ウイロイドの病原性を制御する構造ドメインの解析

(1)

(研究課題番号

05660042)

平成

6

年度科学研究費福助金(一般研究

C)

研究成果報告書

平成

7

年度

3

jJ

研究代表者佐野輝男

〈弘前大学農学部助教授〉

(2)

研究代表者佐野輝男研究経費

平成

5

年度平成

6

年夏

計

研究発表

(学会館、福)

(弘前大学農学部・助教授)

エ

，

700

千円

400

千円

2 ， 100

千円

佐野輝男: ウイロイド

( V i r o i d ) / h e p a t i t i s d

との関連、ウイルス

44

巻、

2 7

・

3 4

、

1 9 9 4 .

設野輝男; ウイロイドの病原性発現機構の解析と弱帯化の可能性について、

平成

5

年度文部省特定研究 f有用敏生物資諜の探索と生物環境制御への応用」、

6 6

^欄

7 2

、

1 9 9 4 .

石黒苑; ウイロイドの病震性についての研究弘能大学農学部植物病理学研究室平成る年度卒業論文相頁

(口頭発表)

Sano

，

T .

，

C a n d r e s s e

，

T .

，

Hammond

，

R.W.

，

D i e n e r

，

T . O . and Owens

，

R . A . : I n v e s t i g a t i o n o f s t r u c t u r a l d o m a i n s r e g u l a t i n g v i r o i d p a t h o g e n i c i t y . 6 t h I n t e r n a t i o n a l C o n g r e s s o f P l a n t P a t h o l o g y

^芦

M o n t r e a l

，

Canada

，

1 9

ヲ

3 . 8 .

佐野輝男、石黒亮; ホップ媛北ウイロイド

(HSVd)

繕カンキツエクソ立ーテイスウイロイド

(CEVd)

間キメラウイロイドの捜製能と病原性、平成

5

年東日本接物病理学会東北部会

( 1

ヲ

9 3 . 1 0 )

佐野輝男、石黒亮、Ow

e n s

，

R.A:

ウイ

g

イドの病原性と講造ドメイン、第

1 6

回日本分子生物学金大会(1

9 9 3 1 2 )

石黒亮、佐野輝男、Ow

e n s

，

R.A:

ウイロイドの右末端領域

(TR

ドメイン) の組換えと病徴、捜製最の変化、事成

6

年度目本植物病理学会東北部会

(1

9 9 4 . 1 0 )

佐野鱒男、石黒亮、Ow

e n s

，R.

A . :

ウイロイドの病原性と右末端領域

(TR

ドメイン)の解析、第

17

四日本分子生物学会大会

( 1 9 9 4 .1 2 )

(3)

日次

第 1

章、ホップ媛化ウイロイド

(HSVd)

とカンキツエクソコーチイスウイロイド

(CEVd)

問キメラウイロイドの複袋詰と病原性の解析……ー……暢

1

( 1 )共通の制限静索認識部位を用いた講造ドメイン組換えの機略

( 2 )

実験方法

A

、キメラウイロイド

(HS/CE‑TR

と

CE /H S‑TR)作製手J l

国日、感染性試験

(3)実験結果

A

、HS/CE.TRの惑染性

B

、C

E / 狂 S.TR

の感染性

〈

二

C

EfH

S

羽と郎 / 白・TRの複製能と病原性

第

2

章、カンキツニにクソ口ーテイスウイ uイド

(CEVd)

とトマト

a p i c a ls t u n t

ウイロイド

(TASVd)

間キメラウイロイドの被製能の解析 …一‑‑‑‑‑‑…闘 7

(1) PCR

法による構造ドメイン組換えの概略

( 2 )実験方法

A

、キメラウイ口イド

(CE/AS‑TR)

作製手J

I

彊日、感染性試験

( 3

)実験結果

A

、

CE/AS

^幽

TR

の感染性

まとめと考察一一一一一一一一一一一一一一一…一一…一一一一一一一

1 0 ( 1

)ウイロイドの組換えと

2

次構造について

( 2 )

ウイロイドのお末端領域

(TRドメイン)の機能について

実験ブn ト口ール

1 、 DoubleR e s t r i c t i o n Enzyme D i g e s t i o n o f P l a s m i d DNA 2 ， DNA

断片をグんから回収する方法

3

、ゲルから回収した

DNA

断片のLi

g a t i o nとPCR

による増幅

4

、トランスフォーメーション(形質転換)

5

、cDNA接種試験方法話、ウイロイド抽出法

7

、DIG標識

RNA

プロープによるハイプヲダイゼーション(1

9 9 5

，

3 . 2 4

版〉

8

、DIGTa

Q .

Cy

c l e Se Q . u e n c i n g P r o t o ω l

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

第

1

輩、ホップ媛化ウイロイド

(HSVd)

とカンキツエクYコーテイスウイロイド

(CI 三 Vd)

問キメラウイ口イドの複製誌と病原性の解折

( 1

)共通の制限醇燕認識部位を用いた様透ドメイン組換えの接略

CEVd

と

HSVd

のcDNAには共に可変額域

(V

ドメイン〉と右末端領域

(TR

ドメイン)の境界に

S a cI I

， pvu

1 2

種類の制限酵素認識譲位が在り、この

2

つの制限醇素を利用して弱者の

TR

ドメインを交換することが可能である。プラスミド

p B l u e s c r i p tI I SK

付のBamHI部設に挿入されたHSVdのBamH

l1

ユニット

cDNA

(以下

p B S ‑ I ‑ おろ

と略す)と

pUC9

の

BamHI

部位に挿入された

CEVd

のBa

mHl1

ユニット

cDNA(

以下

pa15‑6

と略す)から、図

1a

、

1b

に示したように再ウイロイド

cDNA

間でTR

ドメインの交換を行なって、キメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑HS/CE‑ TR

及び

pBS‑CE /H S ‑ TR

を作製した。

(2)

実験方法

A

キメラウイロイド<D

NA

クローン信班活α:‑TRと丘&EII‑即時作製手!頓

1 ) Bam HI ‑

pvu

1

断片の謂袈

供試したプラスミド

DNA

は、約

5 ， . . . ̲ 1 0

mlの

l

晩培養抜から

QI

Ap

r c

手

Sp 出 P l a s m i d

玄 i t ( 5 0 ) (QIAGEN

社)を舟いて抽出し、最接的に

l

∞

^u ^l

^{の減蓄蒸留水}

^(DW)

^に

溶解したものを用いた。

まず、プラスミドDNAを制限酵素(Ba

mHI

とPvuI)で実験ブロトコール

l

の要領で切断した。

次に、

5

協ポリアクジノレアミドゲル電気詠動

(PAGE)

に積み、

1

倍

TAE

緩衝液、

250V

、2SmAの条件で、マーカ一色素中のブロムブエノ…ルブルー(速く泳動する方)がゲノレの

4/5

謹疲移動するまで泳動した。

桑化エチジウム溶波

( 1ug

/ml) でゲノレを

2

^脚

3

分染色後、トランスイルミネーター上で目的のバンドを切り取り、実験プロトコーノレ

2

の要韻でゲ/レから回収した。

なお、回収したDNA断片のサイズは、

pBS‑HS‑3

から

186bp

と1

1 1bp

、pCE15‑3から

245bp

と

1 2 6

切であった。

(4)

第 l

(HSVd)

とカン存ツこにクソコーテイスウイ口イド

(CEVd)

閤キメラウイロイドの短袈能と病原性の解析一一一一…・

1 ( 1

)共通の制限酵素認識部位を用いた構造ドメイン組換えの捜略

( 2 )

実験方法

A

( H S / C E ‑ T R

と

CEIHS‑TI

ミ)作製手

1 I

頃

B

、感染性試験

(3

)実験結果

A

、

HS/CE

^暢

TR

の感染性 B.

C

ElH

S‑TR

の感染性

C

、

CFAS‑TR

と

HS/CE

・

TR

の複製能と病原性

第

2

輩、カンキツこにクソローチイスウイロイド

(CEVd)

とトマト

a p i c a ls t u n t

ウイロイド

(TASVd)

閤キメラウイロイドの捜製能の解薪ー…一…ー…

7 (1) PCR

法による構造ドメイン組換えの模略

( 2 )

実験方法

A、キメラウイロイド

( C E / A S

^輔

TR)

作製手

l J

譲

8

、感染性試験

(3

)実験結果

A

、

CE 治 S‑TR

の感染性

まとめと考察一一一一一一一…一一一…ー…ー…一一一一一一一一一一

1 0 ( 1

)ウイ口イドの組換えと

2

次構造について

(2)ウイロイドの右末端領域

(TR

ドメイン)の機能iこついて

実験プ口トコール

し

DoubleR e s t r i c t i o n Enzyme D i g e s t i o n o f P l a s m i d DNA 2 ， DNA

断片をゲノレから回収する方法

3

、ゲノレから回収した

DNA

断片の

L i g a t i o n

と

PCR

による増幅

4

、トランスフォーメーション(形費較換)

5 . . cDNA

接種試験方法 G、ウイロイド抽出法

7

、

DIG

標識

RNA

プnーブによるハイブリダイゼーシヨン

( 1 9 9 5

，

3 . 2 4

按)

8 、 DIGTaq

Cy

c l e S e q u e n c i n g P r o t o

∞

i

ウイロイドの織原性と措迄ドメイン

第

1 (HSVd)

c!: jJンキツ

z

クソコ…テイスウイロイド

(CEVd)

閤キメラウイロイドの複袈能と病原性の解析

( 1

)共通の制罷静索認識部位を用いた構造ドメイン組換えの繍首長

CEVd

と

HSVd

の

cDNAr

こは共に可変領域

(V

ドメイン)と布末端韻域

(TR

ドメイン)の境界に

Sac

II，行

u1 2

種類の制捜酵素認識部位が在号、この

2

つの事

j

躍醇素を利用して両者の

TR

ドメイン在交換することが可能である。プラスミド

p 日 l u e s c r i p t

II

SK

付の

BamHI

部位に挿入された

HSVd

のBamH

l1

ユニット

cDNA

(以下

pBS 寸 5

・

3

と略す)と

pUC9

の

BamHI

部位

ζ

挿入された

CEVd

のBa

mHll

ユニット

cDNA

(以下

pCE15

‑6と略す)から、図

1a

、

1b'

こ示したよう

ζ i

凋ウイロイド

cDNA

関です

R

ドメインの交換を行なって、キメラウイロイド

cDNA

クローン

pB ら H S / C E ‑ l 1

ミ及び

pB ふ CEJHS‑TR

を作製した。

( 2 )

実験方法

A、キメラウイロイド心NA クローン包惑を&巴:rnとIffiO牙歪~TR) 作製手I1頃

1 )

Ba

m H

トPvu

I

断片の調製

DNA

は、約

5. . ̲ 1 0 m l

の

l

娩培養譲から

QI

Ap

r e pS p i n P l a s m i d

Ki

t ( 5 0 ) (QIAGEN

社)を用いて抽出し、最接的に

1

∞

^u ^l

^{の滅菌蒸留水}

^(DW)

^に

溶解したものを用いた。

まず、プラスミド

DNA

を制限酵素(話

amHI

とPvuI)で実験プロトコ…ノレ

1

の要領で切断した。

次に、

5 %

ポリアクヲノレアミドゲ/レ電気泳動

(PAGE)

に積み、 i接

TAE

緩祷液、

250V

、2

5

mAの条件で、マーカ一色素中のプロムフェノーノレプノレー(速く泳動する方)がゲノレの

4/5

程度移動するまで泳動した。

臭化エチジウム溶液

( 1ug

I

m l )

でグルを

2

・

3

分染色後、トランスイルミネーター上で詩的のバンドを切号取り、実験プロトコール

2

の婆領でゲノレから回収した。

なお、回収した

DNA

断片のサイズは、

pBS‑HS‑3

から

186bp

と

ll1bp

、

pCE15‑3

から

245bp

と

1 2 6

切であった。

(5)

2)組換え中間体の作成

HSVd

の

1 8 6bp

断片と

CEVd

の

2 4 5bp

断片、及び

HSVd

の

1 1 1bp

断片と

CEVd

の

126bp

断片を

T4DNA

リガーゼで結合後、Ba

m HI

で切断し、

p B l u e s c r i p tI I SK(

・)の

BamHI

部位に挿入して、

4 3 1

l::pと

237

l::pの組換え中間体を作成した。

大腸菌(E.∞

l i 1M 1 0 9 )

を形質転換しそれぞれ

1

∞以上のコロニーを得たので、

各

1 2

個を選んで、アルカリ

‑SDS

法でプラスミド抽出を行い、

1%

アガロースゲル電気泳動及び

5%PAGE

等で確認した結果、組換え中間体

4 3 1bp

が組み込まれているもの

1

クローン

( 4 3 0 ‑ 9 )

、

237bp

2

クローン

( 2 3 8

・

4

，

2 3 8 ‑ 6 )

が得られた。

3)

Ba

mHI

・

S a c I I

断片の調製

上記のクローン

( 4 3 0 ‑ 9

及び

2 3

8‑

4 )

を有する大腸菌約lO

m l

の

1

晩培養液から

QI

Ap

r e p S p i n P l a s m i d

Ki

t

を用いてプラスミド

DNA

を抽出し、最終的に

1

∞叫の滅菌蒸留水に溶解した。

各プラスミド

DNA

を制限酵素

(BamHI

と

SacI I )

で実験プロトコール

1

と同じ要領で切断した。さらに先と同様

5%PAGE

で泳動し、目的のバンドを切り取り、実験プロトコール

2

の要領でゲルから回収した。なお回収した

DNA

430

・

9

から

287bp

と

1 4 4

旬、

2 3

8‑4から

1 7 6

l::pと

57

切であった。

4) pBS‑CE 庁 IS‑TR

の作成

4 3 0

・

9

の

287bp

断片と

2 3 8

‑4の

57bp

断片を

T4DNA

mHI

で切断し、

p B l u e s c r i p tI I SK(

・)の

BamHI

pBS‑CE /H S‑TR

を作成した。

大腸菌(E.∞

l i 1M 1 0 9 )

を形質転換(実験プロトコール

4

)し、

2 1 2

‑SDS

1%

5%PAGE

等で確認した結果、

2

つのクローン (

pBS‑CE /H S‑TR#3

，

#11)

が得られた。

5) pBS‑HS/CE‑TR

の作成

4 3 0 ‑ 9

の

144bp

断片と

238

‑4の

1 7 6bp

断片を

T4DNA

リガーゼで結合後、

S a cI I

切断で欠けた末端のBa

mHI

部位を

PCR

で付加した(実験プロトコール

3)

。これを

BamHI

で切断し、

pBlu

eS

c r i p tI I SK(

・)の

BamHI

pBS‑HS/CE‑ TR

を作成した。

大腸菌(E.∞

i 1M 1 l 0 9 )

を形質転換し

2 1 2

‑SDS

1%

アガロースゲル電気泳動及ひ、

5 %PAGE

5

つのクローン

(pBS‑HS/CE‑TR#1

，

#2

，

#3

，

#5

，

#10)

が得られた。

しかしこの各クローンの塩基配列を確認した結果、上側中央保存領域の上流に

1 3

境基の余分な配列が挿入されていることが明らかになった。この配列を除くため、

p B S ‑ H S / '

仁志・

TR

から

BamHI

切断と

PAGE

によりキメラウイロイドの全長

cDNA

を回収し、自己

l i g a t i o n

後、プライマ

‑HSV73M

と

HSV83M

で

PCR

して、

1 3

塩基の挿入配列を除去し、Xm

aI

で末端を切断して

p B l u e s c r i p tI I SK(

・)の

XmaI

部位に挿入

して

2

つのクローン

pBS‑HS/CE‑ TR #9

、

1 6

を得た。

6)

キメラウイロイド

cDNA

のシークエンシング

作成したキメラウイロイド

cDNA

の塩基配列は、上記の組換え体プラスミド

DNA

を

ALFREDDNA

シークエンサー(フアルマシア社)及び

DIGTaq c y c l e s e q u e n c i n g k i t

(ベーリンガ一社)等を用いて行った(実験プロトコール

8)

。

B

、感染性試験

1) cDNA

接種試験・複製能の有無の検討

A

で作成した

cDNA

を合むプラスミド

pBS‑CE 圧 ‑ I S‑TR#3

，

#11

及び

pBS‑HS/CE

‑TR#13

，

#14

をlO

m l

の一晩培養液から

QIAp r e p S p i n P l a s m i d

Ki

t

で調製し、以下のように

BamHI

で切断してキュウリ(品種;四葉)とトマト(品種;

R u t g e r s )

各

1 0

本に接種した(実験プロトコール

5)

。

2)

ウイロイド

RNA

接種試験・複製能、病原性の比較

1

)で感染が認められた

pBS‑C

ElH

S ‑ TR

接種トマト及び

pBS‑HS/CE‑ TR

接種キュウリから子孫ウイロイド

RNA

を抽出し(実験プロトコール

6)

、

2M

Li

O

可溶性核酸分画を得た。これを

HSVd

接種キュウリ及び

CEVd

接種トマトから抽出した同分画試料と共にリターン

PAGE

にかけ、各試料に合まれるウイロイド濃度を比較し、

全試料の濃度が一定になるように調節した。これを原液として

1 0

希釈液、

1 0 0

倍希

(6)

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

2)組換え中間体の作成

HSVd

の

1 8 6bp

断片と

CEVd

の

2 4 5bp

断片、及び

HSVd

の

1 1 1bp

断片と

CEVd

の

126bp

断片を

T4DNA

m HI

で切断し、

p B l u e

町

i p tI I SK(

・)の

BamHI

4 3 1t p

と

237tp

の組換え中間体を作成した。

大腸菌(E.∞

l i JM 1 0 9 )

を形質転換しそれぞれ

1

各

1 2

‑SDS

1%

5%PAGE

等で確認した結果、組換え中間体

4 3 1bp

1

クローン

( 4 3 0 ‑ 9 )

、

237bp

2

クローン

( 2 3 8

・

4

，

2 3 8 ‑ 6 )

が得られた。

3)

Ba

mHI

・

Sa

cI

I

断片の調製

上記のクローン

( 4 3 0 ‑ 9

及び

2 3 E ト 4 )

を有する大腸菌約lOmlの

1

晩培養液から

QI

Ap

r e p S p i n P l a s n u d

Ki

t

を用いてプラスミド

DNA

を抽出し、最終的にl∞

u l

の滅菌蒸留水に溶解した。

各プラスミド

DNA

を制限酵素

(BamHI

と

Sac1

1)で実験プロトコール

1

と同じ要領で切断した。さらに先と同様

5%PAGE

で泳動し、目的のバンドを切り取り、実験プロトコール

2

の要領でゲルから回収した。なお回収した

DNA

430

・

9

から

287bp

と

1 4 4

旬、

2 3

8‑4から

176tp

と

57

切であった。

4) pBS‑C

E!H

S‑TR

の作成

4 3 0 ‑ 9

の

287bp

断片と

238

‑4の

57bp

断片を

T4DNA

mHI

で切断し、

p B l u e s c r i p tI I SK( ‑

)の

BamHI

pBS‑CE /H S ‑ TR

を作成した。

大腸菌(E.∞

l i JM 1 0 9 )

を形質転換(実験プロトコール

4

)し、

2 1 2

個を選んで、アルカリ・

SDS

1%

5%PAGE

2

つのクローン (

pBS‑CE 庁 ‑ I S‑TR#3

，

#11)

が得られた。

5) pBS‑HS/CE‑ TR

の作成

4 3 0 ‑ 9

の

144bp

断片と

238

‑4の

176bp

断片を

T4DNA

リガーゼで結合後、

S a cI I

切断で欠けた末端のBa

mHI

部位を

PCR

で付加した(実験プロトコール

3)

。これを

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

BamHI

で切断し、

pBlu

eS

c r i p tI I SK(

・)の

BamHI

pBS‑HS/CE‑ TR

を作成した。

大腸菌(E.∞li

JM 1 0 9 )

を形質転換し

2 1 2

‑SDS

1%

5 %PAGE

5

つのクローン

(pBS‑HS/CE‑TR#l

，

#2

，

#3

，

#5

，

#10)

が得られた。

しかしこの各クローンの塩基配列を確認した結果、上側中央保存領域の上流に

1 3

塩基の余分な配列が挿入されていることが明らかになった。この配列を除くため、

pBS‑HS/CE‑TR

から

BamHI

切断と

PAGE

によりキメラウイロイドの全長

cDNA

を回収し、自己

l i g a t i o n

後、プライマー

HSV73M

と

HSV83M

で

PCR

して、

1 3

塩基の挿入配列を除去し、Xm

aI

で末端を切断して

p B l u e s c r i p tI I SK(

‑)のXm

aI

部位に挿入

して

2

つのクローン

pBS‑HS/CE‑TR #9

、

1 6

を得た。

6)

キメラウイロイド

cDNA

のシークエンシング

作成したキメラウイロイド

cDNA

の塩基配列は、上記の組換え体プラスミド

DNA

を

ALFREDDNA

シークエンサー(フアルマシア社)及び

DIGTaq c y c l e s e q u e n c i n g k i t

(ベーリンガ一社)等を用いて行った(実験プロトコール

8)

。

B、感染性試験

1) cDNA

接種試験・複製能の有無の検討

A

で作成した

cDNA

を含むプラスミド

pBS‑CE 圧 f S ‑ TR#3

，

#11

及び

pBS‑HS/CE

‑TR#13

，

#14

をlOmlの一晩培養液から

QIAp r e p S p i n P l a s n u d

Ki

t

で調製し、以下のように

B

^副

nHI

で切断してキュウリ(品種;四葉)とトマト(品種;

R u t g e r s )

各

1 0

本に接種した(実験プロトコール

5

)。

2)

ウイロイド

RNA

接種試験・複製能、病原性の比較

1

)で感染が認められた

pBS‑C

E!H

S‑TR

接種トマト及び

pBS‑HS/CE‑ TR

接種キュウリから子孫ウイロイド

RNA

を抽出し(実験プロトコール

6)

、

2Mli α

可溶性核酸分画を得た。これを

HSVd

接種キュウリ及び

CEVd

接種トマトから抽出した同分画試料と共にリターン

PAGE

にかけ、各試料に合まれるウイロイド濃度を比較し、

全試料の濃度が一定になるように調節した。これを原液として

1 0

希釈液、

1 0 0

倍希

(7)

釈液を作成して接種源とし、

1

)と同様にしてキュウリとトマト各

1 0

本に接種した。

接種植物は、

2 5

・

28C

、

1 6

時間照明の培養器内で培養し、接種後

5

週目まで病徴観察を行うと共に、各個体から

1

週間毎に葉を径

8nun

のコルクポーラーで打ち抜き採集した。採集した葉は接種源別に

1

本の微量遠心用チューブにまとめ、子孫ウイ

ロイドを抽出し、ウイロイド増殖量(感染葉中の濃度)の比較検定に供試した。

( 3

)実験結果

A

、CEIHS‑TRの感染性

BamHI

で切断したキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS

・

C

ElH

S‑TR

をトマト及びキュウリに接種した結果、接種後約

4週間目にトマトの上葉に脈壊痘を伴う葉巻

症状が現われ、全身に軽い媛化症状が現われた。キュウリには異常は認められなかった。

接種

6

週間自にトマト発病個体の上葉を刈り取り、ウイロイド抽出法に準じて

2M L i C I

可溶性核酸分画を得た。これをリターン

PAGE

で検定したところ

HSVd

とも

CEVd

とも異なる位置にウイロイド特有の環状

RNA

のバンドが現われた。また、

DIG

標識した

CEVd

の

RNA

プロープを用いてハイプリダイゼーシヨン法(実験プロトコール

7)

により検定したところ陽性の反応を得た。

さらにリターン

PAGE

で純化したウイロイド様環状

RNA

分子を

HSVd

，

CEV

，d

ASSVd

等既知のウイロイドと

8M

尿素を合む

5%PAGE

で同時に泳動して分子サイズの比較を行った結果、約 340ヌクレオチドと推定され、これはキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑α:JHS‑TR

から生じるキメラウイロイドのサイズとほぼ一致した(図

3

)。

以上から構築したキメラウイロイドの感染がほぼ確認されたので、この

RNA

から

cDNA

を合成し、

p B l u e s c r i p tI I SK(

・)にクローニングして塩基配列の解析を行った。

その結果、接種したキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑CE /H S ‑ TR

から生じたキメラウイロイドがトマトの中で安定に増殖していることが確認された。この新しいキメラウイロイドをCEIHS‑TRと名付けた(図

1 c )

。

B

、HS/CE‑TRの感染性

BamHI

cDNA

クローン

pBS‑HS/CE‑ TR

をトマト及

びキュウリに接種した結果、接種後約

3

週間目にキュウリの上葉に媛化、葉巻症状が現われた。トマトには異常は認められなかった。

接種

6

週間目にキュウリ発病個体の上葉を刈り取り、ウイロイド抽出法に準じて

2M L i C I

可溶性核酸分聞を得た。これをリターン

PAGE

HSVd

ともCEVdとも異なる位置にウイロイド特有の環状

RNA

DIG

標識した

HSVd

の

RNA

プロープを用いてハイプリダイゼーシヨン法により検定したところ陽性の反応を得た。

PAGE

RNA

分子を

HSVd

，

CEVd

，

ASSVd

8M

尿素を合む5%PAGEで同時に泳動して分子サイズの比較を行った結果、約

3 2 5

ヌクレオチドと推定され、これはキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑HS/CE‑TR

3)

。

RNA

から

cDNA

を合成し、

pBlue

町

i p tI I SK(

ー)にクローニングして塩基配列の解析を行った。

cDNA

クローン

p B S ‑HS/CE‑TR

から生じたキメラウイロイドがトマトの中で安定に増殖していることが確認された。この新しいキメラウイロイドを

HS/CE‑TR

と名付けた(図

1c )

。

C

、CE

/H S‑TRとHS/CE‑TR

の病原性と複製能

前項で述ベたように

HSVd

と

CEVd

閣で右末端領域

(TR

ドメイン)を交換したキメラウイロイド

CE 庁 IS‑TRと HS/CE‑TR

はそれぞれトマトとキュウリで安定に増殖することが明らかになった。そこでこの新しい

2

種のキメラウイロイドの病原性と増殖量(複製能)を検討するため、親ウイロイドである

HSVd

及び

CEVd

と共にトマトとキュウリに接種した。方法で述べたように各接種源中のウイロイド濃度を一定にし、原液とその

10

倍希釈液をそれぞれトマトとキュウリ各

10

本ずつに接種

した。

外部病徴観察の結果得られた発病個体数の推移を図

4

に示した。

HSVd

及び

HS/CE‑TR

を接種したキュウリと

CEVd

及び

CE /H S‑TR

を接種したトマトに媛化、

葉巻、茎壊痘等の病徴が現われた。キメラウイロイドの病徴は基本的には一方の親ウイロイドと同じで、

HS/CE

・

TR

は

HSVd

と、

CE 圧 ‑ I S

・

TR

は

CEVd

とほぼ同様の病

(8)

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

釈液を作成して接種源とし、

1

)と同様にしてキュウリとトマト各

1 0

本に接種した。

接種植物は、 2s・

28C

、

1 6

時間照明の培養器内で培養し、接種後

5

週日まで病徴観察を行うと共に、各個体から 1週間毎に葉を径 8mmのコルクポーラーで打ち抜き採集した。採集した葉は接種源別に 1本の微量遠心用チューブにまとめ、子孫ウイ

ロイドを抽出し、ウイロイド増殖量(感染葉中の濃度)の比較検定に供試した。

( 3

)実験結果

A

、

CEIHS‑TR

の感染性

BamHI

cDNA

クローン

pBS‑CE 庁 IS‑TR

をトマト及びキュウリに接種した結果、接種後約

4

週間目にトマトの上葉に脈壊痘を伴う葉巻症状が現われ、全身に軽い媛化症状が現われた。キュウリには異常は認められなかった。

接種

6

週間目にトマト発病個体の上葉を刈り取り、ウイロイド抽出法に準じて

2M L i C l

PAGE

HSVd

とも

CEVd

RNA

DIG

標識した

CEVd

の

RNA

プロープを用いてハイプリダイゼーション法(実験プロトコール

7)

により検定したところ陽性の反応を得た。

PAGE

RNA

分子を

HSVd

，

CEV

，d

ASSVd

8M

尿素を合む

5%PAGE

で同時に泳動して分子サイズの比較を行った結果、約

3 4 0

ヌクレオチドと推定され、これはキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑CEIHS‑ TR

3)

。

RNA

から

cDNA

を合成し、

p B l u e s

ぽ

i p t1 1 SK(

cDNA

クローン

pBS

・

CEIHS

・

TR

から生じたキメラウイロイドがトマトの中で安定に増殖していることが確認された。この新しいキメラウイロイドを

CEIHS‑TR

と名付けた(図

1c )

。

B

、

HS/CE

・

TR

の感染性

BamHI

cDNA

クローン

pBS‑HS/CE‑ TR

をトマト及

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

びキュウリに接種した結果、接種後約

3

週間目にキュウリの上葉に媛化、葉巻症状が現われた。トマトには異常は認められなかった。

接種

6

週間目にキュウリ発病個体の上葉を刈り取り、ウイロイド抽出法に準じて

2M L i C l

PAGE

で検定したととろ

HSVd

とも

CEVd

RNA

DIG

標識した

HSVd

の

RNA

プロープを用いてハイプリダイゼーション法により検定したところ陽性の反応を得た。

PAGE

RNA

分子を

HSVd

，

CEVd

，

ASSVd

8M

尿素を合む

5%PAGE

で同時に泳動して分子サイズの比較を行った結果、約 325ヌクレオチドと推定され、これはキメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS‑HS/CE‑TR

3

)。

RNA

から

cDNA

を合成し、

p B l u e s c r i p t1 1 SK(

cDNA

クローン

p B S ‑HS/CE‑ TR

から生じたキメラウイロイドがトマトの中で安定に増殖しているととが確認された。この新しいキメラウイロイドを

HS/CE‑TR

と名付けた(図

1c )

。

C

、

CEIHS‑TR

と

HS/CE‑TR

の病原性と複製能

前項で述べたように

HSVd

と

CEVd

間で右末端領域

(TR

ドメイン)を交換したキメラウイロイド

C

F1H

S‑TR

と

HS/CE‑TR

はそれぞれトマトとキュウリで安定に増殖することが明らかになった。そこでこの新しい

2

種のキメラウイロイドの病原性と増殖量(複製能)を検討するため、親ウイロイドである

HSVd

及び

CEVd

と共にトマトとキュウりに接種した。方法で述ベたように各接種源中のウイロイド濃度を一定にし、原液とその

10

倍希釈液をそれぞれトマトとキュウリ各

10

本ずつに接種

した。

外部病徴観察の結果得られた発病個体数の推移を図

4

に示した。

HSVd

及び

HS/CE‑TR

を接種したキュウリと

CEVd

及び

CE 庁 ‑ I S

・

TR

を接種したトマトに媛化、

葉巻、茎壊症等の病徴が現われた。キメラウイロイドの病徴は基本的には一方の親ウイロイドと同じで、

HS/CE‑TR

は

HSVd

と、

CE 圧 ‑ I S‑TR

は

CEVd

とほぼ同様の病

(9)

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

徴を示した。しかし、キメラウイロイドの病徴発現は親ウイロイド比較べ明らかに退く、親ウイロイドの 10信希釈接種諜と間程度の病原性と考えられた。このキメラウイロイドの病第性の低下は増難童(複製能〕の議下によるものと考えられ、接種縞物から経時的に試料を採集してハイプヲダイゼーシヨンにより検定した結果は、

感染植物中のキメラウイロイド漫度が親ウイ口イドに較べ1遅問緯度遅れて立ち上がってくることを示した〈国

5

)。つまりキメラウイロイドは

TR

ドメインの交換により増嫌量(護製能)が低下し、その結果として発病が濡れたことを意味しており、

TR

ドメインはウイ口イドの増嫌最(被袈能)に強く関与しているものと考えられた.

また

CEVd

及び

α lHS‑TR

を接種したキュウりと、

HSVd

及び

H S / C E ‑ T R

を接種したトマトには外部病撤観察では異常が認められなかった(図的。しかしこれらの接種撞物から先と同様iこ経時的に試料を採集してハイプヲダイゼーション検定を狩なった結果、興味深いことにいずれの植物からも接種した各キメラウイロイド或はウイロイドの感染が確認され、無病被感染していることが確認された。感染植物体中の各ウイロイドの増殖蓋はキュウリでは

HSVd

、

H S / C

らす良、

CEVd

、

CE /H S ‑ I R

，の

1 1

冨に多く、

HSVd

を

1

∞とした時以下

1 1

聞に

5 0

、

50‑0

、

1‑0

であった。

またトマトでは

CEVd

、

C E I H S ‑ T R

、

HSVd

、

HS

だ

E ‑ T R

の順に多く、

CEVd

を

l

∞ とした時以下服に

2 5

、

5 " 1 ‑ ‑ 0

であった。ただし、接種試験は

2

度、部分的には

3

度繰り返して行なったが、

CEVd‑

キュウリ、

C

FiH

S ‑ T R ‑

キュウリ及び

H S / C R ‑ T R

・

トマトの場合はよく増殖する場合とほとんど増殖が認められない場合があり、増殖量が一定せず、さらに検討を要する。

ウイロイドの病原牲と講造ドメイン

第

2j

君、カンキツ広クソ

3

ーテイスウイロイド

(CEVd)

左トマト

a p i c a l s t u n tウイロイド間キメラウイロイドの複製能の解析

( 1 ) PCR

法による構造ドメイン組換えの概略

CEVd

や

HSVd

の場合と異なり、

TASVd

のcDNAの可変領域

(V

ドメイン)と右末端領域

(TR

ドメイン)の境界には

2

次構造下方のpvu

1

謡識部位は存症するが、上側の

S a c

II認識部位が存在しない。従って市

j

限酵素のみで・両者の

TR

ドメインを交換することが出来ない。そこで本試験では図2に示したように4種類のP

む

R用ブライマ…を作成し、

CEVd‑cDNA

の

TRドメインを TASVd‑cDNA

の

TRドメインで

換し、キメラウイロイド

cDNA

クローン

p

部・

CFJAS‑τR

を作製した。

(2

)実験方法

A

cDNA

クローン

( p B S ‑ C E / A S ‑ T R l )

作製手

I J

置

換拭したブラスミド

DNA

は、約

5

‑lOmIの

1

晩培養抜からQIAPrepS

p i n P l a s m i d

悶

t

を用いて抽出し、最終的に1∞

^u ^l

の滅菌蒸留水記溶解したものを用いた。

上記の方法で抽出した

TASVd

の会長

cDNA

pA

おそ詩型にしてプライマ

‑ C

五

AS

・

1 3 5 P

とCEAS・

229M

でPCRを荷ない

TASVd

の

TR

ドメインに対諒する9

5

切を、またaVdの全長

cDNA

p 句 1 5 ‑ 6

を鋳型にしてプライマー

CEV

・

1

と

CEV‑149M

でPCRを行ない

CEVd

の

2

次構造上郷

123bp

を増幅した

(関

2a )

。なお

PCR

は、

T t hDNA p o l y m e r

ぉ

e

を用い、

5 0u l

の反応系で

94C

，

5 m i n .

を

1

サイクル、

94C

，

1 m i n .

^働

55C

，

2 m i n .

・

72C

，

3m i n .

をおサイクノレ、

72C

，

7m i n .

1サイクノレ行なった。

上記の

PCR

反本液の

2

・

5u l

を

5 協 PAGE

で検定した結果、共に期待される長さの単

一

^DNA

断片の増幅が確認されたので、各PCR反応液

2u l

をブライマ…

CEV‑l

と

CEAS‑229M

で

PCR

して

2

つの

DNA

断片を結合させCEVdと

TASVd

のキメラ

2 0 3

ゅの

DNA

断片を増幅した(図

2a )

。なお

PCR

は上記の方法に準じて行なったが、アニーリング温度を

55C

から

40Cf

こ下げて行必った。

上記の

PCR

反応壊の

2‑ 5 u l

を

5%PAGE

で検定した結果、期待される長さの

DNA

断片の増幅が確認されたので、残りの

PCR

反応物をエタノール沈殿後、Ba

mHI

と

行

uI

で切断した(実験ブロトコール

1 )

。反応液をフェノー

f

レ抽出後エタノーノレ沈

(10)

ウイロイドの病原性と構造ドメイン

設を示した。しかし、キメラウイロイドの病徴発現は親ウイロイドに較べ明らかに遅く、競ウイロイドの

10

信希釈接種諜と持程度の病原佳と考えられた。このキメラウイロイドの熊原性の低下は増鶏量(複製能〉の低下によるものと考えられ、接種椋物から経時的に試料を採集してハイプリダイゼーションにより検定した結果は、

感染縞物中のキメラウイロイド濃度が親ウイロイドに較べl遇関軽度遅れて立ちがってくることを示した(図

5)

。つまりキメラウイロイドは

TRドメインの交換

により増殖量(援袈能)が低下し、その結果として発病が漣れたことを意味しており、

TRドメインはウイロイドの増殖量(複製能)に強く関与しているものと考えら

れた。

また

CEVd

及び

CEIHS‑TR

を接種したキュウリと、

HSVdl

えび

HS/CE

^句

TR

を接種したトマトには外部病徴観察では異常が認められなかった(図付。しかし、これらの接種議物から先と同様に経持的に試料を採集してハイプリダイゼーション検定を行なった結果、興味深いことにいずれの植物からも接種した各キメラウイロイド戒はウイロイドの感染が確認、され、無病徴感染していることが確認された。感染植物体中の各ウイロイドの増殖議はキュウりでは司SVd、HS/C

ιTR

、

CEVd

、

C

ElH

S‑TR

の

} I I

匝に多く、

HSVd

を

1

∞とした時以下順に

5 0

、

50‑0

、1‑‑0であった。

またトマトでは

CEVd

、CE丘‑I

S‑TR

、

HSVd

、HS

だ E‑T

玖の

1 I

聞に多く、

CEVd

を1∞ とした時以下"闘に

2 5

、5，

1‑0

であった。ただし、接種試験は

2

度、部分的には

3

度繰り返して行なったが、

CEVι

キュウリ、

C F . / H S‑TR

・キュウリ及び

HS/CR‑

1R‑

トマトの場合はよく増殖する場合とほとんど増殖が認められない場合があち、増殖量が一定せず、さらに検討を要する。

ウイロイドの病原性と講造ドメイン

第

2

章、カンキツ且クソコ…テイスウイロイ F

(CEVd)

とトマト

a p i c a l s t u n tウイロイド関キメラウイロイドの複製能の解折

( 1 ) PCR

法による講造ドメイン総換えの慨略

CEVd

や

HSVd

の場合と異な号、

TASVd

のcDNAの可変領域

(V

ドメイン)と右末端領域

(TR

ドメイン)の境界には 2次構造下方のpvu1認識部位は存在するが、上舗の

S a c

II認識部泣が存在しない。従って制限酵素のみで両者の

TR

ドメインを交換することが出来ない。そこで本試験では国

2

に示したように

4

種類の

PCR

用プライマ…を作成し、

CEVd

^幽

cDNA

の

TRドメイン安 TASVd‑cDNA

の

TRドメインで援

換し、キメラウイロイド

cDNA

クローン

pBS

・

C

町

' A S

・

1

立を作製した。

(2

)実験方法

A

、キメラウイ口イド

cDNA

クローン

(pBS‑CE/AS‑TR

l)作製手

I J

彊

DNA

は、約

5‑10 m l

の

1

腕培養液から

Q

IAp

r e pSp 泊 P l a s m i d

応 t

を用いて描出し、最終的

i こ 1 0 0u l

の滅菌蒸環水に溶解したものを用いた。

上記の方法で抽出したTASVdの全長

cDNA

pAS6

を鋳型にしてプライマ‑

CEAS‑135P

とCEAS・

229M

でPCRを行ないす'AS

Vd

の

TR

ドメインに対応する9

5

切を、またCEVdの全長

cDNA

pCE15‑6

を鋳型にしてプライマ

‑CEV

・

1

と

CEV

・

149M

で

PC

哀を行ない

CEVd

の

2

次構造上欝

123bp

を増幅した

(関

2a )

。なお

PCR

誌、

T t hDNA p o l y m e r a s e

を用い、

5 0u l

の反応系で

94C

，

5 m

祉をと

1

サイクル、

94C

，

1 m i n .

^嶋

55C

，

2 m i n .

・

72C

，

3 m i n .

をおすイクノレ、

72C

，

7m i n .

1サイクfレ行なった，

上記の

PCR

反応液の

2‑ 5 u l

を5%PAGEで検定した結果、共に期待される長さの単

‑DNA

断片の増輔が確認されたので、各PCR反応譲

2u l

をプライマー

CEV‑l

と CEAS-229M で PCR して 2 つの DNA断片を結合させCEVd と TASVd のキメラ 203~

の

DNA

断片を増幅した{図

2a )

。なお

PCR

は上記の方法に準じて行なったが、アニーリング湿度を

55C

から

40C

に下げて行なった。

上記の

PCR

反応機の

2‑ 5 u l

を

5 l J

る

PAGE

で検定した結果、期待される長さの

DNA

断片の増幅が確認されたので、残りの

PCR

反感物をエタノーノレ沈最後、Ba

mHI

と

行 uI

で切新した(実験ブロトコール

1 )

0 反応液をブェノ…

f

レ抽出後エタノール沈

ウイロイドの病原性を制御する 構造ドメインの解析

05660042)

6

C)

7

3

5

6

700

400

2 ， 100

( V i r o i d ) / h e p a t i t i s d

44

2 7

3 4

1 9 9 4 .

5

6 6

7 2

1 9 9 4 .

Sano

T .

C a n d r e s s e

T .

Hammond

R.W.

D i e n e r

T . O . and Owens

R . A . : I n v e s t i g a t i o n o f s t r u c t u r a l d o m a i n s r e g u l a t i n g v i r o i d p a t h o g e n i c i t y . 6 t h I n t e r n a t i o n a l C o n g r e s s o f P l a n t P a t h o l o g y

M o n t r e a l

Canada

1 9

3 . 8 .

(HSVd)

(CEVd)

5

( 1

9 3 . 1 0 )

e n s

R.A:

g

1 6

9 9 3 1 2 )

e n s

R.A:

(TR

6

9 9 4 . 1 0 )

e n s

A . :

(TR

17

( 1 9 9 4 .1 2 )

第 1

(HSVd)

(CEVd)

1

( 2 )

A

(HS/CE‑TR

CE /H S‑TR)作製手J l

A

B

E / 狂 S.TR

C

S

2

(CEVd)

a p i c a ls t u n t

(TASVd)

(1) PCR

A

(CE/AS‑TR)

I

( 3

A

CE/AS

TR

1 0 ( 1

2

ウイロイドの病原性を制御する構造ドメインの解析

p B S ‑ I ‑ おろ

^u ^l

^(DW)