緒言 von Willebrand

(1)

(562)

奈医誌(].

Nara Med. Ass.) 41

^，

562‑570

^，平

2

von Willebrand

因子

(vWF)

のヒト

TypeIII collagen

への結合に関する研究

II. von Wil1ebrand病および血友病A患者

血築中の

vWFのcollagen

結合

奈良県立医科大学小児科学教室西久保敏也

STUDY O N BINDING OF VON WILLEBRAND FACTOR T O HUMAN TYPE III FIBRILLAR COLLAGEN

II. COLLAGEN BINDING OF VON WILLEBRAND FACTOR (VWF) OF THE PLASMA IN PATIENTS WITH VON WILLEBRAND DISEASE

AND HEMOPHILIA A

TOSHIY A NISHIKUBO

Deρartment 01 Ped

ぬ

trics

，

Nara Medical University

Received September 28， 1990

Summary: The percentage of binding of vWF to human Type III fibrillar collagen was determined in plasma samples from 20 patients with various types of von Wi

1 1

ebrand disease (vWD) and 27 patients with hemophilia A

.

The levels of collagen binding were normal， ranging from 83.6 to 90.0% in 9 cases of Type 1 vWD. In 7 cases of Type IIA vWD and 3 cases of Type II B v

羽

TD，the rates of collagen binding were 42.0‑76.1% and 68.0‑80. 0% respectively. A case of Type IIC vWD showed a remarkable decrease， with 35.8%. On the other hand

，

27 cases of hemophilia A showed normal values with 91.0‑98.7%.

When plasma samles absorbed with collagen and then vWF multimer in the supernatant were analysed by agarose‑gel electrophoresis， the larger multimer of normal vWF showed the strongest affinity to collagen， while the smallest one was poor.

Changes of vWF multimer in Type 1 vWD showed the same results as those of normal plasma， but Types IIA， IIB and IIC vWD showed a decreased affinity of intermediate and smaller multimer to collagen.

These findings suggest that the poor affinity of vWF of Types IIA， IIB and IIC vWD to collagen may be caused by abnormality of the collagen binding domain in vWF subunit.

Index Terms

von Willebrand factor

，

von Wil1ebrand disease

，

hemoph

i 1

ia A

，

collagen binding

，

human Type III collagen

緒言

von Willebrand

病

(vW

D)は出血時間の延長と皮膚

粘膜の出血を主徴とする常染色体遺伝性疾患で，今日，

本疾患はヒト常染色体

No

. l

2

^の

vonWillebrand

^因子遺伝

子Cl2pter‑p12)

の欠陥による

vWF

蛋白の量的ないし

(2)

質的合成障害症として把握されている問問.

ヒト血築中の

vWF

は

SDS

アガロースゲノレ電気泳動法の解析で

0.5~ 20 x 10'dalton

におよぶ

multim

巴

r band

の

senes

よりなることが観察され，この所見は

vWD

の病型分類に用いられ、現在

vWD

は

vWF^目Ag (vWF

蛋白〉は低下するも

multim

巴

r

の各

series

は正常血援のそれらと同様に存在する

Typ

巴

1

，

vWF目 Ag

は必ずしも低下しないが

multim

巴

r

構成に異常のみられる

Type II

，

vWF: Ag

が欠如し全ての

multimer

を欠く

Type III

に大別されている

4) Typ

巴

I

は

vWF

蛋白の量的合成障害症と考えられ，一方，

Type II

は

vWF

蛋白の量的ならびに質的異常が存在するもので，

IIA

，

IIB

，

II C

，

IID

，

IIE

，

IIF

，

IIG

，

IIH

および

TypeB

と呼ばれる

subtype

が報告されている.

Type III

は血竣

vWF

の量的欠陥症で常染色体劣性に出現する病型である

5‑12)

vWF

の機能として

in vitro

では抗生剤の一種の

rictocetin

，あるいは蛇毒製剤

botrocetin

存在下に血小板膜上糖蛋白

1b (GPI b)

に結合することが明らかにされている

1叩4).In vivo

ではヒト動脈内皮下組織への血小板粘着，血栓形成は

vWF

を介して行われることが

Weiss et a

l .

15 ，iSakariassen et aJ.1'i， Tschopp et a

l .

17 ，i

によって観察された.

Nyman19)

は数種の

collagen

製剤 j のうち

typeIII collag

巴

n

が

vWF

を吸着することを報告し，

Scott et a

l.叫は

type 1

，

II

，

III

も同様の作用を示すことを観察した.これらの観察は主に純化

vWF

，血小板

collagen

反応であり，血築中の

vWF

の

collagen

結合の簡易測定法ではない.

すでに著者は

invitro

において

humanplacenta

より得た

type III fibr

i 1 1

ar collagen

を用い液相法で

col‑ lag

巴

n

結合を測定する系を報告

27)

した.今回

vWD

各種患者および血友病

A

患者血媛中の

vWF

の

collagen

結合につき

vWFmultimer

構成の変化とあわせて検討したので報告する.

対象および方法

1.対象:

von Willebrand

病

19

例

(Type1 9

例，

Type IIA6

例，

Type IIB 3

例，

Typ

巴

IIC1

例)，血友病

A 27

例について検索した.また正常成人男女それぞれ 5 人の血援を等量ずつ混和しプール血援を作製した.

2.

血疑.プラスチック製ディスポザブノレ注射器に

21G

注射針を接続し，正常成人，

von Willebrand

病患者および血友病

A

患者の各々肘静脈よりすみやかに採取した全血

9

容を直ちに

3.8

%グエン酸ナトリウム

l

容の入ったプラスチック製試験管に加えて混和し，

3

，

000

回転

15

分間遠心しクエン酸血撲を得た.これらの血援を小量ずつ

プラスチックチュープに分注し，用に臨むまで

80'C

で保存した.

3. vWF: Ag

の測定:抗

vWF

家兎抗体を

1

次抗体とし，ベノレオキシダーゼ標識抗

vWF

家兎抗体を

2

次抗体としたサンドウィッチ

ELISA(DAKOP A TS

，

Denmar‑

k)法

18)

にて測定した.

4.

リストセチンコブアクター

(Rco

f ):

von Willebrand

試薬

(Behringwerke

，

G

巴

rmany)

を用いた肉眼的血小板凝集法

21)

によった.

5.

ヒト

typeIII fibrillar collagen

懸濁液の作製乾燥

typ

巴

III soluble collagen from human placenta (SIGMA Ch

巴

micalCo.

，

St Louis Mo.)

を

O

. l

mo

l /

L

酢酸で濃度1.

5 mg/ml

に溶解し，

4 'c

下で

48

時間撹叛後リ

ン酸水素二ナトリウム溶液

(20mmo

l /

L

，

pH7^目5)

で

48

時間透析した後，再び

4

' c 下で

16

時間以上撹叛し使用し

T

こ.

6. Collag

団結合

(Collagenbinding)

: 第

I

報

27)

で述べたごとく血媛

vWF

のヒト

typ

巴

IIIcollagen

への結合の測定は

Dugganet a

l .

22)

の変法にて行った.

7. SDS

アガロースポリアクリノレアミドゲノレ電気泳動 :

Chopek

&

Girma et a

l .

23)

の方法に準拠した.

127x 245xO.2 m

日のゲ、ノレボンドフィノレム

CPharmaciaCo.)

を

130 x 260 x 2 mm

のガラス板にはりつけ，

125 x 260 x 2 mm

のゴム枠を乗せ，さらにガラス板をかぶせ四方をクリップでとめ，厚さ

2mm

のガラス板間隙に，

0.1% SDS

加

6 M

尿素加1.

5%

アクリノレアミド加

1 %

アガロース液

(Seakem HGT【P19

を

0.1% SDS

加

O.lM

トリス・リン酸緩衝液，

pH7.0

で煮沸溶解した後その内の

33.8ml

を

32

. 4

g

の尿素と

28.13ml

の

0.2%SDS

加

0.2M

トリス・

リン酸緩衝液，

pH7.0

と1.

8ml

の

O目6MNa4【EDTA

溶液

pH7

. 4 を

3

7 '

C

で溶解した溶液に加え，さらに

30

%アグ

リノレアミド加1.

5%

メチレンピスアクリノレアミド溶液 9

ml

，

5

%過硫酸アンモニウム1.

8ml

，テトラメチレンジアミン

0.3ml

を加えて作製〉を流下し

4'c

で冷却した.

ゲル化後カ守ラス板を外し，ゲノレの四方を

120x 250 mm

にな

るよう切除した後，長辺端より

20mm

の位置に

5mm

間隔で

3 x 13 mm

の穴をあけ，試料

50μI

を添加した試料は被検

検体

10μ11

こ尿素

36mg

，

10% SDS 10μ1

，

0.25%

ブロム

フェノールフツレー

5μl

と泳動緩衝液

20μl

を加え

65'C 15

分間加温したものを用いた.泳動は

0.1%SDS

加

0.1 M

リン酸緩衝液

pH7.0

を泳動緩衝液とし

LKB

社

(Sw

巴

den)

製電気泳動装置および

DESAGE(German)

製冷却装置を用い

10'C80mV/g

巴

l

で

15

分間泳動後，孔

を

0.1%SDS

加

1%

アガロース加

O.lM

トリス・リ

γ

酸

緩衝液，

pH7.0 (Seakem HGT‑P

を

0.1%SDS

加

O.lM

(3)

(564)

_{西久保敏也}

トリス・リン酸緩衝液

pH7.0

で沸騰溶解〉で子

L

埋めした

collagen

結合

/100

と

Rcof

に相関を認めなかった . 後，

50mV/g

巴

l

で、色素がゲノレの他端に至るまで泳動した

TypeIIB

は，

Rcof

活性

48%~56

% ，

vWF: Ag 55 %

8.

オートラジオグラフィー:泳動終了後，

10

%トリク

~68

%と軽度の低下に留まり，

collagen

結合は

68.0%

ロロ酢酸加

50

%メタノーノレ溶液で

2

時間固定し蒸留水

_~80.0

%で，

Rcof

は

vWF:AgXcollagen

結合

/100

と

1 L

に

3

時間毎に水を交換しつつ

12

時間浸した.次いで相関傾向を認めた.

Type IIC

は

Rcof

活性

5%

以下，

l%BSA

加

0.15M

塩化ナトリウム加

O.OlM

リン酸ナト

vWF^目Ag48%

であり

collagen

結合は

35.8

%と低下しリウム緩衝液

pH7目2(Tw

巴

en20

，

0.5 m!/L)

で

3

時間漫ていた

(Tabl

巴

l

及び

Fig.

1 ) .

した後，

125 1

標識抗体槽に室温で

12

時間免疫固定し，血友病

A

患者

27

名の

collagen

結合は

9

1 .

0% ‑98.7 PBS/Tw

巴巴

n

緩衝液中に

24

時間さらに

3%

食塩水

2L % (97.0

土1.

8

% ) ，

Rcof

活性は

112%‑360 %

( 1

78

土中に

24

時間浸し，

0.9

%食塩水

2L

中に

24

時間，最後に

6

1 .

2

% ) ，

vWF: Ag

は

66%‑353 %

( 1

81

土

75.6%)

で蒸留水

2L

中に

24

時間浸した.ゲノレを乾燥後コダッグ

NS.ST

フィノレムと

Intensifyingscreen (Dupon Co.)

を

100

暗室で密栓させ，

‑70^oC 6

時間感光後現像した.

各マノレチマーの分子量の算定は

Furlanet a

l .

'4)

の方法に準じて，純化

IgM(Capp

巴

1Laboratories)

の重合物による泳動パンドと対比して行った.

成韻

1. vWD

各種病型および血友病

A

患者血築中の

col. lag

巴

n

結合，

Rcof

活性および

vWF:Ag

vWD

の

Typ

巴

19

例，

Type IIA 7

例，

II B 3

例および

IIC1

例の計

20

例について

collagen

結合を測定し

Rcof

活性，

vWF:Ag

および

vWF: Ag X collagen

結合

/100

と対比検討した.

Type 1 では Rcof 活性 5% 以下 ~38% ， vWF:Ag6

%‑46%

と中等度に減少していた.

collagen

結合は

83.6 % ‑90.0

%で，

vWF: Ag X collagen

結合

/100

と

Rcof

活性の相関は，

r =0.75

で比較的よく相関していた.

Type IIA

では，

Rcof

活性は

1

例の

12

%を除き

5

%以下，

vWF:Ag

は

28%~55

%と中等度に低下していた.

collagen

結合は，

42.0%~76.1% で vWF:Agx

80

n H u n H U

内h u a n

マ

( ぷ ) 丘一三ぢ目半

0 υ

‑ Z

. . . . . .

. . .

•

20 ‑l・

• •• ^A

~/)，恥J:;.1;6. ^/ ⁾ ^，

。。 20 40 60 80 100

vWF :

Ag X collagen binding/l00 Fig.

1 .

Relationship between vWF: Ag X collagen

binding/100 and Rcof. Pati

巴

ntswith typ

巴

I are indicat

巴

das closed circles

( ・ ) ，

type IIA as open triangles

( ム ) ，

type II B as closed triangles (...) and typ

巴

IIC as open square

(口).

Tabl

巴. 1 .

Collagen binding(CB)

，

vWF : Ag

，

vWF : Ag X CB/100 and Rcof in plasma samples from patients with normal adult

，

Hemophilia A and von Willebrand disease

Collagen vWF: Ag vWF:AgXCB/IOO Rcof binding(CB)

(%) (%) (%) (%) Normal adult (n=50) 84.0‑98.1 49‑220 44.7‑210^目8 56‑240

(93

. 4 : 1 :

2.6) (122.2

士

34.

1 )

014.4

士

33.2) 020.0

士

3

1 .

3) Hemophilia A (n=27) 9

1 .

0‑98.7 66‑353 98.6‑332.5 112‑360

(97.0

士1.8)

08

1 .

6

士

75.6) 075.3

土

70.8) 078.7

士

62.0) von Willebrand dis巴ase

Type 1 (n=9) 83.6‑90.0 6‑38 5.2‑4

1 .

2 5‑38 Type IIA

(日二7)

42.0‑77.1 28‑55 11.8‑38.5 <5‑12 Type IIB (n=3) 68.3‑80.2 56‑68 40.3‑54.4 48‑56 Type IIC (n=

1 )

35.8 48 17.2 <5

(mean

土

SD)

(4)

あった.

vWF: Ag X collagen 結合 /100 は 98.6%~ /ml

においては

smallestbend

の陰影がやや薄くなり，

332.5 % 075.3

士

70.8

%)で

Rcof

活性とよく相関して

3

1 .

2μg/ml

では

smallest band

は消失し

larger~inter-

いた

(r=0.95). mediate bands

が出現した.

Heated collagen

および生

2. Collagen

結合後の上清及び沈

i

査よりの溶出物におけ食と反応後の沈漬では明かな

multim

巴

rs

巴

ri

巴

S

は出現しる

multimer

構成なかった.希釈血援の上清中

vWFmultimer

は検体中の各種濃度の

collagen

と反応後の上清及び

collagen~こ vWF: Ag

量の低下にともない各

collagen

濃度におけ吸着された沈澄よりの溶出物だおける

multimer

構成にる

higherbands

が出現しにくくなり，逆に沈潰よりの溶っき検討した. 出物の

multimer

は原液では出現しにくかった

smaller

成人ヒトプーノレ血撲を生食で

50

% ，

20

%に希釈しこ

~intermediate bands

が低い

collagen

濃度においてもれらを終濃度

31.2

，

125

，

500

および

750μg/ml

の

col‑

明瞭に出現した

CFig.2).

lagen

および

heatedcollagen

，生食と

15

分間反応せし

Typ

巴

1vWD

患者血塁走中の

vWF

は正常の

vWF

とめた.反応上清

10μl

あるいは

O.OlMPBS

にて

3

回洗浄

同様 0.9~20X 106 dalton

に及ぶ

multimerseries

より成後の沈溢をオートラジオグラフィの試料とした.上清のり立っていたが，個々の

multimerband

の濃度は正常の成人ヒトプーノレ血柴原液においては

collagen

濃度

750

それに比し薄かった.

Collag

巴

n

と反応後の上清中のおよび

500μg/ml

では

smallest muitimer

のみが，

col‑ multimer

は，

collagen

濃度

750μg/ml

では

smallest lagen

濃度

125μg/ml

では薄い

2ndmultimer

が出現し

band

のみが，

collagen

濃度

3

1 .

2μg/ml

では，

intermedi‑

31. 2，u g/ml では smaller~intermediatebands

が出現し

ate band

までが出現した.溶出物では成人ヒトプーノレ血た.

Heated collagen

および生食と反応後の正常プール援と同様各種濃度の

collagen

で上清中より消失した

血援では 0.9~20X 106 dalton

に至る

multimerseries

が

multimer series

が出現した.

出現した.沈溢よりの溶出物の

vWFmultimer

は上清の

Typ巴 IIA 患者血媛中の vWF は分子量 0.9~5X106

それとは逆に

collagen

濃度が

750

および

500μg/ml

で

dalton

の範囲内に

4

本の

smallermultimer

の

bands

がは全

multimers

巴

ries

が出現し，

collagen

濃度が

125μg

出現した.このうち上部の

2

木の

band

の陰影は薄かっ

E l u s I o n

‑10XW

A ₁ _.

_0X

1 0 "

‑IOx 1 0 "

B

ω

1 .

0><

1 0 "

ω10>< 10"

c

時l. DX1 0

⁶

2

3 4 5

告 2

3 4 5

^告

Fig. 2. Multimer analysis in the supernatant and

巴

lutionafter collagen binding with variously di1uted normal plasma.

A^目undi1ut

巴

dplasma

，

B : 1^目1diluted with saline

，

C: 1 : 5 dilut

巴

dwith saline

，

1 : control sample plasma

，

2 :750μg/ml of heat

巴

dcollagen

，

3 : 3

1 .

2μg/ml of collagen

，

4 : 125μg/ml of collagen

，

5: 500 ，

u

g/ml of collagen， 6^目 750μg/mlof collagen.

緒 言 von Willebrand

奈医誌(].

，

，平

因子

のヒト

への結合に関する研究

血築中の

結 合

奈良県立医科大学小児科学教室 西 久 保 敏 也

ぬ

，

1 1

.

羽

，

，

，

i 1

，

，

病

D)は出血時間の延長と皮膚

粘膜の出血を主徴とする常染色体遺伝性疾患で，今日，

本疾患はヒト常染色体

. l

の

因子遺伝

の欠陥による

蛋白の量的ないし

質的合成障害症として把握されている問問.

ヒト血築中の

は

アガロースゲノレ電気泳動 法 の 解 析 で

に お よ ぶ

巴

の

よ り な る こ と が 観 察 さ れ ， こ の 所 見 は

の 病 型 分 類 に 用 い ら れ 、 現 在

は

蛋白〉は低下するも

巴

の各

は正常 血援のそれらと同様に存在する

巴

，

は 必ずしも低下しないが

巴

構成に異常のみられる

，

が欠如し全ての

を欠く

に大別されている

巴

は

蛋白の量 的合成障害症と考えられ，一方，

は

蛋白の 量的ならびに質的異常が存在するもので，

，

，

，

，

，

，

，

および

と呼ばれる

が報告されている.

は血竣

の量的 欠陥症で常染色体劣性に出現する病型である

の 機 能 と し て

で は 抗 生 剤 の 一 種 の

，あるいは蛇毒製剤

存在下に血小 板膜上糖蛋白

に結合することが明らかにさ れている

ではヒト動脈内皮下組織への血小 板 粘 着 ， 血 栓 形 成 は

を 介 し て 行 わ れ る こ と が

l .

l .

によって観察された.

緒言 von Willebrand

^，

^，平

結合

奈良県立医科大学小児科学教室西久保敏也

^の

^因子遺伝

アガロースゲノレ電気泳動法の解析で

におよぶ

よりなることが観察され，この所見は

の病型分類に用いられ、現在

は正常血援のそれらと同様に存在する

は必ずしも低下しないが

蛋白の量的合成障害症と考えられ，一方，

蛋白の量的ならびに質的異常が存在するもので，

の量的欠陥症で常染色体劣性に出現する病型である

の機能として

では抗生剤の一種の

存在下に血小板膜上糖蛋白

に結合することが明らかにされている

ではヒト動脈内皮下組織への血小板粘着，血栓形成は

を介して行われることが

を吸着することを報告し，

も同様の作用を示すことを観察した.これらの観察は主に純化

，血小板

結合の簡易測定法ではない.

より得た

各種患者および血友病

患者血媛中の

結合につき

構成の変化とあわせて検討したので報告する.

例，

例，

例，

例について検索した.また正常成人男女それぞれ 5 人の血援を等量ずつ混和しプール血援を作製した.

病患者および血友病

患者の各々肘静脈よりすみやかに採取した全血

容の入ったプラスチック製試験管に加えて混和し，

分間遠心しクエン酸血撲を得た.これらの血援を小量ずつ

で保存した.

次抗体とし，ベノレオキシダーゼ標識抗

次抗体としたサンドウィッチ

を用いた肉眼的血小板凝集法

懸濁液の作製乾燥