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甘藷フォスファーゼに関する研究(第2報) : フィターゼ作用について

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Academic year: 2021

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(1)Title. 甘藷フォスファーゼに関する研究(第2報) : フィターゼ作用について. Author(s). 東, 尚巳. Citation. 北海道學藝大學紀要. 第二部, 10(2): 105-111. Issue Date. 1959-12. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/5636. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 北海道学芸大学紀要(第ニ部). 0巻, 第2号 第1. 甘. 藷 フ ォ ス フ ァ タ 第2報. ー ゼ に. 昭和34年12月. 関. す. る 研 究. フィ タ ー ゼ 作 用 に つ い て. 東. 尚. 北海道学芸大学旭川分校. 巳 化学教室. Nao lni AZUMA: Studies on the Sweet Potato phosphatase 1 1 ( ). on the Phytase Act i on. ion of sweet potato phosphatase As tudy was made of the phytase act s . lt was found that thi luor de and Na‐江 ibi f i lybdate ivated by Mg什, Ca什 and wasstrongly inh ted by Na- ion was not act 1 o act oC for lon in i imum of 5 ing th i , 15 ty ・ at a pH opt oss of the act s enzyme at70 vi . . . on heat , complete l I ic ac id h T 伴 trate( h h h t h f H - h t t ) n was found for each subs β s e o s a e e n e r o a e e e c o o c o Phyt g P y P P P P P . , ,. f l i ied inh ib i ion by Na‐ de and on KM wasstud t uor .. The above research reVeal i desubstrate s the factthatsweet potato phosphatase pos sessesaVery 頓 r. lycerophosphate iac i lphosphate ic ty;i t act son β-g spec sphate , pyropho , pheny , metaphosphate and phyt id ac .. 甘 藷 フ ォ ス フ ァ タ ト ゼ が フ ォ ス フ ォ モ ノ エ ス テ ラ ー ゼ, ピ ロ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ, メ タ フ ォ ス フ. ァ タ ー ゼ 作 用 を 有 す る が フ ォ ス フ ォ ジ ェ ス テ ラ ー ゼ 作 用 は 示 さ な い こ と, 及 び そ の 作 用 に 対 して モ リ ブ デ ン 酸 ソ ー ダ, フ ッ 化ソ ー ダ, 塩 化 第 二 水 銀, 酸 化 セ レ ン 等 が 低 濃 度 で 強 く 阻 害 し, ヨ ー ド,. imi l de thylma 硝 酸 銀 は よ り 高 濃 度 で 阻 害 を 与 え る が, N‐ e e , グリ セ リ ン, 黄 血 塩, チ オ 硫 酸 ソ ー ダ, ア ス コ ル ビ ン 酸, ヒ ス チ ヂ ソ 等 は 阻 害 を 殆 ん ど又 は 全 く 示 さ ず, 所 謂 フ ォ ス フ ァ タ ト ゼ の 第 2. ) のタイ プに属するものであることを酵素の精製法と共に先に報告した1 ,. メ ゾイ ノ シ ト ト ル の 6 燐 酸 エ ス テ ル で あ る フ ず チ ン 酸 に 作 用 す る フィ タ ー ゼ は 1907 年 鈴 木 ら. によりはじめて見出された. 動物, 酵母, 細菌等に見出されているフィ タトゼは活性はあまり強く なく分布も広くない. 植物には屡々見出され主として種子中に存在していると報告されている. 特 に ・麦, 裸麦の種子には相当強いフィ タ←ゼ作用があるが, 他の部分例えば根, 葉, 果汁中の作用 は 弱 い か 又 は 殆 ん ど な い と い う. フィ タ ー ゼ 作 用 は 他 の フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 作 用 の よ う に は 研 究 さ れ て お らな い が, 穀 類 に 於 い て 発 芽 時 に フ ィ タ ー ゼ 作 用 が 強 く な る こ と が 知 ら れ て 居 る こ と か ら, 種. 子には他の有機燐に比べフィ チンリンが比較的多量含まれていることでもあり, 更に広い研究が行 i t わ れて も よ い の で あ る が, 現 在 ま で は, J o s らの 分布 及び分解機 構に関する広 範な 研究 以 , Cour り 行 わ れ て な よ ば フ タ あ ま い い 彼 ら れ 外は に ィ ー ゼと他 のフォ ス ファ ターゼとを 完全に分 離する .. ことは出来なかったが, 艇には非常に活 生の 強 い フ ャ タ ト ゼと 活 生の 弱 い フ ォ ス フ ァ タ ← ゼ の 存 在 ) J Roche に よ れ ば フ ォ ス フ ォ モノ エ ス テ ラ ー ゼ 作用 を 有 して フ ィ チ す る こ と を 見 出 して い る2 . . , ン 酸 に は 作 用 しな い 酵 素 は あ る が, フィ チ ソ 酸 に 作 用 す る 酵 素 は 凡 て 他 の エ ス テ ル に 作 用 す る と い. 又 彼 は フィ タ ー ゼ を opt .pH が 若 干 ア ル カ リ 側 の も の と, 酸 性 側 に あ る も の と の 二 つ に 分 け 3 ) 著 者 甘 ている , は 藷 フ ォ ス フ ァ タ ← ゼ が 他 の 基 質 に 対 す る よ り も 活 性 が 弱 い が フィ チ ン を も 基 質 と して 加 水 分 解 し, Roche の分類で酸性側に opt ,PH を 持 ち, フ ッ 化ソ ー ダ, モ リ ブ デ ン 酸 ソ - う.. ダ で 強 く 阻 害 さ れ, マ グ ネ シ ウ ムイ オ ン で 賦 活 さ れ な い タ ソ ブ に 属 す る こ と, 及 び そ の 作 用 が, フ ー105一.

(3) . 東. 間. 巳. ィ チ ン 酸 に 特 異 的 に 働 く フィ タ ド ゼ に よ る も の で はな く, こ の 甘言著フ ォ ス フ ァ タ ト ゼ の 基 質 に 対 す. る選択性が非特異的であることによると推論できる結果を得たので報告する, 実. 験. 1 。 材料及び方法 酵 素: 殆んど前報と同様操作で精製 した.. 4~ 澱粉を除去した甘藷磨砕汁を氷冷下で0 , 0 0 H4 65飽和の硫安分別を3 度くりか え し, 透析後 p . と して沈澱する部分を除きアルミナ吸着を .. 行った. この酵素液にトルオールを添加して氷室中に保存したが長期間殆んど活性を失わなかった. 2% 塩酸で抽出し, アル 新 鮮 な 米 糠 を エ ー テ ル で 脱 脂, ア ル コ ー ル で 煮 沸 後 0 フィ チ ソ 酸: , コ ー ル を 加 え て 沈 澱 して 得 た も の を 水 で 3 回 再 結 晶 して 用 い た. nープ ロ ピ ル ア ル コ ー ル・. ア ソモ. 5N ア ソ モ ニ ヤ を 溶 媒 と し て ペ ー パ ー ク ロ マ ト グ ラ フィ ー を 行 っ た と 水 及 び n‐酪 酸 --0 .. ニャー. こ ろ 一 つ の ス ポ ッ ト し か 認 め ら れ な か っ た, 酵 素 反 応:. 15 10 ク エ 5 の M/ フ ィ チ ソ 酸 を 基 質 と した 場 合 は pH5 , , 他 の 基 質 の と き は pH5 ,. 2 5% 溶液, 他の基質の場合は M/ 100溶液) c(フィ チン酸は0 ン酸緩衝液 2ccと基質 lc , , 適当に希 o 5 0 C 3 6 0 釈した酵素液 lc 蒸溜水を加えて全量を で 分間又は1 し 分間反応を行った c cと c , , 遊 ,. ske-Subbarow 法 で 光 電 比 色 計 に よ り 定 量 した. 離 したリンを Fi 2 . 酵素の精製とフ ィターゼ活性. 酵 素 の 精 製 過 程 に お け る β-グ リ セ ロ リ ン 酸, メ タ リ ン 酸, フィ チソ酸に 対 す る 活 性 比 を pH 5 1 0クエ ン酸緩衝液で 10 分間に遊離するリンから求めると第1表に示すよう に原液ではフィ 5 M ., /. タ ー ゼ 活性 に 比 し, フ ォ ス フ ォ モ ノ エ ス テ ラ ー ゼ 作 用 が 強 い が, 第 1 回 の 硫 安 処 理 と ア ル ミ ナ Cr. 処理の段階で急激に活性が近づく. 第. 1. 表. 種. 7. 1. 8 5 .. 5 5 .. 1. 第 2回 〃. 13 8 .. 94. 1. 第3回 〃. 14 7 .. 原. 液. 類. 4-0 65 飽 和 第 1回 硫 安 0 . .. アルミナ処理後透析液. 16 6 .. 3 8 .. 10. 1. 3 3 .. 1. -. 3 . 最 適 pH 10 分 間 に遊 離 した リ ン を 縦 軸 に, PH を 横 軸 に と る と 第. l 知. ~0. pH. 60. I 図 の 結 果 を 得 た. β-グ リ セ ロ リ ン 酸 や 他 の 基 質 に 対 す る よ 第1図 フイ チン酸及びβ-グリセ。 リン酸に対するPH‐活性曲線 り も 若 干 酸 性 側 に ず れ て, フ ィ チ ソ 酸 に 対 す る 最 適 pH は 15 附 近 に あ る. 此 の 最 適 pH で フ ィ チ ソ 酸 の Kム 5 18%, 若 しフィ チ ン 酸 が Ander - ーを 測 定 す る と 0 , .. の式を有するとすれば, つまり分子式が 図参照) .. son. 4M で あ る (第 2 C6H 0 4P で あ る と す れ ば 2 2×10‐ . , 82. -106-.

(4) . 甘藷フォースファターゼに関する研究. 2 xl o-. 4 0. / 第2図 フィ チン酸に対する1 / s~1 り曲線 クエン酸緩衝液 pH5 15 .. 反応時間1 0分. 4 . 熱不活性化 oC で基質を加えて反 酵素溶液に緩衝液を加えて各温度に10 分間保ったのち, 氷中で急 冷後30. 応 さ せ て 得 た 結 果 を 第 3 図 に 示 す. フィ チ ソ 酸,β-グ リ セ ロ リ ソ 酸, フ ェ ノ ー ル リ ン酸, い ず れ を 基. o 1 oC 以上で不活性化がはじまり 70 質とした場合も50 , 0分間でほぼ完全に活性を 失う. 不活性化 , C oC-6ずC で あ る こ れ を 第 4 図 に 示 す こ の 図 の 曲 線 の 勾 配 か ら の 速 度 を 測 る の に適 当 な 温 度 は 55 . . 37 が 求 め ら れ る. こ の 反応を見かけ上一次反応とすると, その速度定数 た ヂ ニ0,14 及 び なヂ ニ0 ,. 1 値を Am mu sの式に代入すると E 「 争三 島 窮 奏 である 赫, E- 禦 倣a , 又 欝一. oC の 不 活 性 化 の 温 度 係 数 が 26 で あ る こ と が 判 っ た 次 に H46 515 55 575 668 の 緩 衝 65 p ., . , ., , , , . , oC に 2 時 間 保 っ て 氷 冷後 30 oC で 基 質 を 加 え て 反 応 を 行 わ せ た と こ ろ β-グリ セ ロ リ ソ 液 と 共 に 40 , 6 及 び6 15 5 68 で 活 性 の 低 下 が 見 ら れ た が, PH5 酸, フィ チ ソ 酸 い ず れ に 対 して も, PH4 , , , . ,5 , o 残 存 活性 % . フィチン散髪. リンめ妾. ~ 0. う題 度 第3圏. 4 0. フ ィ チ ン酸, β-ク リセ ロ リ ン酸, フ ェ ノ ー ル リ ン酸. を基質としたときの熱不活性化曲線 15 フ ィ チ ン酸 (PH5 ) .. -107-. 54 その他 ( ) PH5 ,.

(5) . 東. 筒. 巳. oC に 2 時 間 保 つ と pH46 及 び 668 で は β‐グリ セ ロ リ 5 75 で は 殆 ん ど 活 性 は 低 下 し な か っ た. 50 , . .. ソ酸に対するよりもフィ チソ酸を基質にした場合の活性の低下は著 しく, その他の pH ではいずれ の 基 質 に 対 して も 30~40% の不活性化が見られた.. . \ \. . . し は。. \. \\. \\. \. 3. ヮ分. 8を F『. 第4図 5ずC , 6ずC に処理 した時間と残存活性との関係. による KM の変化 フ ィ チ ソ 酸 を 基 質 と した 場 合 の ミ カ エ リ ス 定 数 の pH による変 化を検討すると第 5図に見られ る よ う に pH が 5 以 下 で は KM は 得 ら れ な い. 5 以 上 で の pH と KM の -l og と の 関 係 (第 6 図 参 照) 5 . pH. 96 及 10OCaC 扇添加 の 場 合, PH4 は直線的で pH の増加とともに KM が対数的に 増 大 す る. 尚 M/ . 75 に於ける KM 値 は 夫 々 0 び5 4%, 0 57% で あ っ た. . . .. ん. 0 ~ .. 1O. 第5図. Z0. 30. / 各 pH での1 / 8~1 の曲線. -108-. 2 ‐ 尾xーo.

(6) . 甘藷フォースファターゼに関する研究. 、. 0 ~. ァH. 4. ~. ,. 第6図 pH‐PKM の関係. 3 ー . P. 第7図 モリブデン酸ソーダによる阻害曲線. 6 , モ リ ブ デ ン 酸 ソ ー ダに よ る 阻 害 1000 で 50% 阻 害 が 起 り, 阻 害 の 型 式 は 捨 抗 的 で 他 の フ ォ ス フ ォ モ ノ エ ス テ ラ ー ゼ や メ 約 M/ ,. タフォ スファ タトゼ作用に対する阻 害と同様であった (第7 図参照) . 7 , フ ッ化 ソ ー ダ に よ る 阻 害. フッ化ソトダ によってもフィ ターゼ作用 は強く阻害され, 他の基質に対すると 同様非捨抗的阻. 害 で あ っ た. こ の フ ッ 化ソ ト ダ に よ る 阻 害 は pH に よ っ て 阻 害 度 が 変 わ り PH の 増 加 に 伴 な い 阻 , 害 が 減 少 す る. しか も こ の 傾 向 は フ ィ タ ー ゼ 作 用 の と き よ り も フ ォ ス フ ォ モノ エ ス テ ラ ト ゼ 作 用 の. 場合の方が明瞭に見られる (第 8 図, 第9 図) , ー 障 害 Z. ‘ な , 卿. 0. ~. 1 P. 3 ,. 2. . 第8図 フッ化ソーダによる阻害曲線 (基質: フィ チン酸). 第9図. -109-. . . . . フッ化ソ←ダによる阻害曲線 (基質; β-グリ セ ロ リ ン酸).

(7) . 東. 筒. 巳. 8 . そ の他の影響 000 に 互っ て フ ィ タ ー ゼ 作 用 に 5 100~ M/ 000 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム の M/100~ M/10 , , シ ュ ウ 酸 M/ ,. 1 00で約20% の阻害を示し, 他の濃度で 1 00で約8%, 後者は M/ 対する影響をみると, 前者は M/ 200 以下の濃 度では阻害しなかった。 は影響しなかった. 又, フェ ニル紙酸も M/ 察. 考. モ リ ブ デ ン 酸 ソ ← ダ に よ っ て 桔 抗 的 な, フ ッ 化ソ ー ダ に よ っ て 非 捨 抗 的 な 阻 害 を う ける こ と は こ の フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ の 他 の 基 質 に 対 す る と 全 く 同 様 で, 且 つ, フ ォ ス フ ォ モ ノ エ ス テラ ー ゼ に は 殆 ん ど 阻 害 を 示 さ な い が, あ る 種 の フィ タ ー ゼ を 阻 害 す る シ ュ ウ 酸イ オ ン は, こ の 酵 素の フ ィ タ ー. ゼ作用に対して高濃度で若干阻害を示すが, 他のどの基質に対 する作用も阻害 しない, 又, フィ タ ト ゼの賦活剤と して作用する場合もあるマグネシウムイオンは低濃 度で賦活せず, 却って高濃 度で 阻害した.. 15 で, 他 の 基 質 に 対 す る よ り も 若干 酸 性 側 で あ る が, 小 麦 の フ フィ タ ー ゼ 作 用 の 最 適 pH は 5 , )の 場 合 も 同 じく pH5 ) 麦 芽 フィ タ ← ゼ5 2 で, 且 つ, こ の PH に 於 け る KM は 15 及 び 5 . , ィ タ ー ゼ4 , 3 3×10- M に 近 い 値 で, こ の 甘 諸 フィ タ ー ゼ は 小 麦 フィ タ 2 2×104 M で, こ の 値 も 小 麦 の 場 合 の 0 . ,. ト ゼと類似の性質であろうと思わ れる.. 5. フ ッ 化ソ ー ダ に よ る 阻 害 の 場 合, フィ チ ソ 酸. とβ -グリセロリン酸を基質として第8図と第9図 ) 0% 阻害を与えるフッ 化ソ←ダ濃 度( の と か ら, 5 の rlog と pH と の 関 係 を 求 め る と, 第 10 図 の 様 に β-グリ セ ロ リ ン 酸 の 場 合 は pH の 減 少 に つ れ. 6 か ら 7 にわたって 直線的 て の 値 は 減 少 し, PH 4 ,. 々. Y . ・ 一方フィ チソ酸の場合 も同様な関係を であった. 得 た が, β‐グリ セ ロ リ ン 酸 ほ ど で わ な く, PH の. . 酸 性 に 於 い て フ ッ 化 ソ ← ダ の 阻 害 が 著 しく な る の. ー. オ ン に よ っ て 阻 害 さ れ る と 考 え れ ば よ い こ と は, )と 同 様 で あ り 他 の フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ の 場 合7 , こ フ よ り も す る 対 ィチ の と き β-グリ セ ロ リ ン 酸 に. . \ \十 G ザン 唯. 減少に伴なう の値の減 少は直線的でわなかった.. は, HFi イ オ ン 濃 度 が pH の 小 さ く な る 程 大 き く ) F‐ イ オ ン に よ る よ り は HFi イ な り6 , む しろ ,. ーメ座。リンめ を ド J. p中3 r、\. 0 5 ・. 6 0 .. ァH 第10図 &グリセロリン酸及びフイ チン酸 を 基 質にしたときの pH-p〆 曲線. れ ン 酸 に 対 して, 同 一 pH で の の 値 が 大 き い の は 両 者 の 構 造 の 差 異 に よ る も の で あ る う と 考え ら る. H 493 48 の グラ フ を 延 長 して KM pH と pKM と の 関 係 は 第 6 図 に 示 して あ る が, 第 5 図 の p , と , 9 附 近 に 夫 々 グラ フ の 折 れ 曲 が り が 得 ら れる. 若 し上 15 を 求 め て 第 6 図 に プ ロ ッ ト す る と pH5 . , ,4 9 は フィ チ ン 酸 又 は フ 15 及 び 4 . , の 様 に して 得 た pH5 以 下 の Kム ーが 真 の KN を 示 す と す る な ら ば, 5. 184 63 97 で あ る の で, こ の 値 K ィ タ ー ゼ の pK で あ る と 考 え ら れ る が, フ ィ チ ン 酸 の p 値 は . , ., . ゼ は フ ィ タ ー ゼ の pK 値 で あ ろ う と 推 察 で き る. 又, PH5 以 下 で 基 質 濃 度 の 大 き い 場 合 フ ィ タ ー の i c group 5図) これは5 以下の pH ではフィ ター ゼ中の解離 bas. 反応速度の減少 が見られるが (第 , 量が増 して, これに結合 するフィ チン酸量 も増すので速 度が大きくなると考えられるが, フィ ター i ives te をフィ チン酸が2個以上捨抗する結果速度 が小さくなるのであろう. ゼ の act 以 上 の 様 に 甘 藷 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ の フィ タ ー ゼ 作 用 は 他 の リ ン 酸 エ ス テ ル を 基 質 に した 場 合 と 0- 1 -1.

(8) . 甘諸フォースファター ゼに関する研究. は若干異なる結果を与えることもあるが, 殆んど類似した性質を示し, いずれを基質とした場合に も, Ca 1 5~pH5 5にあり, 又阻害剤の影響などから , Mg は賦活剤として作用せず, 最適 pH は5 . , 甘 藷 中 に他 の フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ と 独 立 して フィ タ ← ゼ が 存 在 す る の で は な く, 甘 藷 フ ォ ス フ ァ タ ←. ゼが基質に依って若干異な る作用を示しているものと考えられる。 要. 約. 甘 藷 フ オ ス フ ァ タ ト ゼ の フィ タ ト ゼ 作 用 に つ い て 研 究 した. こ の 酵 素 は β-グ リ セ ロ リ ン 酸, フ ニ ェ ル リ ン 酸, ナ タ リ ン酸, ピ ロ リ ソ 酸 を 基 質 と した 場 合 よ り も 活 性 は 弱 い が, フィ チ ソ 酸 に 対 し 15 で KM は 2 2×104 M で あ っ た. モ リ ブ デ て も 作用 し得 る. こ の フィ タ ー ゼ 作 用 の 最 適 pH は 5 . ,. ン酸ソーダの阻害は他の基質に対するときと同様捨抗的で且つ pKiも殆んど同じであった, フッ 化 ソ ー ダ に よ る 阻 害 は 非 捨 抗 的 で, PH が 酸 性 に な る ほ ど阻 害 が 強く な る.. シ ュ ウ 酸イ オ ン, マ グネ. シ ウ ムイ オ ン, カ ル シ ウ ムイ オ ンの 影 響, 酵 素 の 熱 変 性 過 程 な ど に つ い て も 研 究 した, 丈 1 ) 2 ) 3 ). 献. 9 東: 北学大紀要,1 1 54 ) . ,78(. i im.bi J 1947 s eury: Bi och ophys ) . Courto . Acta . , P. F1 ,1 ,270( T h h 回 d i d J S K J R B b B M b a 1950 ( t ) ) n m o c : e z e u mn r r ck e e e y y y . . . .496( 。 , . ,P. 4 1953 ) F. G. Peers: B.J ) , . ,53 ,102(. lbere i 1927 ) sen: 駅r scbr 5 ) H.Luers . . Brau ,263( , K.Si ,44 1953 ) 6 ) A. C. Maehly; Arch. Biochem.Biophys .44 . ,430( ) 1956 7 ) K. K, Tsuboi ochem. Biophys . Bi . B. Hudson: Arch , . ,P ,61 ,197(. 11- -1.

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