドRNAのターゲット配列が表示されます（赤実線枠）。タブ（緑実線枠）をクリックすることで、各容量を 選択できます。希望の容量を選択後、ショッピングカートに入れる（青点線枠）をクリックすると製品がカートに入
りcrRNAをご注文いただけます（赤点線枠のタブからsgRNAをご注文いただけます）。引き続きmKate2蛍光レポ
ーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーアームPCRプライマーを デザインするには、ガイドRNAのターゲット配列をメモ（あるいはコピー）した後、Edit-R HDR Donor Designer（緑点 線枠）をクリックしてください。
2-N-8) mKate2蛍光マーカー遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジーア
ームPCRプライマーを設計する場合は、Edit-R HDR Donor Designer - plasmid（赤実線枠）をクリックしてください。
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2-N-9) ガイドRNAを設計するターゲット遺伝子情報（生物種、Gene ID、転写産物等）を、2-N-4)および2-N-5)と同 様に設定し（赤実線枠）、2-N-7)でメモ（あるいはコピー）したガイドRNAのターゲット配列を入力します（緑実線枠
）。挿入する遺伝子を選択します（緑点線枠）。設定後、“Show Insert Region”（青点線枠）をクリックしてください。
以下は、mKate2蛍光レポーター遺伝子を挿入する場合の例です。
2-N-10) 赤色のスライド（赤実線枠）を、mKate2蛍光レポーター遺伝子を挿入したい箇所までドラッグして移動さ
せます。下図にはヒトのSEC61B遺伝子のN末端にmKate2蛍光レポーター遺伝子を導入する場合を例として示し ました。開始コドン直後に読み枠をあわせて挿入しています。Get primers（青点線枠）をクリックします。
注）弊社のEdit-R HDR Plasmid Donor Kit システム（40ページ下）は、内在性遺伝子の転写産物上の開始および終止コドンを利用するように デザインされています（すなわち、蛍光レポータータンパク質は、ターゲット遺伝子のコードするタンパク質との融合タンパク質として発現さ せます）。そのため、カスタムホモロジーアームPCRプライマーは、内在性遺伝子の転写産物領域内に蛍光レポーター遺伝子挿入部位が 位置するように設計する必要があります。理想的には、蛍光レポーター遺伝子の挿入部位は、ターゲット遺伝子のN末端に挿入する場合 には開始コドンの直後、C末端に挿入するには終止コドンの直前に設定します。蛍光レポーターDNA配列の直前には4アミノ酸残基、直後に は3アミノ酸残基のリンカーが挿入されています。
2-N-11) mKate2蛍光レポーター遺伝子を導入するために使用するドナープラスミド構築用のカスタムホモロジー アームPCRプライマーの候補が表示されます。青色でハイライトされている塩基は、ガイドRNAによる切断を回避 するために導入したサイレント変異です。希望のプライマーの□（例えば、赤実線枠）に✔を入れ、プライマーセッ トの名称を入力します（緑点線枠）。Edit-R HDR Plasmid Donor Kit –mKate2（本製品の概要については本ページ 下の説明をご覧ください）も同時に注文する場合は緑実線枠にチェックを入れてください。「Add to cart」ボタン（青 点線枠）をクリックすると製品がショッピングカートに入ります。
◆Edit-R HDR plasmid donor kit の概要 蛍光レポーター（EGFP、mKate2）遺伝子、あるいは、お客様
の希望するカスタム配列＊1をゲノムのターゲット部位に導 入するために用いるドナープラスミドを、迅速かつ高効率で 構築するために必要な試薬をキット化した製品です。ドナー プラスミドのバックボーン・蛍光レポーター配列（EGFPおよび mKate2キットの場合）・ドナープラスミド構築を確認するため に用いるコロニーPCR用プライマーを含みます。製品形態は 凍結乾燥品です。
ドナープラスミドの構築には、本キットの他に、カスタムホモ ロジーアームPCRプライマーや、DNA Assembly cloning Kit 等々が別途必要です。詳しくは本キットのテクニカルマニュ アルをご覧ください。
＊1 カスタム配列はお客様自身で別途ご用意ください。
◆カスタムホモロジーアームプライマーを用いた ゲノムDNAからのホモロジーアームのPCR増幅
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