一般 的 に病原 細 菌 の検 出 に は
4
0
0
全文
(2) た 。 こ の 指 針 で は,両. 方 のPCRで. が 出 た 場 合 に 」7p釧i血 ηρ血1αmに. 共 に 陽 性反 応. 時 間 は少 な くてす むの で,増 幅 曲線 は早 く立 ち上. よ る冷水 病 と. が る 。 従 っ て,段 階 希 釈 した標 準 物 質 を用 い て LAMP反. 判 定 して い る 。 LAMP抽. 出 し た ゲ ノ ムDNAの2μ1をLAMP. 応 を行 い,任 意 の閾 値 と増 幅 曲線 が 交 わ. る点 を横 軸 に,初 発DNA量. を縦 軸 に グ ラ フを描. の鋳 型 として用 い た 。本 研 究 で は特 異 性 を高 め る. く と直線 が得 られ る。 これ を検 量線 と して,未 知. 為 に,甜zBを. ライ マ ー 設 計. DNA濃. りも進 化 速 度. 標 準物 質 と して ∬BPCR産. 標 的 遺 伝 子 と し,プ. を 行 っ た 。 双 β は,16SrDNAよ. 度 を知 る こ とが で き る。 検 量 線 作成 用 の. が 速 い た め 近 縁 種 間 で の 相 同 性 が 少 な く,16S. た。 吸 光 度 か ら,DNAの. rDNAと. に よ り求 め,こ のDNA溶. 同 様 に 普 遍 的 に 存 在 して い る ハ ウ ス キ ー. 物 の希 釈 系 列 を用 い 純 度 お よび 濃 度 を 計算 液 を滅 菌 したMmiQ水. ピ ン グ 遺 伝 子 で あ る 。 」%釧 伽1ρ 鯉 αzηFPC840. を用 い て1!10ず つ段 階 希 釈 し,標 準物 質 の希 釈系. 株 の 餌 召 配 列(AccessionNo.ABO12860)か. 列 を作成 した 。 これ らを鋳 型 と してLAMPを. Primer恥plorerVbr2(富 LAMP用. ら,. 士 通)ソ フ ト を 用 い て. い,濁 度 の経 時変 化 を調 べ た。. プ ラ イ マ ー セ ッ トを 設 計 し た(Fig.1)。. 結果. 反 応 は,、856DNAPolymerase(NewEngland. 刃 .ρs蜘p血1㎜. BioLabs),dNTPs(AmershamBiosciences),各 プ ライ マ ー を 混 和 し,鋳. 型 を加 え て25μ1の. 行. 反応. 件 の検 討LAMPで. 検 出 の た めのLAMP反 は鎖 置 換 型DNA合. 応条. 成酵素を. 用 い る為,プ ライ マー の塩 基配 列 に よって は,プ 液 を 作 成 し た 。そ して64℃ る こ と に よ りDNAの. で80〜120分. 間保 温 す. 増 幅 を行 った。 反 応 産物 の. ライ マ ー 自身 を鋳 型 と したDNA増. 幅 も し くは プ. ライ マ ー ダイ マ ー の形成 に よる プ ライ マー 同士 で 特 異 性 の確 認 の た め に.磁 班II(TOYOBO)に. よる. 制 限酵 素処 理 を行 った 。 「FαWa届Rneゆ. のDNA増. 幅 が起 こ り うる。 今 回 設 計 した プ ライ. マー で は,反 応 時 間 が120分. を超 えて もプ ライ マ. ー ダイ マ ー の形成 あ るい は 自己 を鋳 型 と した非特. ・ ・me司. ま. 淫 噛 圃. 留,2、 ◆一 〜鋤. 一翻. 異 的 な反 応 が起 こ らなか った。LAMP産 臼cT・ 一塵. 泳 動 す る と,標 的 部位 を繰 り返 しもつ ス メ アー な. ・ 、・・。・A、,,2B3 〜{認. 一. F3F2FlBlc82c. 一 一. 像 が得 られ るが,標 的部 位 に1箇 所 だ け存 在 す る. ヨじ. 黙驚亟 ・. BaηIIIの 認 識部 位 を切 断す る と,一 本 のバ ン ド に な った 。. ・Backwardmnerpnmer. 近 縁 種 間 識別 試 験 お よび検 出感 度 にお け る. Fig.1PrimerimageofLAMP.. リア ル タイ ム ーLAMP天 る πp3卿. 然 環 境 試 料 に含 まれ. ρρ炬1αmの 定量 化 を行 うた め に,リ ア. ル タイ ム濁 度測 定 装 置Realoop‑30(モ. リテ ッ ク. ス)を用 い た定 量 化 の検 討 を行 っ た。LAMP反 で は,反 応 副 産 物 として,DNA鎖. 応. が伸 長 す る際. に遊 離 した リン酸 と反 応 バ ッフ ァー 中の マ グネ シ ウ ムイ オ ンが 結 合 して ピロ リン酸 マ グネ シ ウ ムが 生 成 され る。 働 この ピ ロ リン酸 マ グ ネ シ ウム は DNA鎖. 物 を電気. の 伸長 と比例 して蓄 積 し白濁 してい くた. め,一 定 時間 ご とに濁 度 の測 定 を行 うと,指 数 関 数 的 増 幅 曲線 を得 る こ とが で きる。 初 発 のDNA 量 が多 い ほ ど増 幅 産物 量 が検 出 可能 な量 に達 す る. 一138一. PCR法. とLAMP法. の比 較. 従 来 法 で あ るPCR. 法 と新 規 検 出手 法 で あ るLAMP法. の どち らが近. 縁 種 間 の識別 お よび検 出感 度 に優 れ て い るか の比 較 を 行 っ た 。16SrDNAを nested‑PCRで. 標 的 とした. は,冷 水 病原 因菌 と して 分離 され. た43株 の うち41株 で1089bpの. バ ン ドが確 認 で. き た 。 近 縁 種 で は,0如 わ∂1認伽 α加 にお い て,DNAの. θo加06θ 蜘 加 増幅 が見 られ た が,. π .ρ5卿 ρρ血1α加 と異 な る サイ ズ のバ ン ドで あ った(Fig2)。 璽 β を標 的 と したPCRで した冷 水 病原 因菌41株. で1017bpの. は,供 試 バ ン ドが確. 認 で きた。 近縁 種 にお い て は,π 力ゐη5α舶aπ.
(3) 拐θvθ 皿8Gπ. わ盟 刀(か'ρ ρ炬1αzη,刃ag召a掘 θお よ び. πoo1召 塑 ηaハθの 計5株 が 見 られ た が,こ を 長 く行 い,サ. で 紛 ら わ しいDNAの. の うち4株. につ い て は電気 泳 動. イ ズ の 異 な るDNA断. と を確 認 し た(Fig.2)。 πag凹 p釧 α伽 ρρ血 んmの. 増幅. 片であるこ. 堀 θに 関 して は,π. 継8PCR産. 物 と 同 じサ イ ズ. の バ ン ドで あ っ た 。7∂ η8u皿arα 加 は16SrDNA お よ び 餌Bの. 両 方 のPCRに. お い てDNAの. は 見 られ な か っ た 。 一 方,LAMPで 同 様 に冷 水 病 原 因 菌41株 られ,近. rDNAを. で の みDNAの. 増幅 がみ. 場 合,1反. 検 量 線 の作 成 と様 々 な増 殖 段 階 の π 応. で 検 出 した 。 甜 沼 を標 的 と し. は1反. 一 方 王AMPで. 増幅. 検 出 限 界 試 験 で は,16s. 標 的 と したnested‑PCRの. あ た り101cellsま たPCRで. は,PCRと. 縁 種 に お け る ま ぎ らわ し いDNAの. は な か っ た(Fig.3)。. 増幅. 応 あ た り104celsま. で検 出 した。. は ,107〜102ceIlsま. い 検 出(r2=0.99)が. で信 頼 性の高. 可 能 で あ っ た。. p班c伽1ρ 鯉 ㎜ に含 まれ る 紹 沼 コ ピー数 の把 握 SG990302株 DNAを. の各 増 殖段 階 の細胞 か らゲ ノム. 抽 出 し,そ れ らを鋳 型 としてLAMPを. 行. った 。 同 時 に検 量線 作 成 用 の標 準 物 質 で あ るg照BPCR産. 物 の希 釈 系 列(10コ. ピー か ら109コ ピー)を 作成 し,こ れ らを用 い て. 1234567891011. 響聯. 王AMPを. 16SrDNA. 行 っ た。そ の結 果,信 頼 で き る検 量線(y. =‑0 .2007x+15.247,r2=0.99)が. 得 られ,こ の. 検 量 線 か ら,丑 ρ釧 ぬ ρρ炬1α加 のgπ β が2〜3コ ピー/celで あ る こ とが 明 らか にな っ た。 天 然 試 料水 中の πp珊c互mlρ炬1㎜ 数 の定 量 化 天 然 環 境 中に は,PCR反. 応 を阻 害す る物 質 が多 数. 存 在 す る こ とが知 られ て い る。5)そ こで,実 際 に. 1234567891011. }二. どれ ほ どの阻 害 を受 け るの か,ま た 阻害物 質 の影. 濫. 餌 β. 響 を受 けて もそれ を補 正す る こ とが 可能 な の か を 検 討 した。検 量 線 作成 用 の8yz8PCR産. 物 を 内部. 標 準 と して 加 えた試 料 中に反 応 阻 害物 質 が 含 まれ て い る場 合,DNAの. 増 幅 が抑 制 され,検 量 線 か. らず れ る こ とが 予想 され る。しか し,全 て のDNA 増 幅反 応 が 同程 度 に阻 害 され るた め,ず れ た検 量. Fig.2Agarosegelelectrophoresispatterns ofPCRproducts.Lane1:ノ1五 lane2:丑. ゐアゴa飴NBRC14958;lane4:E五 NBRC14960;lane5:丑. lane7:0わa1α5孟. DNA溶. 系 列 を各1μ1ず つ加 え てLAMP反. ヱηaz1孟加HZηNBRC15946;. 物希 釈. 応 を行 った。. 予 想 通 り,天然 試料 に 内部標 準 物 質 を加 えた 場合,. 」 【 η刀arθNBRC100251;lane10:. 訪rρ ρゐガ 召zηNBRC;lane11:7. az18u171arロ. 液2μ1に 既 知 濃 度 の 卵zBPCR産. ∂血1θNBRC15052; 力1ロ1ηNBRC15053;lane8:. 7b刀acゴ 加ou1ロzロ 1ane9:1πoo1召. が で き る と考 え られ る。 天然 河 川水 か ら抽 出 した. θyθη8θ わraη αhゴgρ加1ω η. NBRC15030;lane6:Eagα. 1πp釧. 線 か らも標 的 遺伝 子 の初 期 存 在 量 を見積 も る こ と. ηゴIIImarker;. メoゐη50加aθNBRC14942;lane3:丑. 増 幅 の 立 ち上 が り時 間 が検量 線 よ りも少 し遅 くな. ヱ ηM93.. った 。 しか し立 ち上 が り時 間 が全 体 的 に 同 じだ け ず れ た た め,相 関係 数 が1に 近 い,信 頼 で き る検. 一139一.
(4) 量線(y=‑0.1973x+15.047,r2=0.99)を. 得 ること. が で き,阻 害 物 質 の 影 響 を 無 視 す る こ と が で き た 。. 研 化 学株 式会 社 が 独 自に 開発 した. 新 しい遺 伝 子 増 幅 法 で あ る。1)LAMPで. る4種 類 の プ ライ マ ー を使 用 す る。それ ゆ え,PCR よ りも特 異性 の 高 いDNA増. 幅 を行 うこ とが で き. る。 反 応 は,鎖 置換 型 で行 われ,標 的 とした遺 伝 子 領 域 を繰 り返 し持 つ 長 いDNA鎖. 16SrDNAを 101cels分. め,実 験 器 具 や 実験 室 で の コ ンタ ミネ ー シ ョンの. が 合成 され る。. りも速 い 。. 標 的 としたnested‑PCRを の鋳 型 か らDNAの. 現 在,新 規 検 出 手 法 を用 い て 天 然 環 境 で の 刃 、 ρ8卿 坦 ρ鯉 ωη の分 布 調査 を行 って お り,従 来 法. は,PCR. とは 異 な り,標 的遺 伝 子 の6箇 所 の領 域 を認 識 す. この反 応 はPCRよ. 幅 か ら検 出 ま で が1ス テ ップ で行 え るた. 心 配 もな か った 。. 考察. LAMPは,栄. DNA増. 行 うと,. で は検 出 され なか った場 所 か ら も本 菌 を検 出 して い る。例 え ば,こ れ ま で はア ユ が遡 上 で き ない こ とか ら本 菌 がい ない とされ て きた上 流 域,水 生 生 物,お よび底 泥 に も本菌 が存 在す る こ とが わ か っ て き た 。 本 手 法 は 細 菌 だ け で な くDNAお RNAウ. よび. イル ス等 に も適用 す る こ とが で き るた め,. 今 後 は他 の魚 病 へ の適用 も考 えて い る。. 講. 増 幅 が行 わ れ た。. nested‑PCRはPCRを2回. 繰 り返 して 行 うた め,. 供 試 菌 お よび試 料 水 を提供 して い た だ いた 滋賀. 少 な い鋳 型 か らDNAの. 増 幅 が 可能 に な る方 法 だ. 県水 産 試 験 場 に 深謝 す る。本 研 究 の 一 部 は滋 賀 県. が,そ の分 手 間 と時 間 が かか り,実 験 室 や 器具 の. の受 託 研 究 費 に よ り行 った。. 汚 染 が 生 じる危 険 性 もあ る。 ま た,16SrDNAの nested‑PCRで. 文献. 陽 性 に な っ て も,抗. 刃 1)Notomi℃OkayamaH,MasubuchiH,Ybnekawaエ. P8卿. 坦 ρゐガωη 抗 体 が 反 応 しない 株 が 検 出 され. WatanabeKAminoN,HaseTLoop‑mediated. て い る。 こ の た め,冷 水病 細 菌 の判 定 に は,16S rDNAお. よび8皿Bを. 標 的 と したPCRに. よ る ダブ. isothe㎜alamph丘cationofDNA凡1(ゾ. θ兜 ∠4(ゴ ゐ 」 配θ鼠. 2000;28:e63.. ル チ ェ ックを行 うこ とが 定 め られ て い る。しか し, 2)Tbyama℃KitaTsukamotoK,WakabayashiH.. ∬ 召 を標 的 と したPCRで. は104cels以 上 の鋳 型. が な い と検 出 で きな いた め,PCR法. Identi丘cationof(加. ρpha岬. 」 ρ釧cんrqρ 曲byPCR. を用 い た場 合. の検 出感 度 は 非 常 に低 くな っ て しま う。鯉 を ホモ ジナイ ズ して 得 た細 菌 懸 濁液 や 寒 天 平板 で分 離 し. targetBd16SribosomalRNA.乃. 訪 、 ぬ 功oZ1994;29:. 271‑275. 3)IzumiS,WakabayashiH.Sequen(注ngof8ア. 沼and. た コ ロニー を対 象 に した場合 は,細 菌 量 が 多 い の で,PCRを. 用 い た判 定 が有 効 で あ る。河 川 な どの. theirapPhcationintheidenti丘cationof 泓voわaα. 冶㎡ ω η. 天然 環 境 を考 えた 場 合,総 細 菌数 は105‑6cels/m1. .ρ 釧 ヒ 血 ηρ弼u1ηbyPCR几8ゐ. ぬ 訪012000;35:93。94.. 程 度 で あ り,刃 .ρ θ 勲 坦 ρゐ17ω ηが104celsも. 含ま. 4)Mo垣YNagami皿eKTbmitaNNotomiT. れ て い る状 態 とい うの は 考 え に くい 。 さ らに, Detectionofloop‑mediatedisothe㎜al. PCRに. よる ダ ブル チ ェ ックで は,ゲ ノム抽 出操 作 amph丘cationreactionbyturbi(htyderivedfピom. を含 ま な いDNA増. 幅 と検 出 とい う作 業 だ けで12 magnesiumpyrophosphatefbrmation.盈. ゜励 α η.. 時 間以 上 か か っ て しま う。 これ らの こ とか ら,多 莇 ゜ρ ρゐッβ.、 配θ5。6bη21ηu11.2001;289:150。154.. 数 の試 料 を扱 うこ とが予想 され る現 場 環 境 の モ ニ 5)M皿erDN,BryantJE,MadsenEL,GhiorseWG.. タ リ ングや,対 処 に急 を要す る養 殖 魚 の病 気 診 断 EvaluationandoptimizationofDNAextractionand. 等 の場合 には,実 用 的 な方 法 とは 言 え な い。 本 研 究 で我 々 が開 発 した新 規検 出方 法 で は,60分 以 内. puri丘cationproceduresfbrsoiandsediment samples.4ρ. に101コ ピー ま で検 出 が可能 で あ った。 さ らに, 4715。4724.. 一140一. ρZ、 翫 ㎡10nM}°. α り加oZ1999;65:.
(5)
関連したドキュメント
白e simp1巴 combination of exis也19ICA 組d SS.τbis is a promis ing evidence白at白巴proposed BSSA has an applicability to noise 血cluding permutation robust
: Folding transition of a single DNA chain in the presence of a inultivalent cation(poster presentation,Soft Matter as Structured Materials).
The plane-wave impulse approximation (PWIA) has been used in the calcula- tions on the spectator model. The PWIA calculation, however, gives the cross section
Electrostatic solitary waves associated with magnetic anomalies and wake boundary of the Moon observed by KAGUYA Hashimoto, K.; Hashitani, M.; Kasahara, Y.; Omura, Y.; Nishino,
乃θThicんπθ∬．・f Silvefr o乃1∂7劾」剛彫Pア・伽ed et・・
( 1 ) 与えられた集合の階層的構造(階層的分類)を求めること.. Ward 法については， もとの論文 [5] よりも Wishart
医療の情報科学 (総合報告;日立，神沼) 従来の探索理論で，とかくなおざりにされてきた
The electronic and solvation structures of N,N-dimethylaniline in acetonitrile are examined by means of the ab initio reference interaction site model
