特別講演 共生と寄生の狭間に生きるラン科植物 志村華子 ( 北海道大学大学院農学研究院 ) The unique interaction between orchid plants and their mycorrhizal fungi Hanako Shimura (Research Facult

特別講演

共生と寄生の狭間に生きるラン科植物

志村　華子(北海道大学大学院農学研究院)

The unique interaction between orchid plants and their mycorrhizal fungi

Hanako Shimura (Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University)

In the largest plant family, the orchid family, mycorrhizal association with soil-borne fungi is indispensable for their life. Orchid mycorrhizal fungi (OM fungi) that are compatible enough to form endomycorrhizal structure in orchid cells are exploited by host orchids through digestion of fungal mycelia to obtain nutritional compounds. Because orchid seeds are so small and lack the reserves for germination, they keep receiving nutrition through mycorrhizal association during germination and development of young seedlings. All orchid species must geminate with the help of their own fungal partners, and this spe- cifi c partnership between orchids and fungi has been acquired for a long evolutional history. We are studying about the interac- tion between orchids and OM fungi to explore the mechanisms underlying this unique interaction. In this presentation, I’d like to introduce our research about orchid-derived antifungal compounds against a compatible OM fungus and current progresses of the study on mycoviruses infected in the OM fungi.

　ラン科植物は単子葉類で最大の種数(2万種以上)を含み、被子植物の中で最も進化し繁栄した植物の一つ とされる。ランの多様性にはラン独特の様々な性質が関わっているが、ラン科植物のみにみられる特徴の一 つに、Orchid mycorrhizal fungi(OM菌)の感染によって発芽するという特殊な発芽システム“共生発芽”を行 うことが挙げられる。ランの種子は種皮と未発達の胚のみで構成され、普通の種子が持つ胚乳や子葉などの 貯蔵組織を持たない。土壌または樹上のOM菌が自然状態のラン種子に感染すると、ランの細胞内にペロ トンと呼ばれる菌糸塊が形成され、このペロトンを分解して得た養分を利用してランは発芽する。OM菌の 多くは担子菌であり、土壌腐生菌Rhizoctonia属菌や木本類の外生菌根菌種などがOM菌となりうる。ラン とOM菌との間には、多くの陸上植物とアーバスキュラー菌根菌でみられるような相利共生的な物質のや りとりはないとされ、菌からランへ一方的に炭水化物が移動することから、ランは菌に寄生しているともい われる。ランと菌との特異性、特殊な共生関係の成立に及ぼす要因について明らかになっていることは少な く、どうしてOM菌がランに感染するのか、ランがどのようにこの寄生的共生関係を築いてきたのは長い 間の謎となっている。我々は、ランとOM菌の共生関係に及ぼす要因について研究を行っており、これま でに、共生発芽能を持つOM菌の生育を特異的に抑制する物質をランが生産していることなどを見出して きた。また近年では、ランとOM菌との関係に及ぼす要因として、OM菌に感染するマイコウイルスに着目 している。マイコウイルスは菌に感染するウイルスであり、宿主菌の生育の低下、胞子形成の低下、病原力 の変質など様々に影響し、菌の諸形質に及ぼすゲノム以外の要因として注目されている。本発表では、ラン とOM菌の関係に関わるこれまでの研究や最近の研究についても紹介させて頂きたい。

学会賞

植物免疫応答を誘起する病原菌関連分子パターンに関する研究

蔡　晃植 (長浜バイオ大学)

Studies on pathogen-associated molecular patterns that induce plant immune responses

Koushoku Sai (Nagahama Institute of Bio-Science and Technology)

Flagellin from the rice avirulent N1141 strain of Acidovorax avenae , functions as a pathogen-associated molecular pattern (PAMP) and induces PAMP-triggered immunity (PTI) in rice, but fl agellin from rice virulent K1 strain dose not. PTI induction study using several fl agellin fragments showed that rice mainly recognizes fl agellin CD2-1 and the glycans in K1 fl agellin pre- vent CD2-1 recognition. Global gene expression profi le and transient expression study revealed that one gene, termed Flagel- lin-induced Receptor Kinase 2 ( FliRK2 ), is candidate gene encoding CD2-1receptor. Interestingly, cell extracts isolated from fl agellin-defi cient N1141 still induced PTI responses, suggesting that an additional PAMP distinct from fl agellin exists. Protein purifi cation and PTI induction assay showed that elongation factor Tu (EF-Tu), one of the most abundant bacterial proteins, act as a PAMP in rice and causes several PTI responses. In Brassicaceae species, the fi rst 18 amino acids of the N-terminus of EF-Tu, termed elf18, are fully active as inducers of PTI responses. By contrast, elf18 did not cause any immune responses in rice, whereas an EF-Tu middle region, termed EFa50, was fully active as a PAMP in rice. Gene expression profi le and transient expression showed that ERC1 is candidate receptor of EFa50. These results indicate that the perception systems recognizing diff erent regions of the same PAMP molecule such as fl agellin and EF-Tu is existed in plant.

　自発的移動手段を持たない植物は、自然界において多くの病原菌と接触の機会を持つが、ほとんどの場 合、植物が病原菌を認識して免疫反応を誘導することによって感染は成立しない。我々は、植物の免疫シス テムについて興味を持ち、病原菌認識や免疫反応誘導の分子機構について研究を行った。褐条病細菌 ( Acidovorax avenae ) のイネに対して非病原性 N1141株と病原性K1菌株を用いて解析を行った結果、イネは 非 病 原 性N1141菌 株 の 鞭 毛 タ ン パ ク 質 フ ラ ジ ェ リ ン を 病 原 体 関 連 分 子 パ タ ー ン (pathogen-associated molecular pattern：PAMP) として認識し、活性酸素の発生やカロースの沈着、防御関連遺伝子の発現誘導な どのPTI (PAMP-triggered immunity) と呼ばれる免疫反応を誘導するが、病原性K1菌株のフラジェリンは認 識出来ず、PTIが誘導されないことが明らかになった。また、このようなフラジェリンの認識特異性は、K1 菌株のフラジェリンに存在する糖鎖がイネによるフラジェリン認識部位であるC末端領域に存在する

CD2-1部位を覆い隠すことによることを初めて明らかにした。一方、シロイヌナズナやトマトはフラジェリ

ンのN末端領域に存在するfl g22部位をFLS2という受容体型キナーゼで認識していることが知られている。

そこで、イネのCD2-1受容体について解析したところ、FliRK2という新しい受容体キナーゼを同定した。

　一方、フラジェリン欠損N1141菌株の破砕液には新たなPAMPが存在することが示されたので、この分 子の同定を試みたところ、N1141菌株の翻訳伸長因子Elongation factor-Tu (EF-Tu) であることが示された。

興味深いことに、アブラナ科はEF-TuのN末端領域の18アミノ酸から構成されるelf18をEFRという受容 体型キナーゼによって認識することが知られている。そこで、イネにおける認識部位の同定を試みたとこ ろ、イネは中央領域50アミノ酸からなるEFa50をPAMPとして認識することが明らかになった。さらに、

EFa50処理により発現誘導される遺伝子のプロファイリングとEFa50認識能を持たないシロイヌナズナを用

いた一過的発現実験により、ERC1と名付けた新しい受容体型キナーゼがEFa50の受容体として機能するこ とを明らかにした。

　以上のことから、植物にはフラジェリンやEF-Tuという同一PAMP分子の異なる領域を認識するシステ ムが存在することが示され、動物のPAMP認識システムとは大きく異なることを明らかにすることができ た。

謝辞 : 本研究は多くの先生方のご指導ならびに、共に実験を行ってくれた学部学生、大学院学生、研究員 の努力により遂行されました。心より御礼申し上げます。

学会賞

植物の低温耐性獲得機構に関する研究

今井亮三 (農研機構・生物機能)

Studies on the mechanisms of cold adaptation and tolerance in plants

Ryozo Imai (NIAS)

Plants are living under a wide range of temperature fl uctuation. In agriculture, however, crop plants are often grown under unfavorable conditions. In such case like rice cultivation in boreal region, plants have to cope with cold stress. Mild chilling temperature that occurs during summer season causes male sterility at booting stage and signifi cant yield loss. We have identi- fi ed a mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway that is activated by moderate chilling stress in rice. A constitutively active form of OsMKK6, OsMKK6DD, expressed in transgenic rice confers chilling tolerance. We also found trehalose bio- synthesis genes are rapidly induced upon chilling stress. It was suggested that a decrease in trehalose 6-phosphate level, which causes reduction in photosynthetic activity, is an important early response of rice to chilling stress. On the other hand, overwin- tering plants acquire freezing tolerance and disease resistance through cold acclimation. In search for the genes that are induced during cold acclimation in wheat, we identifi ed cold shock domain proteins that share a domain with bacterial cold shock proteins. We showed that plant cold shock domain proteins function as an RNA chaperone to destabilize secondary structure and revealed functional conservation of cold shock domains in bacteria and higher plants. We also found that cold- inducible defensin and cystatin are involved in the mechanisms of cold-induced disease resistance.

　温帯や冷帯の植物は、広範な温度環境下で生活している。札幌であれば通年で+35°C～－15°Cと50°C近 くの温度差を経験するものもある。一方で、農業は必ずしも作物を最適な温度環境で栽培するわけではな く、冷帯でイネを栽培するとなると、低温ストレスを克服する必要が生じる。低温ストレスは生理学的には 0°Cを境にプラス域の低温とマイナス域の低温に区別して扱われる。それぞれに対する耐性は耐冷性と耐凍 性と呼ばれる。作物生産においてもイネ等の一年生の夏作物とコムギのように越冬を経るの冬作物があり、

それぞれ低温に対する適応が異なる。

　イネ等の夏作物は一般的に低温に弱く、夏季の穏やかな低温ストレスにより障害を受ける。特に、穂はら み期のイネが遭遇する穏やかな低温ストレスが、雄性不稔を誘発し、冷害の原因となることは広く知られ る。私達はイネにおいて、低温により活性化されるMitogen-activated protein kinase (MAPK) 経路の存在を初 めて示し、このカスケードを構成するMAPK (OsMPK3), MAPKK (OsMKK6) を同定した。また、OsMKK6 を恒常的に活性化させることでイネの耐冷性の向上に成功した。本経路は冷害の原因となる穏やかな低温

(12°C) ストレスに特異的なシグナル伝達に関与し、ROSによるレドックス制御を受けることを明らかにし

た。また、イネの低温ストレスに対する初期応答としてトレハロース生合成遺伝子が一過的に誘導されるこ とを見いだした。トレハロース前駆体のtrehalose 6Pレベルを下げ、光合成活性を低下させることが低温適 応として重要であることが示唆された。

　一方、越冬性植物は晩秋の低温を認識し、冬季環境に備えるために低温馴化を行う。この過程で、耐凍性 や耐病性等が獲得される。私達は、コムギの低温馴化の過程の解析から、細菌の低温生育に必須の低温 ショックタンパク質 (CSP) と構造的に相同なタンパク質を見出した。これらは大腸菌CSPと同様RNAの高 次構造を解消する活性を持つRNAシャペロン活性を示すことから、細菌と高等植物の低温適応において進 化的の保存された機構が存在することが明らかとなった。また、シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析か ら、CSPの1つ (AtCSP3) が耐凍性を正に制御することが証明された。一方同じCSPでも、AtCSP2は低温 馴化過程の負の調節因子として働くほか、花成、発芽を負に制御していた。コムギの低温馴化過程では、防 御関連タンパク質であるディフェンシン、マルチドメインシスタチンが誘導され、それらが積雪下で蔓延る 雪腐病菌への抗菌活性を示すことを明らかにした。低温認識により誘導される病害抵抗性という現象に着目 し、アポプラストに分泌される抗菌性タンパク質群の重要な働きを明らかにした。

謝辞 : これらの成果を得るために研究を共に進めてくれた研究室のメンバー、ご指導頂いた先生方、ご協 力頂いた共同研究者の皆様に深く感謝致します。

奨励賞

ヒメツリガネゴケの成長制御物質に関する生合成研究

宮崎　翔 (慶應義塾大学理工学部)

Studies on the biosynthesis of diterpenoid growth regulator in Physcomitrella patens

Sho Miyazaki (Faculty of Science and Technology, Keio University)

Gibberellins (GAs) are diterpenoid plant hormones involved in seed germination, stem elongation, leaf expansion, pollen maturation, and fl ower induction. The moss Physcomitrella patens does not respond to active GAs, and GAs have not been detected in the moss. However, P. patens has a partial GA biosynthetic pathway; an ent -kaurene synthase, PpCPS/KS catalyzes a cyclization reaction from geranylgeranyl diphosphate to ent -kaurene, an ent -kaurene oxidase catalyzed from the ent -kaurene to ent -kaurenoic acid (KA). We have demonstrated that Ppcps/ks mutant have defects in protonemal cell diff erentiation, which are restored by the application of KA but not by GAs. Using biochemical approaches, we found that a KA-derived diterpenoid functions as a potent regulator of protonemal cell diff erentiation in the moss. Bioassay-guided exploration with a Ppcps/ks mutant led to the detection of a bioactive metabolite from KA, and its structure was elucidated as ent -3β-hydroxy-KA. Tran- scriptome analysis identifi ed a gene involved in the oxidation of KA to ent -2α-hydroxy-KA, an inactive metabolite in protonemal cell diff erentiation. These results indicate that P. patens converts KA to an active form by 3-oxidation and to an inactive form by 2-oxidation, identifying a potential activation/inactivation system for GA biosynthesis in fl owering plants.

　ジベレリン(GA)は種子発芽や草丈の制御を担うジテルペノイド化合物である。原始陸上植物に近縁とさ れるコケ植物の一種ヒメツリガネゴケ( Physcomitrella patens ) からGAは単離されない。しかし興味深いこと に、GA生合成に必要なent -カウレン合成酵素 (PpCPS/KS) およびent -カウレン酸化酵素が機能しており、顕 花植物と同様にent -カウレン酸(KA)までの代謝過程が認められた。KA以降のGA生合成酵素は存在しな

いが、 Ppcps/ks 欠損変異体で原糸体の細胞分化過程に抑制の傾向を認められ、KAの投与でこの異常形質が

回復したのに対し、GA投与では回復しなかった。これらのことから、ヒメツリガネゴケ原糸体ではGA生 合成が中断される代わりに、KAを中間体に用いて原糸体の分化誘導を制御するジテルペノイド化合物を生 産する可能性が強く示唆された。そこで、KAの投与でPpcps/ks 欠損変異体の異常形質が回復する応答系を 指標に、KA代謝産物を追跡した。当該植物由来のメタノール抽出物を逆相HPLCにより展開し、KAより 高極性の代謝物を含む活性画分を検出した。KAやKA類縁体を高感度に検出可能なLC-MS/MS分析系を構 築し詳細な分析を進めたところ、活性画分に含まれるKA代謝物は3位水酸化KAであることが示された。

酵素合成により調製した安定同位体標識KAを用いた投与試験から、3位水酸化KAを植物内在性物質とし て同定した。3位水酸化KAはKAより強い原糸体分化活性を示し、3位水酸化KAから活性型代謝産物が 生産されないことから、KAの3位水酸化は生合成経路上の最後の活性化反応であることが示された。次に、

生合成酵素遺伝子の探索を目的としてトランスクリプトーム解析を行い、候補酵素遺伝子に関して組換え酵 素を調製して酵素反応に供したところ、一つの酵素がKAを基質として変換反応を示した。この変換物を酵 素合成し、各種NMR測定から2位水酸化KAであると構造決定した。さらに植物体内での生理機能を調べ るためこのKA2位水酸化酵素欠損変異体を作出したところ、野生株より強い原糸体の分化活性が認められ た。2位水酸化KAを植物内からも検出し、2位水酸化KAが原糸体分化活性を示さない結果と併せると、

KA代謝経路におけるKAの2位水酸化反応は不活性化反応であることが示された。

　以上の結果から、コケ植物はGAを生合成しない代わりに3位水酸化KAを成長制御物質として利用して いることを見出し、さらに生合成経路における活性制御機構は顕花植物のGA生合成経路でも見られる3位 水酸化による活性化、2位水酸化による不活性化であることを明らかとした。今後は、受容機構の解明、さ らに生合成経路や同定した物質の植物界における保存性を明らかにすることで、分子と植物の共進化に関す る重要な知見が得られると期待している。

　これらの成果はご指導頂きました先生方、ならびに研究室メンバーと共同研究者のご協力のもと遂行され ました。心より感謝申し上げます。

1. ストリゴラクトン生合成に関与するソルガム LGS1 酵素の機能解析

○依田彬義 ¹、森　愛美 ²、謝　肖男 ^1,3、米山香織 ⁴、秋山康紀 ²、米山弘一 ³、野村崇人 ^1,3 ( ¹宇都宮大院・農、 ²大 阪府立大院・生命環境、 ³宇都宮大・バイオ、 ⁴愛媛大・農)

Biochemical characterization of sorghum LGS1 enzyme involved in strigolactone biosynthesis

Akiyoshi Yoda ¹ , Narumi Mori ² , Xiaonan Xie ^1,3 , Kaori Yoneyama ⁴ , Kohki Akiyama ² , Koichi Yoneyama ³ , Takahito Nomura ^1,3 ( ¹ Grad. Sch. of Agri., Utsunomiya Univ., ² Grad. Sch. of Life & Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., ³ Ctr. for Biosci. Res. & Educ., Utsunomiya Univ., ⁴ Fuc. of Agri., Ehime Univ.)

Strigolactones (SLs) are multifunctional phytohormones that stimulate seed germination in root parasitic plants, induce hyphal branching in benefi cial arbuscular mycorrhizal fungi and inhibit shoot branching in host plants. Mutation in the LOW GERMINATION STIMULANT 1 ( LGS1 ) gene alters the dominant SL to orobanchol from 5-deoxystrigol in sorghum and result in Striga resistance (Gobena et al., PNAS, 2017). LGS1 is thought to be involved in the formation of strigol-type SLs, but its enzymatic function has not been demonstrated. In this study, we investigate the enzymatic function of LGS1 in vitro.

【目的】

　ストリゴラクトン (SL) は植物の枝分かれを制御する植物ホルモンであり、根圏においてアーバスキュラー 菌根菌の菌糸分岐誘導やストライガなどの根寄生植物の種子発芽刺激作用を示す。植物が生産・分泌する典 型的な4環性SLはC環の立体配置の違いによりα位のオロバンコール型とβ位のストリゴール型の二つに 分けることができる。ソルガムはアフリカ諸国において主要なイネ科穀物だが、ストライガの主要な宿主で あるため甚大な被害を受けている。昨年、ストライガ耐性品種として育種により作出されたソルガムから、

そ の 耐 性 を 付 与 し た 原 因 遺 伝 子LOW GERMINATION STIMULANT 1 ( LGS1 ) が 同 定 さ れ た (Gobena et al.,

PNAS, 2017)。興味深いことに、正常なソルガムが生産する主要なSLは5-デオキシストリゴールであるが、

lgs1 欠損変異体ではオロバンコールに替わっていた。したがって、 LGS1 遺伝子は立体特異的なSLの環化

に関わると考えられる。ストライガ種子に対する発芽刺激活性は5-デオキシストリゴールの方がオロバン コールよりも高いことが、ストライガ耐性になった理由と考えられている。 LGS1 遺伝子がコードするタン パク質は硫酸基転移酵素に類似しているが、SL生合成におけるLGS1の酵素機能は解明されていない。本 研究では、LGS1の酵素機能を明らかにするため、LGS1タンパク質を用いて代謝実験を行うことにした。

【方法・結果】

　まず、ソルガムのlgs1 変異体及び正常種の根浸出液に含まれるSL関連物質をLC-MS/MSを用いて分析

し、 lgs1 変異体で蓄積している可能性があるLGS1酵素の基質の探索を行った。その結果、 lgs1 変異体の根

浸出液にのみに検出されるSL関連物質を発見した。次に、ソルガムからLGS1 cDNAをクローニングし、

大腸菌を用いてタンパク質の発現を行った。LGS1タンパク質は可溶性酵素と考えられるが、可溶化が期待 される既存のベクターや低温誘導などの方法では可溶性画分における目的タンパク質の発現はできなかっ た。そこで、ポジティブコントロールとして大量な発現が確認された大腸菌由来の可溶性タンパク質Xを 可溶化タグとした発現ベクターを新たに構築した。その結果、タンパク質Xとの融合タンパク質として LGS1を可溶性画分に発現させることに成功した。現在、得られたLGS1タンパク質を用いてlgs1 変異体で 検出されたSL関連物質の代謝実験を行なっている。

2. ストリゴラクトン生合成酵素 LBO の機能解析

○米山香織 ^1,2、秋山康紀 ³、高島　岬 ³、依田彬義 ⁴、謝　肖男 ⁴、米山弘一 ⁴、野村崇人 ⁴ ( ¹愛媛大・農、 ²さきが け、 ³大阪府立大院・生命環境、 ⁴宇都宮大・バイオ)

Biochemical characterization of LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE involved in strigolactone biosynthesis

Kaori Yoneyama ^1,2 , Kohki Akiyama ³ , Misaki Takashima ³ , Akiyoshi Yoda ⁴ , Xionan Xie ⁴ , Koichi Yoneyama ⁴ , Takahito Nomura ⁴ ( ¹ Grad. School of Agric., Ehime Univ., ² PRESTO, ³ Sch. of Life & Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., ⁴ Ctr. for Biosi. Res. & Educ., Utsunomiya Univ.)

Strigolactones (SLs) function as a plant hormone inhibiting shoot branching. We reported that a 2-oxogulutarate-dependent dioxygenase LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE (LBO) converts MeCLA into 1’-HO-MeCLA. However, the shoot branching inhibitory activity of 1’-HO-MeCLA remains unclear due to its instability. We also found that 4-HO-MeCLA and 16-HO-MeCLA accumulate in Arabidopsis lbo mutants, suggesting these HO-MeCLAs are potential substrate for LBO. In this study, the new function of LBO enzyme for SL biosynthesis will be reported.

【目的】

　ストリゴラクトン (SL) は、植物体内では、地上部枝分かれを抑制する植物ホルモンとして機能する。し かし真の地上部枝分かれ抑制活性本体は明らかになっていない。シロイヌナズナにおいて、SL生合成遺伝 子と共発現している遺伝子を探索し、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードしているLAT- ERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE ( LBO ) が、新奇SL生合成関連遺伝子として単離された。これまでに、

LBOは、カーラクトン酸メチル(MeCLA)から、カーラクトン酸ヒドロキシメチルエステル(1’-HO-MeCLA) への変換を触媒することを報告している。しかしながら、1’-HO-MeCLAは、化学的に不安定であり合成が 困難であることから、その地上部枝分かれ抑制活性については不明なままである。一方、シロイヌナズナの

lbo 変異体では、MeCLAに加えて、4-HO-MeCLAおよび16-HO-MeCLAが蓄積していることが分かった。

本研究では、新たなLBOの酵素機能を明らかにするため、大腸菌発現系を用いたLBOタンパク質の代謝実 験を行った。

【方法および結果】

　MeCLAを基質にした場合、[MeCLA + 16] Daである1’-HO-MeCLAだけでなく、[MeCLA + 30] Daおよび

[MeCLA + 32] Daに相当する化合物が2-オキソグルタル酸依存的に生成した。また、4-HO-MeCLAおよび

16-HO-MeCLAが2-オキソグルタル酸依存的に消費された。現在、代謝実験を繰り返し、代謝産物の構造決

定を行っている。

3. ストリゴラクトン生合成のフィードバック制御

米山香織 ^1,2、謝　肖男 ³、 ^○米山弘一 ³、野村崇人 ³ ( ¹愛媛大・農、 ²さきがけ、 ³宇都宮大・バイオ)

Feedback-regulation of strigolactone biosynthesis

Kaori Yoneyama ^1,2 , Xionan Xie ³ , Koichi Yoneyama ³ , Takahito Nomura ³ ( ¹ Grad. School of Agric., Ehime Univ.,

2 PRESTO, ³ Ctr. for Biosi. Res. & Educ., Utsunomiya Univ.)

In the present study, eff ects of plant number on strigolactone (SL) production and exudation were examined in rice WT, d14 mutant and d3 mutant in order to clarify if SL signal transduction/receptor D14 and D3 are related with the feedback-regulation of SL biosynthesis.

【目的】

　昨年度の本大会では、異なる化学構造のストリゴラクトン(SL)を生産・分泌する植物同士を混植すると、

同じ植物同士の場合と比較して、SLの分泌が促進されることを報告した。本研究では、この混植によるSL 分泌促進には、SL生合成のフィードバック制御が関与しているのか、フィードバック制御にはSL受容・

シグナル伝達遺伝子が関与しているのかを明らかにするため、イネの野生型および受容・シグナル伝達変異 体を用いて培養個体数がSL分泌に与える影響を調べた。

【方法および結果】

　イネ (Nipponbare、 d3 変異体、 d14 変異体) をリン欠乏条件下で水耕栽培し、それぞれを1個体、2個体、

3個体にわけて、24時間後に水耕液を回収した。酢酸エチルで分配後、酢酸エチル可溶中性区を脱水・濃縮 し、LC-MS/MS (MRM法)によりSLの定量を行った。

　野生型のNipponbareでは、培養個体数が増加すると、1個体当たりのSL分泌が有意に低下した。一方、

d3 変異体およびd14 変異体では、培養個体数はSL分泌に影響を与えなかった。すなわち、SLのフィード

バック制御には、SL受容・シグナル伝達遺伝子であるD14およびD3が関与している可能性が示唆された。

4. ヒマワリにおける ε- カーラクトンのヘリオラクトンへの変換

○留河愛梨 ¹、謝　肖男 ²、米山弘一 ²、秋山康紀 ¹ ( ¹阪府大院・生命環境、 ²宇都宮大・バイオ)

Conversion of ε-carlactone to heliolactone in sunfl ower

Airi Tomekawa ¹ , Xiaonan Xie ² , Koichi Yoneyama ² , Kohki Akiyama ¹ ( ¹ Grad. Sch. Life & Environ. Sci., Osaka Pref.

Univ., ² Ctr. for Biosci. Res. & Educ., Utsunomiya Univ.)

Strigolactones (SLs) are apocarotenoids of plant origin that act as rhizosphere signals for arbuscular mycorrhizal fungi and root parasitic plants. They also play important roles as phytohormones that regulate shoot branching. SLs are biosynthesized from all- trans -β-carotene via carlactone (CL). Heliolactone produced by sunfl ower ( Helianthus annuus L.) possesses a ε-ring in the A-ring part. In this study, in order to test the hypothesis that heliolactone is biosynthesized from carotenoids possessing ε-rings ( e.g. all- trans -α-carotene) via ε-CL, we prepared stable isotope-labeled ε-CL by chemical synthesis and examined its conversion to heliolactone in planta .

【目的】

　ストリゴラクトン(strigolactone, SL) は植物が生産するアポカロテノイドであり、根寄生植物やAM菌に 対する根圏情報物質、植物地上部の枝分かれを抑制する内生ホルモンとして働く。SLはall- trans -β-carotene から生産されるカーラクトン (carlactone, CL)を中間体として生合成される。ヒマワリが生産するSLである ヘリオラクトン (heliolactone)は、A環にε環を持つ天然SLである。β環を有するCLがヘリオラクトンの 生 合 成 中 間 体 で あ る な ら ば、3位 の 酸 化 に 加 え て 二 重 結 合 の 転 位 が 必 要 と な る。 こ れ ま で に イ ネ の DWARF27がall- trans -α-caroteneのε環側の9'-10'位の異性化を触媒すること、シロイヌナズナのCCD7がε

環を持つ9- cis -luteinの酸化的開裂を触媒することが報告されている。これらのことから、ヘリオラクトン

がall- trans -α-caroteneなどのε環を持つカロテノイドを出発基質として生合成される可能性が示唆されてお

り、その中間体としてε環を持つε-CLが候補として挙げられている。最近、ヒマワリ根への投与実験によ り、CLからヘリオラクトンが生成することが報告されたが、ε-CLを中間体とする生合成経路についてはこ れまでに調べられていない。そこで本研究では、安定同位体標識ε-CLの合成法を新規に開発し、ヒマワリ 根による変換産物の解析を行うことにより、ヘリオラクトンがε-CLを中間体として生合成される可能性を 検証した。

【方法・結果】

　2-Methyl-3-buten-2-olを出発物質、CD 3 MgIを標識試薬として、11段階の反応を経て[18-D 3 ]-ε-CLを合成 した。また、2-methylcyclohexanoneを出発物質、CD 3 Iを標識試薬として[1-CD 3 ]-CLを合成した。現在、こ れら重水素標識ε-CLおよびCLのヒマワリ根への投与実験を行っている。

5. ササゲとトマトにおけるオロバンコール合成酵素の探索

○濱名実咲 ¹、森　采美 ¹、若林孝俊 ^1,2、水谷正治 ¹、杉本幸裕 ^1,2 ( ¹神戸大院・農・生命機能科学、 ² JST/JICA SATREPS)

Screening of orobanchol synthase in cowpea and tomato

Misaki Hamana ¹ , Ayami Mori ¹ , Takatoshi Wakabayashi ^1,2 , Masaharu Mizutani ¹ , Yukihiro Sugimoto ^1,2 ( ¹ Grad. School of Agric. Sci., Kobe Univ., ² JST/JICA SATREPS)

Strigolactones (SLs) are plant hormones that regulate plant architecture. It has been reported that all-trans-β-carotene is converted into carlactonoic acid (CLA) by sequential reactions of D27, CCD7, CCD8 and CYP711A enzymes. However, con- version of CLA to SLs remains to be elucidated in detail. We reported that CLA was converted to orobanchol in aquacultures of cowpea ( Vigna unguiculata ) without passing through 4-deoxyorobanchol (4-DO). In this study, we conducted RNA-seq analysis of cowpea plants grown in +/－ P medium to screen the candidate genes involved in the conversion of CLA to oroban- chol.

【目的】

　ストリゴラクトンは植物の枝分かれを抑制する植物ホルモンであり、アーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐 や根寄生植物の発芽を誘導する物質としても知られている。イネでは、CYP711AによりCLから4-deoxyor-

obanchol (4-DO)を経てオロバンコールが生合成されることが報告されている。一方で我々は、ササゲの根

滲出液から4-DOが検出されないこと、ササゲに投与したcarlactonoic acid (CLA)はオロバンコールへ変換さ れるが4-DOへの変換は認められないこと、投与した4-DOはオロバンコールへ変換されないことを報告し た(Iseki et al. , J Exp Bot., 2018)。以上よりササゲは4-DOを経由せずにCLAからオロバンコールを生合成す ると推定された。本研究では、ササゲおよび形質転換系が確立されているトマトにおけるオロバンコール合 成酵素を探索することを目的とした。

【方法および結果】

　ササゲを通常条件およびリン欠乏条件で栽培した。それぞれのササゲ根からRNAを抽出し、次世代 RNA-seq解析を行った。既知のSL生合成遺伝子 ( D27 、 CCD7 、 CCD8 、 CYP711A ) の発現量はリン欠乏条件 において増加した。次に、既知SL生合成遺伝子と同調して発現量が変化する機能未知の遺伝子を候補遺伝 子として選抜した。これらを大腸菌で発現させて組換え酵素を作製し、CLAを基質に酵素反応を行った。

LC-MS分析に供した結果、候補タンパク質の一つによってCLAが変換されオロバンコール標品と一致する

生成物ピークが得られた。続いて、形質転換系が確立されているトマトのホモログの機能を解析したとこ

ろ、 in vitro においてササゲと同様の活性が認められた。現在、トマトを用いてin vivo における同酵素の機

能解析を進めている。

6. 基部植物における KAI2 の構造と機能

○瀬戸義哉 ^1,2、水野陽平 ³、楢本悟史 ³、経塚淳子 ³、Joseph Noel ² ( ¹明大農、 ²ソーク研究所、 ³東北大院生命科 学)

Structure-function analysis of the KAI2 pathway in basal plant species

Yoshiya Seto ^1,2 , Yohei Mizuno ³ , Satoshi Naramoto ³ , Junko Kyozuka ³ , Noel Joseph ² ( ¹ Sch. Agr., Meiji Univ., ² The SALK Institute for biological studies, ³ Grad. Sch. of Life Sci., Tohoku University)

Strigolactones are plant hormones that regulate shoot branching and diverse aspect of plant growth. DWARF14 (D14), an Α/Β-hydrolase, was characterized to be a receptor of SLs. A paralog of D14, which called KARRIKIN INSENSITIVE2 (KAI2) in Arabidopsis, was characterized from an insensitive mutant to a smoke-derived germination inducer, karrikin (KAR). Arabi- dopsis kai2 knockout exhibits hypocotyl elongation and delayed germination phenotype, and it has been suggested that there is an unknown endogenous ligand working through the KAI2 pathway. Intriguingly, a phylogenetic analysis of D14 and KAI2 protein families have demonstrated that D14 emerged from seed plant species whereas KAI2 is conserved in more basal plant species, such as lycophyte, liverwort, moss, and some green algae as well.

In order to understand the fundamental function of the KAI2 pathway in plant kingdom, we performed biochemical and structural analysis of KAI2 from the model liverwort, Marchantia polymorpha , and a green algae, Klebsormidium flac- cidum . We successfully solved the crystal structures of two M. polymorpha KAI2s (MpKAI2a and MpKAI2b), and a K. fl ac- cidum KAI2 (KfKAI2), and found that MpKAI2a has a larger ligand binding site than other KAI2s including Arabidopsis KAI2. We are also presenting about the knockout mutant phenotype of MpKAI2a and MpKAI2b .

　ストリゴラクトン (SL) は、根圏における化学シグナルとして機能すると同時に、植物の枝分かれを制御 するホルモンとしても機能するテルペノイドラクトンに分類される化合物である。SLがホルモンとして機 能 す る 際 の 受 容 体 タ ン パ ク と し て、 イ ネ のSL非 感 受 性 変 異 体 か ら 同 定 さ れ た 加 水 分 解 酵 素 で あ る

DWARF14が見出され、その機能に関して多くの研究がなされてきた。一方、 D14 のパラログとして見出さ

れたD14LIKE は、シロイヌナズナにおいては煙由来の発芽促進物質であるカリキンに対する非感受性変異

体の原因遺伝子として同定され、 KARRIKIN INTSENSITIVE2 ( KAI2 ) と呼ばれている。シロイヌナズナのkai2 変異体は、胚軸の徒長や発芽の遅延などの表現型が見られ、カリキンに取って代わる内生の新規ホルモン分 子の存在が示唆されているものの、現在までにそのような分子は同定されていない。興味深いことに、植物 界におけるD14およびKAI2の分布を調べてみると、D14は種子植物より高等な植物のみで保存されている のに対してKAI2は蘚苔類やシャジクモのような基部植物においても保存されていることが報告されてい る。このように、KAI2経路の植物界における機能は十分に解明されていない。本研究では、KAI2に関し て、特にその根源的な機能を明らかにすることを目的に、基部植物であるゼニゴケ、またはシャジクモ由来

のD14L/KAI2の機能解析を行った。

　ゼニゴケには本ファミリー遺伝子が2コピー存在しており ( MpKAI2a , MpKAI2b )、CRISPR/CAS9を利用し て、各遺伝子のノックアウト株を作成し、その表現型を観察した。その結果mpKAI2a ノックアウト株は顕 著な生育異常を示したのに対し、 mpKAI2b 変異体においては明確な表現型は見られなかった。並行して、

これら二つのMpKAI2の結晶構造解析を行った結果、変異体で顕著な表現型がみられたMpKAI2aのリガン ド結合サイトがMpKAI2bよりも大きいことが明らかとなった。シャジクモの一種であるKlebsormidium

fl accidum 由来のKAI2についても結晶構造解析を行っており、これら基部植物由来KAI2の構造とシロイヌ

ナズナKAI2の構造の比較などについても発表する予定である。

7. 苔類における SL 生合成経路

○島崎翔太 ¹、水野陽平 ¹、中川知己 ²、小松愛乃 ¹、増口　潔 ¹、山口信次郎 ¹、経塚淳子 ¹ ( ¹東北大院生命科学、

2基礎生物学研究所)

SL biosynthesis and perception in basal land plants

Shota Shimazaki ¹ , Yohei Mizuno ¹ , Tomomi Nakagawa ² , Aino komatsu ¹ , Kiyoshi Mashiguchi ¹ , Shinjiro Yamaguchi ¹ , Junko Kyozuka ¹ ( ¹ Grad. Sch. of Life Sci., ² National Institute for Basic Biology)

In land plants, strigolactone (SLs) biosynthesis starts from all- trans - β -carotene which is catalyzed by D27, CCD7 and CCD8, leading to the formation of carlactone (CL). DWARF14 (D14) is known as a receptor of SL. Besides D14, seed plants con- tain KAI2, the paralog of D14. On the other hand, basal land plants contain only KAI2 family genes. In spite of the absence of D14, it was reported that basal plants, such as bryophytes and charophytes, produce SLs. An interesting possibility sug- gested by these information is that SLs are perceived by KAI2 in basal plants. We aim to elucidate the origin and evolution of SL biosynthesis and perception. As a fi rst step to our goal, we analyzed the SL biosynthesis pathway in basal land plants, Marchantia polymorpha ( M. polymorpha ) and Marchantia paleacea ( M. paleacea ) in this study.

It was reported that D27 and CCD7 genes but not CCD8 gene exist in M. polymorpha genome. In M. paleacea , we identi- fi ed two genes belonging to CCD8 family ( MpaCCD8a/MpaCCD8b ) from EST analysis. MpaCCD8a and MpaCCD8b contain amino acids essential to confer the substrate specifi city. We detected CL-like compound in the extract from M. paleacea but not in the extract from M. polymorpha . This suggests that M. paleacea may produce SLs. We introduced OsD10 gene of rice encoding CCD8 to M. polymorpha . Interestingly, CL was identifi ed in the transgenic lines, indicating that the SL biosynthesis pathway is functional until CCD7 in M. polymorpha .

　ストリゴラクトン (SL) は、植物の地上部の枝分かれを抑制するホルモンである。種子植物におけるSLの 生合成経路では、出発物質であるall- trans-β -カロテンが、異性化酵素であるD27、カロテノイド酸化開裂 酵素であるCCD7、CCD8により生合成中間体であるカーラクトン (CL) へと代謝される。その後、シトク ロムP450酸素添加酵素であるCYP711AサブファミリーによりSLへと変換される。合成されたSLは

DWARF14 (D14) に受容される。種子植物はD14ファミリーに加えて、そのパラログであるKAI2ファミリー

をもつが、基部の植物はKAI2ファミリーのみをもつことから、KAI2がD14の祖先型であることが示唆さ れている。また、これまで、シャジクモや蘚苔類においてもSLが作られている報告がなされているが、そ の受容体については明らかとなっていない。これら基部植物がD14ファミリーをもたないことから、SLが KAI2ファミリーにより受容される可能性も考えられる。実際、根寄生植物ではKAI2がSLを受容している ことから、受容体とリガンドはある程度フレキシブルな関係にあると推測される。

　近年、ゼニゴケ ( Marchantia polymorpha ) はゲノム配列が決定され、基部陸上植物のモデルとして研究に用 いられている。ゼニゴケには、フタバネゼニゴケ ( Marchantia paleacea )、およびMarchantia polymorpha ssp.

montivagans の近縁種が存在する。そこで、これらゼニゴケ類を用いてSLの生合成、受容経路の解明を目

的とした研究を開始した。これまでに、ゼニゴケにはD27やCCD7に相当する遺伝子はあるが、CCD8は 存在しないことが明らかになっている。本研究では、ゼニゴケとその近縁種であるフタバネゼニゴケにおけ るSL生合成経路の解析を行った。

　EST解析により、ゼニゴケとは異なり、フタバネゼニゴケにはCCD8ファミリーに属する2つの遺伝子 が存在することが示された ( MpaCCD8a/MpaCCD8b )。この両遺伝子がコードするアミノ酸には基質の認識に 必要な残基が保存されており、さらに系統樹解析により種子植物の基部に位置することが明らかになった。

そこで、これらCCD8 遺伝子の機能を明らかにするために、ゼニゴケとフタバネゼニゴケにおいてCCD8 による代謝産物であるCLの検出を試みた。その結果、ゼニゴケにおいてCLは検出されなかったのに対し、

フタバネゼニゴケではCLの標品と同じリテンションにCL様のピークを検出した。このことから、フタバ ネゼニゴケではSLが合成されている可能性が示唆された。また、ゼニゴケにおいて、イネのCCD8 である

OsD10 を過剰発現させた個体ではCLが検出された。したがってゼニゴケにおいてもCCD7までは生合成経

路が機能していることが判明した。

　今後、フタバネゼニゴケではSL活性をもつ物質が産生されているのかを明らかにする。さらに、その下 流産物がKAI2により受容されている可能性の検証、生物学的機能を研究することで、KAI2/D14経路の進 化的な起源の解明をめざす。

8. 植物における内生ヒドロキシカーラクトン酸メチルの同定

○高島　岬 ¹、米山香織 ²、謝　肖男 ³、野村崇人 ³、米山弘一 ^1,3、秋山康紀 ⁴ ( ¹阪府大院・生命環境、 ²愛媛大・

農、 ³宇都宮大・バイオ、 ⁴阪府大院・生命環境)

Identifi cation of endogenous methyl hydroxycarlactonoates in plants

Misaki Takashima ¹ , Kaori Yoneyama ² , Xiaonan Xie ³ , Takahito Nomura ³ , Koichi Yoneyama ^1,3 , Kohki Akiyama ⁴ ( ¹ Grad.

Sch. Life & Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., ² Fac. Agric., Ehime Univ., ³ Ctr. for Biosci. Res. & Educ., Utsunomiya Univ., ⁴ Grad. Sch. Life & Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Strigolactones (SLs) or their further metabolites were identifi ed as a novel class of terpenoid plant hormones that regulate shoot branching in 2008. Reciprocal grafting experiments with wild type and mutants of pea and Arabidopsis indicated that the shoot branching hormone is mainly produced in roots and transported to shoots via the xylem.

Despite extensive studies, the active form of SLs has not unequivocally been identifi ed. Several lines of evidence strongly suggest that carlactone (CL) is a mobile biosynthetic intermediate for the shoot branching hormone, and that LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE (LBO), a 2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent dioxygenase, acting in the fi nal stages of SL biosynthesis is involved in the production of the active hormone. We previously reported that putative methyl 4- and 16-hydroxycarlactonoates (4- and 16-HO-MeCLAs) were accumulated in the basal parts of shoots of Arabidopsis lbo and d14 mutants. In this study, we chemically synthesized 4- and 16-HO-MeCLAs to identify endogenous HO-MeCLAs in Arabidop- sis , rice ( Oryza sativa ), and Lotus japonicus .

【目的】

　ストリゴラクトン (strigolactone, SL) は植物の枝分かれを抑制する内生ホルモンである。SLは主に根で生 産され、地上部に移行して枝分かれ抑制ホルモンとして働くと考えられている。しかし、活性型ホルモンと して働くSLの構造はこれまでに明らかにされていない。SLには3環性ラクトン (ABC環) とブテノライド (D環) がエノールエーテル結合した4環性構造を持つ典型的SLと、カーラクトン (carlactone, CL) のように ABC環のうちいずれかの環を欠いた構造を持つ非典型的SLの2種類が存在する。これまでに、シロイズナ ズナの道管液から典型的SLであるオロバンコールが検出されたという報告があるが、他の研究グループに よる確認はなされていない。一方、CLは道管液で検出されることから、CLが根から地上部に移行可能な 中間体である可能性が強く示唆されている。CLはシトクロームP450であるMAX1によってカーラクトン 酸 (carlactonoic acid, CLA) に酸化された後、メチル基転移酵素によりカーラクトン酸メチル (methyl carlac-

tonoate, MeCLA) に変換される。この下流に存在するSL生合成酵素であるLBO は2-オキソグルタル酸依存

性オキシゲナーゼであり、活性型ホルモンの生成に関与することが示唆されている。昨年度の本大会におい て、我々はLBOの基質候補となるSLを探索し、シロイヌナズナのlbo やd14 変異体の地上部基部において

4-および16-ヒドロキシカーラクトン酸メチル (HO-MeCLA) と推定されるSLが蓄積していることを見出し

た。本研究では、4-および16-HO-MeCLAの化学合成法を確立し、それらSLのシロイヌナズナ、イネおよ びミヤコグサでの存在について検証した。

【方法・結果】

　2,6-ジメチルシクロヘキサノンを出発物質として、TBS保護ヒドロキシC13カルボン酸メチルのフォルミ ル化－D環カップリング、最後に脱保護を行う従来法 (Abe et al. PNAS (2014)) により16-HO-MeCLAを合 成できた。また、最近発表されたDieckmannらのStilleカップリングを用いる方法 ( J. Org. Chem (2018))を 適用することによっても16-HO-MeCLAを合成できた。4-HO-MeCLAは従来法では反応基質の分解により 合成できなかったが、Dieckmannらの方法では合成可能であった。シロイヌナズナlbo 変異体の地上部基部 抽出物中の推定16-HO-MeCLAについて化学合成標品とLC-MS/MS分析により比較を行ったところ両者は 一致した。現在、イネおよびミヤコグサのSLシグナル伝達変異体における4-および16-OH MeCLAの存在 について分析を進めている。

9. ミヤコグサの 5DS および lotuslactone 生合成における MAX1 下流経路 の解析

○森　愛美 ¹、謝　肖男 ²、米山香織 ³、野村崇人 ²、米山弘一 ²、秋山康紀 ¹ ( ¹阪府大院・生命環境、 ²宇都宮大・

バイオ、 ³愛媛大・農)

Investigation of 5DS and lotuslactone biosynthetic pathways downstream of MAX1 in Lotus japon- icus

Narumi Mori ¹ , Xiaonan Xie ² , Kaori Yoneyama ³ , Takahito Nomura ² , Koichi Yoneyama ² , Kohki Akiyama ¹ ( ¹ Grad. Sch.

Life & Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., ² Ctr. for Biosci. Res. & Educ., Utsunomiya Univ., ³ Fac. Agric., Ehime Univ.)

Strigolactones (SLs) are a class of terpenoid plant hormones that regulate shoot branching as well as being known as root- derived signals for symbiosis and parasitism. It has been shown that rice Os900 and Selaginella SmMAX1a and SmMAX1b convert carlactone (CL) to 4-deoxyorobanchol, an orobanchol-type SL. However, how strigol-type SLs are produced in plants has remained elusive. We previously reported that Lotus japonicus MAX1 converts CL to 18-hydroxycarlactonoic acid (18-HO-CLA) via CLA, but not to 5-deoxystrigol (5DS). In addition, we also showed that LjLBO acting downstream of LjMAX1 is not involved in the production of 5DS. These results suggest the BC ring of 5DS is formed by unknown enzymes. Recently, we showed that L. japonicus produces not only 5DS, a canonical SL but also lotuslactone (LL), a non- canonical SL. Non-canonical SLs are C 20 compounds, while most canonical SLs consist of 19 carbons. It is likely that this additional carbon comes from the ester methyl group and therefore LL appears to be produced from MeCLA by a novel branched pathway. In this study, to clarify 5DS and LL biosynthetic pathways downstream of MAX1 in L. japonicus , we carried out sta- ble isotope-labeled compounds feeding experiments using the max1 mutant of L. japonicus .

【目的】

　ストリゴラクトン (strigolactone, SL) は植物が生産する根圏情報物質であり、枝分かれを抑制する内生ホル モンでもある。SL生合成において、オロバンコール型SLの生合成経路は明らかになったが、ストリゴー ル型SLの骨格を形成する経路は未だ解明されていない。我々はストリゴール型SLである5-deoxystrigol

(5DS) を主に生産するミヤコグサ ( Lotus japonicus ) を用いて、その生合成経路の解析を行ってきた。これま

でにミヤコグサにおけるCYP711AファミリーのMAX1組換え酵素がcarlactone (CL) を18-hydroxycarlacto-

noic acid (18-HO-CLA) にまで変換するが、5DS骨格を形成できないこと、また、MAX1の下流に存在する

2-オキソグルタル酸依存性デヒドロゲナーゼのLBOが5DSの生産に関わらないことを明らかにした。これ

らのことは、5DSのBC環の形成を行う経路には未知の遺伝子が関わっていることを示唆している。最近、

典型的SLである5DSに加え、ミヤコグサが非典型的SLであるlotuslactone (LL) を根圏情報物質として生 産することが明らかになった。LLはC20の基本骨格を有するためMeCLAを中間体とする新しい複雑な生 合成経路により生産されると考えられる。今年度の本大会では5DSおよびLLを生成するMAX1下流の生 合成経路を明らかにするために、MAX1欠損変異体を用いた安定同位体標識中間体の変換実験を行ったの で報告する。

【結果と考察】

　 LORE1 (Lotus Retrotransposon 1) ミヤコグサ内在性レトロトランスポゾンを利用した遺伝子タギング集団か らMAX1欠損変異体を得、その5DSおよびLL生産について調べた。その結果、 max1 変異体はどちらの SLも生産していないことが明らかになった。

　このmax1 変異体を用いて根に対する取込実験を行った。[10- ¹³ C]-18-HO-MeCLAを投与したmax1 変異体 は、 ¹³ C-18-HO-CLA、 ¹³ C-5DSおよび¹³ C-LLを生成した。このことから、18-HO-CLAの下流にはMAX1が 関与していないことが確定し、同時に2つのミヤコグサSLは18-HO-CLAまたは18-HO-MeCLAを前駆体 とすることがわかった。[1- ¹³ CH 3 ]-CLAの取込実験でも¹³ C-5DSおよび¹³ C-LLが生成したことから、CLAか

ら18-HO-CLAへの変換はMAX1を含む重複した経路であることが明らかになった。現在、18-HO-CLAを

化学合成し取込実験を行っている。

10. ソルガムの sorgomol 合成酵素の同定

○若林孝俊 ^1,2、支田香澄 ¹、石輪俊典 ¹、水谷正治 ¹、杉本幸裕 ^1,2 ( ¹神戸大院・農・生命機能科学、 ² JST/JICA SATREPS)

Identifi cation of sorgomol synthase in sorghum

Takatoshi Wakabayashi ^1,2 , Kasumi Shida ¹ , Shunsuke Ishiwa ¹ , Masaharu Mizutani ¹ , Yukihiro Sugimoto ^1,2 ( ¹ Grad. School of Agric. Sci., Kobe Univ., ² JST/JICA SATREPS)

In strigolactones (SLs) biosynthesis, a SL precursor carlactone (CL) is biosynthesized from β-carotene by sequential reac- tions catalyzed by D27, CCD7, and CCD8 enzymes. In rice, Arabidopsis MAX1 homologs catalyze conversion of CL to 4-deoxyorobanchol (4DO) via carlactonoic acid (CLA) and that of 4DO to orobanchol. In the present study, we investigated the genes involved in the conversion of 5-deoxystrigol (5DS) to sorgomol.

One of sorghum MAX1 homolog had the ability to convert CL to CLA, whereas, it was not responsible for the conversion of 5DS to sorgomol. We probed genes responsible for sorgomol biosynthesis by transcriptome analysis of sorghum roots. Some genes co-expressed with known SL biosynthesis genes were expressed in E. coli . As a result, a recombinant cytochrome P450 enzyme, CYP-SM, converted 5DS to sorgomol in vitro. In sorghum plant, administered each 5DS stereoisomer was metabo- lized to corresponding sorgomol isomer with similar substrate specifi city in vitro assay. Moreover, CYP-SM overexpressed Lotus japonicas hairy roots produced sorgomol using its internal 5DS as a substrate. Based on these results, we concluded that CYP-SM is sorgomol synthase in sorghum.

【目的】

　ストリゴラクトン (SL) の生合成経路において、生合成中間体の carlactone (CL) はシトクローム P450 であ る MAX1 により carlactonoic acid (CLA) に変換される。ABC 環を有する canonical SL では、CLA の閉環反応 に続いて、A-B-環が様々な化学的修飾を受けて多様な SL 構造が生じると考えられている。本研究では、

sorgomol を生産するソルガム ( Sorghum bicolor ) を実験材料として、5-deoxystrigol (5DS) の9 位に水酸基を導 入する sorgomol 合成酵素の同定を試みた。

【結果】

　ソルガムの MAX1 ホモログは CL を CLA へ変換する機能を有していたものの、5DS の sorogomol への変 換には関与していなかった。ソルガム根の遺伝子共発現解析により、既知の SL 生合成遺伝子と共発現する 遺伝子を見出し、それらを大腸菌で発現させ酵素機能を解析した。その結果、シトクローム P450 である

CYP-SM が、5DS を sorogomol へ変換することを明らかにした。CYP-SM は 5DS 立体異性体の内、5DS と

2’- epi -5DS のみを基質とし、この結果はソルガム植物体への 5DS 立体異性体投与実験の結果と一致してい

た。さらに、 CYP-SM を過剰発現させたミヤコグサ毛状根では、内在性 5DS を基質として sorogomol が生産 された。これらの結果から、CYP-SM が sorgomol 合成酵素であると結論付けた。

11. ワタにおける 5DS 水酸化酵素の探索

○北野友里恵 ¹、支田香澄 ¹、若林孝俊 ^1,2、水谷正治 ¹、杉本幸裕 ^1,2 ( ¹神戸大院・農・生命機能科学、 ² JST/JICA SATREPS)

Search for sorgomol synthase and strigol synthase in cotton

Yurie Kitano ¹ , Kasumi Shida ¹ , Takatoshi Wakabayashi ^1,2 , Masaharu Mizutani ¹ , Yukihiro Sugimoto ^1,2 ( ¹ Grad. School of Agric. Sci., Kobe Univ., ² JST/JICA SATREPS)

Strigolactones (SLs) are plant hormones that regulate shoot branching. They also act as rhizosphere signals for arbuscular mycorrhizal fungi and root parasitic plants. Gossypium hirsutum and G. arboreum produce strigol and sorgomol, respectively, from 5-deoxystrigol (5DS) (Iseki et al. 2018). We previously identifi ed CYP-SM as a sorgomol synthase catalyzing conversion of 5DS to sorgomol in sorghum, suggesting that CYP-SM homologs in the cotton species may also catalyze the introduction of a hydroxy group into 5DS. In this study, production of SLs was analyzed in the cotton plants grown under diff erent phosphorus conditions, and the cDNAs encoding CYP-SM homologs were isolated from the cotton plants.

【目的】

　ストリゴラクトン(SL)は根寄生植物の種子発芽やアーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐を誘導し、植物地 上部の枝分かれを抑制する植物ホルモンである。ワタは品種により生産するSLが異なっており、 Gossyp- ium hirsutum はstrigol、 G. arboreum はsorgomolをそれぞれ5DSから生産する(Iseki et al. 2018)。我々はソル ガムにおいてシトクロムP450であるCYP-SMが5DSに水酸基を導入しsorgomolへと変換する反応を触媒 することを明らかにした。ワタにおける5DSへの水酸基の導入についてもCYP-SMホモログが関与してい ると考え、本研究ではワタのCYP-SMホモログについて解析を行った。

【方法・結果】

　ワタを1/2 Hoagland水耕液で2週間栽培した後、引き続き1/2 Hoagland水耕液で栽培する通常条件と、水

道水で栽培するリン欠乏条件の2種類の栽培条件に分けた。それぞれの培地に含まれるSLの分析を行った ところ、リン欠乏条件で栽培したときに、 G. hirsutum ではstrigol、 G. arboreum ではsorgomolの生成が増大 することが確認できた。これらのワタの根からRNAを抽出し、Real-time PCRによる遺伝子発現量解析を 行った。その結果、既知のSL生合成遺伝子であるD27 、 CCD7 、 CCD8 およびCYP711A と同調してCYP- SMのホモログもリン欠乏条件下で発現量が増加していた。現在、これらのホモログ遺伝子の全長配列を取 得し、大腸菌発現系および昆虫細胞発現系で発現させ、5DSを基質として水酸化活性を評価している。

12. DWARF14-LIKE によるストリゴラクトン生合成の制御機構の解析

○森田　諒 ¹、田中　海 ¹、亀岡　啓 ²、経塚淳子 ¹、瀬戸義哉 ¹、増口　潔 ¹、山口信次郎 ^1,3 ( ¹東北大院・生命科 学、 ²大阪府大院・生命環境、 ³京都大・化研)

Regulation of strigolactone biosynthesis by the DWARF14-LIKE pathway

Ryo Morita ¹ , Kai Tanaka ¹ , Hiromu Kameoka ² , Junko Kyozuka ¹ , Yoshiya Seto ¹ , Kiyoshi Mashiguchi ¹ , Shinjiro Yamagu- chi ^1,3 ( ¹ Grad. Sch. Life Sci., Tohoku Univ., ² Grad. Sch. Life & Environ. Sci., Osaka Pref Univ., ³ ICR., Kyoto Univ.)

Strigolactones (SLs) regulate various aspects of plant development. They have also been known as root-derived allelo- chemicals for symbiosis and parasitism. Previously, we reported that (－)-GR5, which is a non-natural stereoisomer of a syn- thetic SL analog, dramatically increased the endogenous levels of 4-deoxyorobanchol (4DO) in both root extracts and exudates in rice. In addition, DWARF14-LIKE (D14L), a paralog of the SL receptor D14, was suggested to be involved in the action of (－)-GR5. In this study, we analyzed the d14l mutant generated by the CRISPR/Cas9 system. The d14l mutant was com- pletely insensitive to (－)-GR5 in 4DO production. Moreover, the germination stimulating activity of root exudates from the d14l mutant for Striga hermonthica was lower than that from wild-type (WT). We further found that the endogenous level of carlactone, a biosynthetic intermediate of SLs, was lower in the d14l mutant compared to WT. These results suggested that D14L plays a positive role in the regulation of SL biosynthesis in rice. Furthermore, we investigated whether (－)-GR5 increases endogenous SL levels in other plants using Arabidopsis and tomato (Micro-Tom). Though (－)-GR5 was not eff ec- tive in increasing the biosynthesis of methyl carlactonoate in Arabidopsis, it elevated the level of orobanchol in Micro-Tom.

　植物の枝分かれなどを調節する植物ホルモンであるストリゴラクトン (SL) は、根圏における共生と寄生 の化学シグナルとしても機能する。これまでに我々は、非天然型の立体配置を有するSL合成アナログの

(－)-GR5が、イネの内生SLである4-デオキシオロバンコール (4DO) の内生量を顕著に増加させることを見

出している。この(－)-GR5の作用には、SL受容体であるDWARF14 (D14) のパラログであるD14-LIKE

(D14L) が必要であることが示唆されている。D14Lは未知ホルモンの受容体として機能することが予想され

ており、(－)-GR5はD14Lのアゴニストとして作用することでイネの内生SL量を増加させたと予想される。

本研究では、D14LがSL生合成の制御に関与するかをより明確にするため、まず初めにCRISPR/Cas9シス テムによって作製したD14L 破壊株の解析を行った。始めに(－)-GR5に対する応答を調べたところ、 D14L 破壊株では(－)-GR5による4DOの増加作用が完全に喪失していた。次に、根浸出液の根寄生植物に対する 種子発芽刺激活性を調べたところ、 D14L 破壊株では野生型と比較して根浸出液の発芽刺激活性が低下して いた。さらに、 D14L 破壊株では野生型と比較して根のカーラクトンが減少していた。以上の結果から、

D14LはイネのSL生合成の制御に関与することが示された。続いて、D14Lを介したSL生合成の亢進作用 が他の植物種にも存在するかを調べるため、トマト (マイクロトム) とシロイヌナズナに対し(－)-GR5を投 与し、内生SL量を定量した。その結果、マイクロトムでは、(－)-GR5により内生SLであるオロバンコー ルが顕著に増加した。一方、シロイヌナズナでは内生SLであるカーラクトン酸メチル (MeCLA) の増加は 確認されなかった。シロイヌナズナのD14LオーソログであるKAI2の信号伝達経路が恒常的に活性化して

いるsmax1 smxl2 二重変異体においてもMeCLAの増加は確認されなかった。これらの結果から、イネやト

マトと異なり、シロイヌナズナのKAI2経路はSL生合成を制御しない可能性が考えられた。イネやトマト はアーバスキュラー菌根菌 (AM菌) と共生し、シロイヌナズナはAM菌と共生しない。また、イネのD14L はAM菌との共生に欠かせない遺伝子であることが報告されている。これらのことからD14Lを介したSL 生合成の制御機構は、AM菌との共生に関連するかもしれない。