゛ 学 位 論 文 内 容 の 要 旨

学 位 論 文 題 名

博 士 （ 医 学 ） 鐙 谷 武 雄

Response of plasma tlSSuefaCtorpathWayinhibitortodiet

― 1nduCedhyperCh01eSter01emiainCrab ー eatingmonkeyS      （ カニ ク イザ ルに お ける 食事誘 導性高コレステロ ール血症での      血 漿組 織 因子 経路 イ ンヒ ビタ ― の反 応）

゛ 学 位 論 文 内 容 の 要 旨

［緒言］

  Tissuc facioi．l)atlix,vayi111iibilor (TFPI)は、糸n織区1 f/r7gVlla[jil ‑によりljH始され る 外[人l系 凝 岡 反 ↓ ふを ト ル 害 する プ ロ テ アー ゼ イ ン ヒビ タ ー で 、lL竹I勺 皮 細胞 で 産 ′lt さ れ 、 そ の 大 部 分 が り ポ 蛋 白 も し く は 内 皮 細 胞 表 而 に 結 合 し て 行 化 し て い る 。 そ し て 、 ｜fIL漿ffiで は 、LDL/VLDL結 合 型 、IIDL結 合 型 、 遊 離 型 の3っ の 行ri！ 様 式 が あ る 。 こ の よ う な 抗[fIL栓 性 を 持 つTFPIが 、 動 脈 硬 化 、 ｜nTI栓 形 成 の 病 態 に お い て ど の よ う に 機 能 し て い る か 、 ま た ど の よ う に 変 動 す る か と い う こ と は ま だf・ 分 解I川 さ れ て い な い 。 そ こ で 今lri、 動 脈 硬 化 の 堪 礎 疾 患 と な り う る ｜ 競 〃RIf‖ ．jJFに 苒r1 し 、 サル を 疾患モ デルと して川 い、食 事負荷 により高 二1レフ 、，ア ロー亠 ル101．7＾！を誘 導 して、TFPIの変動を倹討した。

［材料と方法］

  3か ら8歳 の カ ー ク イ ザ ル リ 匹 を 実 験 に 用 い た 。().3％ 二1レ ス テff… ハ 、15弧 バ タ ーを混人した食帝を魚術し、高コレステロール血症を誘導した。

  'rrPIの71r1 f゛1： 測,Lは、twc) stageのFluorogcnic assayをJuいた。．リルIm愼にL二ト荊X 旧r と ヒ ト 第viIa閃 r、 ウ サ ギ 脳 組 織 閃 予 、 塩 化Caを 添 カ ‖ 、 ワ い で 篤X閃 ナ の 螢 冫匕 性ベブ チド艇 質を )J‖ え．、 第X仏lrマ 剛！ヒ 化反応 の阻害のf早度でインヒビター→濔rI： を表わした。TFI'Iび）抗原測定にはツ．′レricomnlhi11ant I'FPIのモノクHー→、ブ．，′レ、ポル ク ロ ー ナ ル 抗 休 を 川 い た サ ン ド イ ッ チ 法 に よ るEnzyme ilTlrnunc,assay( EIA） を 開 発 し 、 こ れ を 門Jい て 測 定 し た 。 ま た 、TrPIの 分 別 定 景 を 彳 了 な う た め に 、Sul)cidcx2()() のカラムにてゲル濾1Paを行なったー

［結果］

  サ ル6pbの コ レ ス テ ロ ー ル 値 と'rrPI活 性 の sF均 値 の 変 化 を み る と 、I高 コ レ ス テ ロ ー ル食 負 荷 後4週 日で 、 コ レ ステ ロ ー ル 値は 約3倍 に 卜 昇 、ま た 、11ri‑ii(‑´i．fトは 約 1.5倍 に 上 昇 し た 。 そ の 後 20週 ま で そ の ． ． 亅 ． 二 昇 し た レ ベ ル が 続 い て い た 。   ゲ ル 濾 過 後 の 各 分 両 の 検 討 で は 、 分 子 量100万 を 越 え る 分 襾 に 二 二 二1レ ス テ ロ ー ・ ル 、TFPI活 性 と も 大 き い ピ ー ク が 認 め ら れ 、LDL/VLDL結 合 型 ′I'FPIと 考 え ら れ た 。 ま た 、 彡 冫 了 景30万 か ら15万 の 分 画 に 、 コ レ ス テ ロ ー ル の 小 さ な ピ ー ク と TFPI活 性 の ニ ニ 峰 性 の ビ ー ク が 認 め ら れ 、HDL結 合 型rrFriと 考 え ら れ た 。 ま た 、 遊 離 型 の TFI） Iル 痕 跡 的 で あ り 、 明 ら か な ピ ー ー ク を 形 成 し て い な か っ た 。   高 コ レ ス テ 匸 亅 ー ルfflL症 時 に は 、LDLf VLDL分 画 に お い て 、 コ レ7ヽ テHー ルfI轟 と TFPI活 性 は と も に 人 き く 増 加 し て い た 。 こ の 分 画 の 変 化 は 他 の 分 ゛1イ の 変 化 よ り 人 き い こ と よ り 、jf‖ ． 漿 巾 の 総TrPrの 変 化 に 最 も 影 響 を 与 え て い る と 考 え ら れ た 。 ま た 、I・IDL分 襾fに お い て はI高分 予IIDLのTFPI活 性 は減 少 し、 低分r IlDI」の'rrP]淅´rト は 増 カ ‖ し て い た 。 遊 離 型 の 'rrPrに っ い て は 、 負 荷 後 も 変 化 は な か っ た 。   LDL/VLDL)J襾 に お け るTFPI活 性 の 増 加 が 、 蛋 白 量 の 増 加 に よ る も の か 、 比 活 性 の‑f ‑釘 。 に よ ろ も の か を 調 べ る た め 、EIAに て 抗 原 景を 氾IJ定Lア一 ー ゲ ル 濾渦 後 の 秤 分 両 で 活rト と 抗 原 最 を 測 定 す る と 、 高 コ レ ス テ ロ ー ルIOL症 時 に は 、LDL/VLDL分

両において、′I．r:i)iの活性と抗原鼠は共に同程度の比率でj閤加していた。このこと より、この分襾fにおいて実際にTFPIの蛋白量が増加しているヰ）のと判断された。

  

ヒ トに おい て、 ヘパリ ンを投与すると内皮細胞に結合して存在している

TFPI

が 遊離 し、 血漿 中の

TFPI

濃 度が増加することが報告されている。しかし、高コレス テ口 ール 血症 時に このへ パリンの効果に変化が生じるかどうかはまだ知られてい ない 。我 々は 今回 のモデ ルを用いこの問題にっいても検討を加えた。今回の検討 では 正常 コン トロ ール時 も高コレステロール血症時も、

200

単位/Kg体重の量のへ パリン投与によりTFPI濃度は約5倍に増加し、両者で有意な差を認めなかった。ま た、 ヘパ リン 投与 後血漿 のゲ ル濾 過の 検討 では 、LDLー/VLDL分画、HDL分画、お よ び 遊離 型の いず れの 分画 にお いて も投 与前に 比べ

TFPI

の増 加を 認め た。 そし て、このへパリン投与後血漿を4度で24時間放置した後に、ゲル濾過を行ってみる と

LDL/VLDL

分 画 の

TFPI

は 減 少 し

HDL

分 画 の

TFPI

は 増 加 し て い た 。

［考察］

  

今 回の 検討 にお いて、 高コレステロール血症において

TFPI

活性が増加したが、

こ れ は 、

LDL/VLDL

の り ポ プ 口 テ イ ン が 増 加 す る の に 伴 っ て 、

LDL/VLDL

結 合型

TFPI

の 量 も増 加 す る た め で あ る こ と が明 かと なっ た。 また 、HDL結合 型TFPIで は、 低分 子HDLのTFPI活 性は 増加 して いた が、 この変 動には高コレステロール血 症時のHDLの組成の変化が関与している可能性が考えられた。

  

ゲ ル濾 過に よる サル血 漿

TFPI

の分別定量の結果は、ヒトの結果と良く類似して いた 。ま た、 コレ ステロ ール値の上昇が

TFPI

の上昇を来たす点でもサルとヒトの 結果 は一 致し てい た。一 方、齧歯類のウサギ、ラットでは、ゲル濾過の結果も高 コレ ステ ロー ル血 症に対 する反応もヒトとは異なっている事が報告されている。

これ はヒ ト、 サル とウサ ギ、ラットの間で

TFPI

の構造に差があることが原因と考 えられる。今回の結果より、動脈硬化における血栓形成゛とTFPIの関係を調べるた めに 動物 実験 をす る場合 、その動物種にっいても考慮すべきことが明らかとなっ た。

  

内 皮結 合型

TFPI

の量を 反映すると思われるへパリン遊離性

TFPI

の検討では、正 常時 と高 コレ ステ ロール 血症時で差を認めなかった。この結果は単に数週間の高 コレ ステ ロー ル血 症があ るだけでは、内皮結合型

TFPI

の量に変化を来たさない事 を示唆するもの．といえる。この現象の説明としては、（1）今回の程度のコレス テ ロ ール の負 荷で は、

TFPI

の産 性能 が低 下する 程の 内皮 損傷 が生 じて いな い、

（2）

TFPI

が毛 細血 管、 静脈 で主 で産 生さ れて いて、 そのために動脈で仮に産生 低 下 が 生 じ て も 全 体 で は 変 化 が 認 め ら れ な い 、 な ど が 考 え ら れ る 。

  

高 コレ ステ ロー ル血 症時 に増 加し たLDL/VLDL結合 型TFPIの 由来 につ いて は、

今 回 のへ パリ ン投 与後 血漿 のゲ ル濾 過の 結果で 、ヘ パリ ン遊 離性 の

TFPI

が

LDL/

VLDL

分 画 、 ま た

HDL

分 画 に も 存 在 し て い た 事 よ り 、 内 皮 結 合 型

TFPI

が

LDL/

VLDL

結合型TFPIヘ移行した可能性が高いと考えられた。

［結語］

  

（1）サルの高コレステロール血症モデルにおいて、コレステロールの上昇に伴 い 、

TFPI

活性 も上 昇し た。 この 上昇 は比 活性の 上昇 では なく 、LDL/VLDL結 合型

TFPI

の蛋白量の増加よることが明らかとなった。

  

（

2

）サ ルの

TFPI

の血 中で の性 状、 動態 は他 の動物 種に比ベヒトに近似してお り、 サル は疾 患モ デルと して最適と考えられた。また今回開発した測定系はその 検討に有用である。

  

（3）本モデルでのへパリン投与の検討により、数週間の高コレステロール血症 の負 荷で は、 内皮 結合型

TFPI

の量に大きな変化を来さなかった。また、ヘパリン 遊 離 性の

TFPI

がLDL/VLDL結 合型

TFPI

に移 行しう るこ とよ り、 高コ レス テロ ール 血 症 時に 増加 した

LDL/VLDL

結合 型TFPIの 由来に つい ては 、内 皮結 合型

TFPI

であ る可能性が考えられた。

学 位 論 文 審 査 の 要 旨

主 査   教 授   阿 部   弘 副 査   教 授   石 橋 輝 雄 副 査   教 授   小 林 邦 彦

学 位 論 文 題 名

Response of plasma tissuef ・ aCtorpathWayinhibitortodiet

― induCedhypereholeSter01emiainCrab ― eatingmonkeyS      （カニクイザルにおける食事誘導性高コレステロール血症での      血漿組織因子経路インヒビタ―の反応）

［序 論］

  Tissue factor pathway inhibitor   (TFPI)は、外 因系凝固 反応を 阻害する プ口テア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー で 、 血 管 内 皮 細 胞 で 産 生 さ れ 、 血 漿 中 で り ポ プ ロ テ イ ン と 結 合 し う る 。 こ の よ う な 特 徴 を 持 つTFPIが 、 血 栓 性 疾 患 で ど の よ う な 変 動 を し めす か 充 分 に 解 明 さ れ て い な い 。 そ こ で 動 脈 硬 化 、 血 栓 性 疾 患 の 基 礎 疾 患 と な り う る 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 を 、 サ ル に 食 事 負 荷 し て 誘 導 し 、TFPIの 変 動 を 検 討 し た 。

［ 材 料 と 方 法 ］

  カ ニ ク イ ザ ル9匹 を 実 験 に 用 い た 。0.3％ コ レ ス テ ロ ー ル 、15％ バ タ ー を 混 入 し た 食 事 を 負 荷 し 、 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 を 誘 導 し た 。TFPIの 活 性 測 定 にtwo sta： のFluorogenic assayを 開 発 し た 。 血 漿 に 第X因 子 、 第VIIa因 子 、 組 織 因 子 、 塩 イ Caを 添 加 し 、 つ い で 第X因 子 の 螢 光 性 ペ プ チ ド 基 質 を 加 え 螢 光 強 度 を 測 定 し 、 第 X因 子 活 性 化 反 応 の 阻 害 の 程 度 で イ ン ヒ ビ タ ー 活 性 を 表 わ し た 。 ま た 、TFPIの 抗 原 量 測 定 に は 、 サ ル リ コ ン ビ ナ ン トTFPIの モ ノ ク 口 ー ナ ル 、 ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た サ ン ド イ ッ チ 法 に よ るEIAを 開 発 し 、 こ れ を 用 い て 測 定 し た 。 ま た 、 TFPIの 分 別 定 量 を 行 な う た め に 、Superdex200の カ ラ ム に て ゲ ル 濾 過 を 行な っ た 。 ヘ パ リ ン 遊 離 性TFPIの 量 を 検 討 す る た め 、 ヘ パ リ ン 負 荷 テ ス ト と し て 、200単 位 ／ Kg体 重 の 量 の へ パ リ ン を 静 脈 内 投 与 し 、 5分 後 に 採 mを 行 っ た 。

［ 結 果 ］

  分 別 定 量 の た め に サ ル 血 漿 を ゲ ル 濾 過 す る と 、 分 子 量100万 を 越 え る 分 画に コ レ ス テ ロ ー ル 、TFPI活 性 と も 大 き い ピ ー ク が 認 め ら れ 、LDL/VLDL結 合 型TFPIと 考 え ら れ た 。 ま た 、 分 子 量30万 か ら15万 の 分 画 に 、 コ レ ス テ 口 ー ル の 小 さ な ピ ー ク とTFPI活 性 の ニ 峰 性 の ビ ー ク が 認 め ら れ 、HDL結 合 型TFPIと 考 え ら れ た 。 ま た 、 分 子 量4‑5万 に 遊 離 型TFPIの 小 さ な ピ ー ク を 認 め た 。 サ ルTFPIの 分 別 定 量 の 結 果 は 、 マ ウ ス 、 ラ ッ ト の 他 の 動 物 に 比 ベ 、 ヒ ト の パ タ ー ン と よ く 近 似 し て い た 。   サ ル6匹 に お け る 高 コ レ ス テ 口 ー ル 食 負 荷 後 の コ レ ス テ 口 ー ル 値 とTFPI活 性 の 変 化 を み る と 、 高 コ レ ス テ 口 ー ル 食 負 荷 後4週 目 で 、 コ レ ス テ 口 ー ル 値 は 約3倍 に 上 昇 、 ま た 、TFPI活 性 は 約1.5倍 に 上 昇 し た 。 そ の 後20週 ま で そ の 上 昇 し た レ ベ ル が 続 い て い た 。 高 コ レ ス テ 口 ー ルifn症 で のTFPIの 変 化 を ゲ ル 濾 過 で 検 討 し て み る と 、LDL[VLDL結 合 型TFPIの ピ ー ク が 大 き ＜ 増 加 し て い た 。 一 方 、 他 の 分 画 は 、 負 荷 後 も 大 き な 変 化 は な か っ た 。

  LDL[VLDL結 合 型TFPIの 活 性 の 増 加 が 、 蛋 白 量 の 増 加 に よ る も の か 、 比 活 性 の 上 昇 に よ る も の か を 調 べ る た め 、EIAに て 抗 原 量 の 測 定 を 試 み た 。 そ の 結 果 、高 コ

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レステロール血症時に、LDL[VLDL 結合型 TFPI の活性と抗原量は同程度の比率で 増加していた。このことより、この分面において実際にTFPj の蛋白量が増加して いるものと判断された。

   ペパリン負荷テストを行うと、血漿TFPI は5 倍に増加した。このへパリン遊離性 TFPI についてもゲル濾過を行ってみると、LDL[VLDL 分画、 HDL 分画でもTFPI の 増加を認め、内皮から遊離したTFPI がりポプロテインと結合しうることが明らか となった。また、高コレステロール血症でのヘパリン遊離性 TFPI の量を検討して みたが、正常時と比ベ有意な変化を認めなかった。

［考察］    サルTFPI の分別定量の結果は、マウス、ラットに比べるとヒトの結果に近似し ていたが、これは、ヒト、サルとマウス、ラットの間でTFPI やりポプロテインの 構造、存在様式に差があることが原因と考えられる。今回の結果より、生体内で のTFPI の動態を検討する場合、その動物種についても考慮すべきであり、サルは 動物モデルとして最適であると考えられた。

   高コレステロール血症においてTFPI 活性が増加したが、これは、 LDL/VLDL の りポプ口テインが増加するのに伴って、 LDL/VLDL 結合型TFPI の蛋白量が増加す るためであることが明らかとなった。また、その増加したTFPI は内皮細胞結合型 TFPI から移行した可能性が考えられた。

   内皮細胞結合型TFPI の量を反映すると思われるへパリン遊離性TFPI の検討で は、正常時と高コレステ口ール血症時で差を認めなかった。この結果は単に数週 間の高コレステロール血症があるだけでは、内皮細胞結合型TFPI の量に変動をき たさない事を示唆するものとぃえる。今後長期的な負荷により、動脈硬化を完成 させた時の検討が必要と考えられた。

   本研究は高コレステロール血症におけるLDL/VLDL 結合型TFPI の増加を中心と する血漿TFPI の動態を明らかにしたものである。動脈硬化性疾患のm 栓形成の病 態生理を解明する上で、非常に有意義な研究と考えられ、学位授与に値する。

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