佐々木   実  金子   克

岩医大歯誌 13：206−211，1988

S αphy／ococcα8 epZdemεdεsの産生するslime

の病原性とprotease活性との関連について

佐々木   実  金子   克

 岩手医科大学歯学部ロ腔微生物学講座     （主任：金子 克教授）

    〔受付：1988年9月8日〕

 抄録：Sεαρ々Zococcμs epidθrmd 8の産生するslime中にみられる糖タンパク質の生物学的活性 を明らかにする目的で，S￠ρ緬εrmjdjsの産生する活性物質の諸性状を比較検討した。＆￠ρ緬er一

励di8のslime産生性とマウスに対する致死性との間には相関が認められ， S￠ρidermdis slime

midisのslime産生性とプロテアーゼ活性との間には相関がみられたが，溶血毒，スパーオキシドジ

 以上のことから，＆ερ緬ermjdjsのslime中に認められるこの活性が＆ep dθrmZd￡sのviru−

1enceに深く関与しているものと推察された。

Key words：S￡αρん）ノZococω8ξμ∂erm泌s， slime，91ycoprotein， protease， virulence．

緒 言

 S故ρ妙ZOCOCCμs eρi∂erπ〕硫8は人をはじめ

家畜間に広く分布し，非病原菌と考えられてい たが，近年しばしば臨床材料から分離され，特 に静脈内留置カテーテルあるいは重篤な基礎疾 患を有するcompromised hostに感染を引き 起こすことが報告されている国）。

 すでに＆￠垣∂erm碗8の病原性にっいて Malesら5）は菌体外に産生されるhemolysin，

DNase活性が，またIchimanとYosida6）は英 膜が重要な病原因子であることを指摘している。

 S．￠ρ㎡θm硫sの産生するslimeは病原性と 深い関わりがあり，特にプラスチック製医療器 具使用時の感染，人工弁にともなう心内膜炎な

slimeの活性本体あるいは＆0ρ》dθrm硫s感染 に果たす役割の詳細な検討についてはいまだ報 告されていない。

 著者ら9）はS．￠ρi∂θrm頭s ATCC 14990 slime産生株が＆￠ρi∂θm滅8 STE−38 slime 非産生株にくらべマウスに対するvirulenceが 強く，また＆0ρ㎡θr7η硫8 ATCC 14990の産 生するslime中に特徴的な分子量約24，000の糖 タンパク質の存在を認め，＆￠ρ掘θrm掘おの病 原性とslime中の糖タンパク質との関連を示唆

した。

 本論文においては，S．￠ρi∂θrm㎡岳ATCC 14990のslime中にみられた特徴的な糖タンパ ク質とマウスに対する致死性との関連をさらに 明確なものとするため，S．印㎡θrm硫sの菌株 数を増して検討した。また，この糖タンパク質

Relationship between the pathogenicity of slime and the protease activity of SZαρんyZo−

COCCμ8 eρidem泌s．

 Minoru SAsAKI and Masaru KANEKo．

 （Department of Microbiology， School of Dentistry， Iwate Medical University，

 Morioka O20）

岩手県盛岡市中央通lr目3−27（〒020）         1）θπε、」1ωαZ￠Mθ（Lσπiu．13：206−211，1988

岩医大歯誌 13：206−211，1988

のもっ性状を明らかにする目的でS．θp掘θr−

m㎡誌の産生するslimeと活性物質の諸性状を 比較検討したので報告する。

材料および方法 1．使用菌株

＆0ρ㎡θrmi∂i8 ATCC 14990および口腔内か ら分離したS．θが∂εrmi跳11株を用いた。

2．培養とslimeの分離i

 著者ら9）の方法にしたがい，brain heart infusion agar（BHI agar，ニッスイ）で，10

％CO，存在下， dialysis membrane technique

（DMT）を用い37℃，48時間培養した。培養後，

培地上に5m1の滅菌生理食塩水を加えて，菌 体および菌体外物質を集め，10，000xg，30分間 冷却遠心した。上清を0．45μmのメンブランフィ ルター（ゲルマン）で濾過した後，蒸留水に透 析し，ポリエチレングリコール（MW 20，000，

和光）で濃縮して凍結乾燥した。

3．マウス感染実験

 ddY系雄マウス（4週令）を1群5匹ずっ用 い，S．θpi∂θrm硫8109個を含む滅菌生理食塩 水0．5m1を腹腔内に注射して，致死性を7日間 観察した。対照は滅菌生理食塩水0．5m1を腹腔 内に注射したマウスを用いた。

4．Sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide  gel electrophoresis（SDS．PAGE）

 Laemmli °）の方法にしたがい，試料を10％ア クリルアミド（和光）ゲルで定電圧定電流装置

（PAV−100，常光）を用い，30mA，5時間泳 動した。泳動後Coomassie BBR−250（半井）

で染色した。分子量の測定はSDS Molecular Weight Marker（Sigma）を用いた。

5．溶血毒産生試験

 Tripticase soy agar（BBL）にヒト，ウサ ギあるいはヒッジ赤血球を5％に加えた血液寒 天培地にS．印泌θrm㎡岳を接種して，37℃，

24時間培養した。コロニー周囲のウサギ，ヒッ ジ赤血球が溶血した場合をα毒素，ウサギ，ヒ ッジおよびヒト赤血球が溶血した場合をδ毒素 産生と判定した。

6．プロテアーゼ活性試験

 10％skim milk（Difco）を含むtripticase

48時間培養した。培養後コロニー周囲に透明環 がみられたものを（＋＋），白濁環のみられた ものを（＋）とし，変化のみられなかったもの を（一）とした。

7．スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）

 活性の測定

 今成ら11）の方法にしたがい，0．05M Na、CO、

緩衝液2、4mlに3mM xantine（半井），3mM EDTA， bovine serum slbumin（15mg／m1，

和光）および0．75mM nitroblue tetrazlium

（半井）を各0．1mlずっ試験管に入れる。これ に＆θpidθrm掘おから分離した菌体外物質（2 mg／ml）を0．1m1加えて，25℃，10分間放置 後，xantine oxidase（Sigma）溶液0．1mlを加 え，25℃，20分間インキュベートした。6mM CuC1，（半井）0．1mlで反応を停止させた後，

二波長分光光度計（UV−210，島津）を用い560 nmにおける吸光度を測定して，対照の吸光度 を％阻害する活性を1単位とした。

8．タンパク質の定量

 Lowryら12）の方法にしたがい，タンパク質の フェノール試薬（和光）による呈色を二波長分 光光度計（UV−210，島津）を用いて，750nm における吸光度を測定した。標準物質としては bovine serum albumin（和光）を用いた。

結 果

1．＆θp㎡θm硫sのslime産生性とマウスに  対する致死性

 Table 1に示したようにS．0ρ㎡θrm硫sの slime産生株（8株）のうち＆￠ρ㎡θrm掘ほSTE−

36，STE−37およびSTE−67を除くすべての菌株で 致死性を認め，とくに＆￠ρ㎡θrm㎡おの強slime 産生株であるATCC 14990， STE−19では5匹

中2匹あるいは3匹死亡し，致死性が高かった。

一方，S．￠ρ㎡θrm㎡おのslime非産生株（4株）

ではSTE−34で5匹中1匹の死亡が認められ，

その他の菌株では致死性は認められなかった。

岩医大歯誌 13：206−211，1988 Table l Relationship between the ability of slime production and the vilulence of

    Sεαρ九yZOCOCCαS eμdermidiS in miCe．

Strains of S eρidρrητ垣！is

Slime production ATCC 14990

STE−18 STE−19 STE−36 STE−37 STE−53 STE−63

STE−−67

＋ 十

十

十十十十十十十

No． of death／No． of challenge

     2／5      1／5      3／5      0／5      0／5      1／5      1／5      0／5 STE−5

STE−34 STE−38 STE−70

0／5 1／5 0／5 0／5

2．S． eρi∂εrmi∂isのslime産生性とS．ερ厄θr−

 m》∂is菌体外物質中の分子量24，000糖タンパ  ク質との関係

 Fig．1はs．￠ρ㎡θrm泌s l2株の産生する菌体 外物質のSDS−PAGE像を示したものである。

S．0ρi∂εrmi∂isのslime産生株（8株）におい てはいずれも分子量24，000付近に特徴的なタン パク質のバンドを認めた。とくにS．θρ㎡εr−

midjs STE−18，強slime産生株でマウスに致

STE−19で顕著であった。 slime非産生株（4株）

についてみると分子量24，000にタンパク質のバ

｛   ｝       ㌔・ぷ1「

逼■ロ『一可一幽巳

 皿一5     Sπ一38     証一ユ8     Sπ一35     姫一53     ㎜一67   Sπ一34     S正一了0     証一1g     皿一37     諏一53     ATCC l4ggO

Fig．l SDS−PAGE of S￡αρん）ノlococωsθρi（ゴe−

   rmid：s  extracellular  substances，

   Migration was from top to bottom    After electrophoresis， the gel was    stained by Comassie BBR−250．

   Arrow indicates the specfic glyco．

   protein（MW 24，000）．

ンドを認めたものはほとんどなく，S．￠が∂εr一

励∂is STE−70でわずかにバンドの痕跡様のも のを認めたにすぎなかった。

3．S． eρ㎡em西sのslime産生性と溶血毒お  よびプロテアーゼ活性との関係

 Table 2のようにS．θρidθm滅s 12株の slime産生性と溶血毒との関係にっいてみると

slime非産生株のS． eρi∂θrmi輪STE−34はα 溶血毒産生であったが，他の菌株はすべてδ溶 血毒産生であり，slime産生性と溶血毒の型と の間には関連は認められなかった。一方，slime 産生性とプロテアーゼ活性との関係についてみ

ると，S．ερばermi∂is ATCC 14990， STE−18，

STE−19， STE−36， STE−53ではプロテアーゼ 活性を認めた。このプロテアーゼ活性はS．

￠ρidθrmdis STE−53と強slime産生株であるS．

￠ρi∂θrm㎡is ATCC 14990， STE−19でとくに顕 著で，S． eρi∂εrmi∂isのslime産生性（8株）

とプロテアーゼ活性との間には相関性が認めら れた。

4．S．θρi∂θrπL硫sのslime産生性とSOD活  性との関係

 S．θρjdεm㎡誌のslime産生株（8株）にっ

いてみると（Table 3）， SOD活性はいずれも10

unit／mg protein前後の値であり，平均値は

10．9unit／mg proteinであった。強slime産

岩医大歯誌 13：206−211，1988

Table 2 Relationship between the ability of slime production and type of hemolysin or

production of protease of 8Z（η9ノ｝ツZococcμsε享）jder肌id s．

Strains of S qoidθrπ掘C

Slime production

ATCC 14990

STE−18 STE−19 STE−36 STE−37 STE−53 STE−63 STE−67

十 十

十

十十十十十十十 δδαδδδδδ

十 十  十

十 十

十 十

STE−5 STE−34 STE−38 STE−70

δαδδ

Table 3

Relationship between the ability of slime production and the activity of super−

oxide dismutase of 8ZαρんyZococcμs eρiderm城s extracellular substances．

Strains of S琢）idermi（溌s Slime production

ATCC 14990 STE−18 STE−19 STE−36 STE−37 STE−53 STE−63 STE−67

十 

十

十

十十十十十十十

9．6 9．2 11．0 9、5 11．6

11．3   （10．9） b）

STE−5 STE−34 STE−38 STE−70

14．0 9．0 7．2

10．3   （10．1） b）

a）Superoxide dismutase activity（unit／mg Protein）．

b）Averege．

生株のS．βρ㎡θrm硫8 ATCC 14990， STE−19

かそれ以下の値であった。一方，slime非産生

proteinからSTE−5の14．Ounit／mg proteinと 値に多少ばらつきを認めたものの，これらの平 均値は10．1unit／mg proteinであった。

 以上の結果からS．￠ρ㎡θrm㎡おのslime産生

性とSOD活性との間に関連性は認められな

かった。

考 察

一般に日和見感染菌と呼ばれているS．￠ρ㎡一

θrm硫S， PSμdomoηαSαθrμgiηOSα， Sθrrα泌 mαrce8ceπSあるいはEe就εrOCOCCμS允ecαZお の病原因子として，細菌が産生するプロテ

アーゼ13），DNase5）， SODI4）溶血毒 5）あるいは slime凪17）などが知られている。これらのviru−

lence factorは生体の防御作用に抵抗し，菌の 定着あるいは増殖を助け，感染を成立させるも

のと考えられている。一方，感染の成立には生 体側の要因も大きく左右し，基礎疾患があり免 疫抑制状態にある患者（悪性腫瘍，糖尿病，膠 原病など）あるいは高度医療技術の進歩にとも なって生じたcompromised hostでは細菌の

侵襲を受けやすいといわれている18）。

210

 S．￠ρidθrm硫sの産生するslimeは，とくに プラスチック製医療器具などへの付着性を高め，

あるいは生体防御能を抑制することによりS．

￠ρi∂erm硫sの感染を引き起こす際の病原因子 の一っとなっているものと考えられている1珊）。

 さきに著者ら9）は＆￠ρ掘θrπ励おのslime中 に分子量約24，㎜の糖タンパク質の存在を認め，

virulenceとの関連を示唆したが，今回さらに S．￠ρiderm硫sの菌株数を増し検討したところ，

分子量約24，000の糖タンパク質とマウスに対す る致死性との関連をより明確なものとするこ とができた。また＆￠ρ㎡θrm硫sのslime中に 認めた糖タンパク質の性状を明らかにする目的 で，Sづρ㎡erm㎡岳のもっ生物学的性状につい て検討を加えた。その結果，S．￠ρjdθrm泌sの slime産生性とプロテアーゼ活性との間には相 関を認あたが，溶血毒産生，貧食細胞の酸素依 存性殺菌作用を阻害するSOD活性には影響を 及ぼさなかった。すなわち，slime中に特徴的 に認められる分子量約24，000の糖タンパク質は プロテアーゼ活性との関連が深く，このslime 中に認められるプロテアーゼ活性が生体に影響 を及ぼし，S．￠ρjdθrm泌sの感染力を強めてい るものと推察される。

 免疫系に影響を及ぼす細菌性プロテアーゼに っいてKharazmiら2Dは丑αθwgεη08αの産生

岩医大歯誌 13：206−211，1988

するプロテアーゼが好中球の走化性を阻害し，

またHolderとWheeler麗）は血漿中IgGレベル を低下させると報告しており，生体防御能に影 響を及ぼすものと考えられる。

 従来，＆0ρ漉rm城sの産生するslimeは 糖質，タンパク質あるいは核酸などを含む polymixed compoundで，その活性本体は明

らかにされていない。著者らは本論文において

＆ξρ㎡erm㎡isのslime中に特徴的な糖タンパ ク質とプロテアーゼ活性との関連性を認め，こ のslime中のプロテアーゼ活性がS．￠ρばθr−

m㎡δのvirulenceに深く関与していることを

結 語

1．＆eρi∂ermdi8のslime産生性とマウスに  対する致死性との間には相関性が認められた。

2．＆￠ρ㎡θm硫sのslime産生株（8株）で  は分子量約24，000の特徴的な糖タンパク質の

存在を認めた。

3．S．￠ρiばer7π」∂isのslime産生性とプロテアー

ゼ活性との間には相関性が認め「 られた。

4．＆￠ρ㎡θrm掘捻のslime産生性と溶血毒産 生あるいはSOD活性との間に関連は認めら

 れなかった。

 Abstract：We have studied the bacterial characteristics of 8Zαρ九yZococωs￠ρjdermidis， to

￠ρidθrm泌8 slime by using SDS−polyacrylamide gel electrophoresis． We recognized the relationship between slime production and virulence of＆0ρidermdis in mice． Also，

we observed the．relationship between slime production and the activity of protease．

However， no relation between slime produciton and the activity of superoxide dismutase，

and between slime production and the type difference of hemolysin of＆eρjdθrηt城8

were seen． These results demonstrate that the slime glycoprotein of S￠ρi∂θrmi∂is was closely related to protease activity and a virulence in the host．

       文    献

1）Quinn， J．P．， Counts， G．W、 and Meyers， J．

D．：Intracardiac infection due to coagulase−

negative 8口ρ九yZococcωs associated with

Hickman ca仇eters． Cαπcθr 57：1079−1082，

1986．

2）Tenney， J．H．， Moody， M．R．， Newman， K．

A．，Schimpff， S．C．，Wade， J．C．，Costerton， J．

W．and Reed， W．P．：Adherent microorgan−

isms on lumenal surfaces of long−term

interavenous catheters． Arcん． 1んεerη． 」協θ（ゴ

146：1949−1954，1986．

岩医大歯誌 13 206−211，1988

3）Harris， J．M、 and Martin， L．F．：An iπ

 S旋口）んyZococcμs 4）idermi（〕Zs adhesion  to prosthetic vascular graft materials． Aηη．

 8μ㎎「． 206：612−620，1987．

4）Verhoef， J．：Infections caused by coagu−

lase−negative staphylococci in the immuno−

compromised host、 ZeηぴαlbZ． Bα抱erZo膓．

 」レ配んrobioL Hyg． Suppl． 16：209−213，1987．

5）Males， B、M， Rongers W．A． Jr． and

 Parisi， J．T．：Virulence factors of biotypes

of SZαρんyJococωs￠ρ緬ermεdis from clinical  sources． J CIiπ． 」レ∬crobioZ．  1 ：256−261，

 1975．

6）Ichiman， Y． and Yoshida， K．：The relat−

 ionship of capsular−type of＆αρんyZococcμ8  4）iderη亘（戎s  to  virulence  and  induction  of resistance in the mouse． 」 ・4ρμ．

 BαderioZ． 51：229−241，1981、

7）Marples， R．R．， Richardson， J．F． and de

 coagulase−negative staphylococci． ZeηZrαlbZ．

 BαんεεrioZ． 1レ∬んrob oZ． 11ッg． Suppl．14：463−

 469，1985．

8）Sheth， N．K．，Sohnle， P．G． and Franson， T、

 R．：Coagulase−negative staphylococci（CNS）

 and intravascular catheters．  Zθ1τεrαZbZ．

 Bαんεer↓oZ、 1∪「 ゐrobioZ． H光！． Suppl． 16 ：

 177−181，1987．

9）佐々木実，金子 克：8Zqρ九yZOCOCCμ8￠ρi，

 dθrmidisの産生するslimeとその病原性につい  て，岩医大歯誌，13：10−17，1988．

10）Laemmli， U．K． l Cleavage of structure  proteins during the assembly of the head

 of bacteriophage T4． Nαωrθ． 227：680−685，

 1970．

11）今成登志男，広田元子，宮崎元一，早川和一，

 田村善蔵：Superoxide dismutase活性測定の改  良，医学のあゆみ，101：496−497，1977．

12）Lowry．0．H．， Rosebrough， N．J．， Farr， A．

 L．and Randall， R．J．：Protein mesurement

 with the folin phenol reagent． 己入 BjoZ．

 Cんθη免． 193：265−275，1951．

13）Kamata， R．， Yamamoto， T．， Maeda， H．：

 Aserratial protease causes vascular perme一

 ability reaction by activation of the Hage−

 man factor−dependent pathway in guinea

 pigs．1カゾεcZ． 1仇ηH↓η． 48：62−72，1985．

14）宮崎修一，辻 明良，石井哲夫，北矢 進，金子

 康子，五島瑳智子：実験的敗血症における各種グ

 539，1986．

15）Scheifele， D．W．， Bjornson， G．L．， Dyer， R．

 A．and Dimmick， J．E．：Delta−like toxin  produced by coagulase−negative staphylo−

 cocci is associated with neonatal necrotizing  enterocolitis 1㎡ecε． 1mητμπ． 55 ：2268−2273，

 1987．

16）Nicas， T．1． and Iglewski， B．H．：The con−

 tribution of exoproducts to virulence of  PseμdomoπαSαer㎎fπOSα． Cの．」1協cro−

 biol． 31 ：387−392，1985．

17）Christensen， G．D．， Simpson， W．A．， Bisno，

  A．L and Beachy， E．H．：Adherence of slime−

  producing  strains  of  ＆αρ九yZococcμs

 1mmLzη． 37：318−326，1982．

18）国井乙彦：Compromised hostと感染症，臨床

  と研究，63：2124−2131，1986、

19）Peters， G．， Locci， R． and Pulverer， G．：

  Adherence and growth of coagulase−

  negative  staphylococci  on  surfaces  of   intravenous catheters．  e入  1ηノ＞cZ． 1） s．

  146：479−482，1982．

20）Gray， E．D．，Peters， G．， Verstegen， M． and

  ￠ρidθrm城s on the human cellular immune   response． Lαπcθε、 i：365−367，1984．

21）Kharazmi， A．，D6ring， G．， Hφiby， N． and   Valerius， N．H．：Interaction of Pseμdomo．

  ηαs  αθr㎎ ηosα  alkaline  protease  and

  elastase with human polymorphonuclear

  leukocytes in vitro． 1ψcε． 1mmμη．  43 ：

22）Holder，1．A． and Wheeler， R．：Exper−

  imental studies of the pathogenesis of infec−

  tions owing to PSεμ（loητoπαsαθrμ9 ηosα：

  elastase， an IgG protease． Cαη． J Micro−

  bioZ． 30：1118−1124，1984．