病理検査とコンパニオン診断
病理科部 荻野 哲朗
当院病理科部の守備範囲
✤
院内でできること
細胞診（特殊染色を含む）
病理組織診（特殊染色を含む）
免疫組織化学（酵素抗体法）
術中迅速診断
病理解剖
✤
院内ではできないこと
免疫組織化学（ 酵素抗体法の一部， 蛍光抗体法）
電子顕微鏡
遺伝子検索（FISH, CISH)
喀痰細胞診
平上皮癌
細胞診検査の推移
0
3,000
6,000
9,000
12,000
15,000
2007
2008
2009
2010
2011
2012
特殊染色枚数
Pap染色枚数
婦人科検体数
その他検体数
細胞診検体数
（検体／枚数）
（年）
13,371 8,316 5,283 3,584 1,718 4,967 1,706 12.868 8,107 3,656病理組織検査の推移
件
件
0
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
2007
2008
2009
2010
2011
2012
組織検査件数
HE染色枚数
（件数／枚数）
（年）
特殊染色枚数
免疫染色件数
187 274 291 411 488 20,994 10,843 6268 23,031 13,839 6537 595病理解剖
〈目 的〉
✤
学問研究として
✤
医療評価機能として
✤
国民死亡原因の解明
〈病理解剖の実施〉
大学等の教授，助教授
死体解剖資格
(厚生労働省認定）保健所長の許可による
遺族の承諾が必要
実施場所の制限
死体解剖資格
✤
医師または歯科医師
適切な研修施設
・大学の解剖学・病理・法医学
・病院または研究室（年間１０体以上の剖検例）
解剖に関する研究業務
２年以上の解剖に関連する研究業務
２０体以上について解剖業務
（直近５年間 解剖補助５以上／主として解剖 １５体以上）
✤
医師または歯科医師以外 別途認定基準
死体解剖資格認定要領 改正 平成15年12月16日病理解剖数の推移
0
5
10
15
20
25
30
2007年
2008年
2009年
2010年
2011年
（日本病理剖検輯報より）解剖数
香川大学病院 香川県立中央病院 高松赤十字病院 高松市民病院 三豊総合病院 香川労災病院コンパニオン診断
（Companion diagnostics; CoDx or CDx）
✤
Companion
ある行動を共にし親密な関係にある仲間
(研究社 新英和中辞典）
✤
特異的な分子標的治療との組み合わせ
標的分子の有無
遺伝子多型
患者の層別化
癌化学療法の分子標的
実験医学 2004;22(14）増刊:1954-1959．図１を改変癌遺伝子産物
シグナル伝達系
サイトカイン
増殖因子/レセプター
細胞形態形成
膜酵素
転移・血管形成
分化抗原・分化誘導因子/レセプターアポトーシス
細胞周期
耐性・感受性因子
転写因子
DNA複製/修復，テロメア
遺伝子治療
P13K PTEN SOS PDK1 Akt MDM2 BAD GSK-3 FoxO3 p53 bCl-2 Cyclin D1 p70 S6K mTOR ErK MEK Raf JNK MEKK STAT Rac Ras GRB2 SrC JAK TK TK TK P P Cetuximab
Panitumumab HER1 HER2 HER3 HER4
HER2 HER3 など （他のHER2ファミリー） リガンド P Gefitinib Eriotinib HER2ファミリー シグナル経路
核
転 写
増 殖
細胞回転⇧ タンパク合成 mRNA 翻訳 PIP3 アポトーシス↓ 細胞の生存 eIF4E Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Trastuzumab Pertuzumab Lapatinib MyC TK 病理と臨床 2011;29増：262−265病理検査に関連するコンパニオン診断
•
乳癌
HER2発現
遺伝子増幅
•
胃癌
HER2発現
遺伝子増幅
•
胃腸管間質腫瘍
c-Kit 発現
c-Kit, PDGFRA遺伝子変異
•
大腸癌
EGFR発現
KRAS変異
•
肺癌
EGFR変異
ALK転座
タンパク発現 免疫組織化学(IHC) 法
遺伝子増幅 in situ ハイブリダイゼーション(ISH) 法
遺伝子変異 PCR法
病理コンパニオン診断の過程
診断/検査の分類 バイオマーカ ーの種別 プレアナリシス アナリシス ポストアナリシス IHC検査 タンパク発現 検体採取 保存・固定 ↓ ホルマリン固 定/切り出し ↓ パラフィン ブロック ↓ パラフィン切片 IHC法 定性的評価 半定量的評価 計数的評価 ISH検査 遺伝子増幅・ 相互転座 検体採取 保存・固定 ↓ ホルマリン固 定/切り出し ↓ パラフィン ブロック ↓ パラフィン切片 FISH法 Bright-field ISH法 計数的評価 体細胞遺伝子検査 遺伝子変異 検体採取 保存・固定 ↓ ホルマリン固 定/切り出し ↓ パラフィン ブロック ↓ パラフィン切片 Direct sequence法 Scorpion-ARMS法 PNA-LNA PCR clamp法 PCR-Invader法 Cycleave PCR法 PCR-γSSO法 各判定基準によ る評価乳癌のコンパニオン診断
✤
Estrogen receptor (ER)
Immunohistochemistry (IHC)
✤
Progesterone receptor (PgR)
Immunohistochemistry (IHC)
✤
HER2: Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
HER2 タンパク過剰発現
Immunohistochemistry (IHC)
HER2 遺伝子増幅
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
Chromogenic in situ hybridization (CISH)
HER2検査フローチャート
FISH法を最初に IHC法を最初に+
−
3+
2+
1+/0
IHC法
FISH法
ハーセプチン 適応あり ハーセプチン 適応あり ハーセプチン 適応にならない乳癌組織
ハーセプチン 適応にならない HER2検査ガイド第３版 （トラスツズマブ病理部会作成，2009年9月）HER2免疫組織化学の判定基準
スコア 癌細胞の染色パターンと判定基準
３＋
強い完全な細胞膜の陽性染色 ＞30％
２＋
①弱∼中等度の完全な細胞膜の陽性染色 10％
②強い完全な細胞膜の陽性所見 10％， 30％
１＋
①かすかな細胞膜の染色 10％
②細胞膜のみが部分的に染色
0
①細胞膜に陽性所見なし．
②あるいは細胞膜の陽性所見 ＜10％
（細胞質に限局する陽性染色は判定対象外） HER2検査ガイド第３版 （トラスツズマブ病理部会作成 ，２００９年9月）体外診断医薬品承認
FISH/CISH用プローブキット
体外診断医薬品として承認されているFISH用プローブキット 体外診断医薬品として承認されているFISH用プローブキット 体外診断医薬品として承認されているFISH用プローブキット 体外診断医薬品として承認されているFISH用プローブキット 体外診断医薬品として承認されているFISH用プローブキット 製品名 （製造元） 製品名 （製造元） パスビジョンHER2 DNAプ ローブキット （アボットジャパン）HER2 FISH pharmDx 「ダコ」 （ダコ・ジャパン） ヒストラHER2 FISH キット （常光） 工程 時間 1日目 ハイブリダイゼーション 2日目 170分 14~18時間 32分 103分 16~20時間 27分 107分 over night 36分 工程 前処理 脱パラ 塩酸処理：RT 20分 熱処理：80℃ 酵素処理：37℃ 10分 脱パラ 熱処理：95℃ 10分 酵素処理：RT 10分 脱パラ 熱処理：95~98℃ 20分 酵素処理：37℃ 10分 工程 反応系 ディネーチャー:72℃ 5分 ディネーチャー ハイブリダイザー ディネーチャー:85℃ 5分 ホットプレート 工程 発色系 HER2 CEP17 spectrum orange spectrum green Texas red FITC rhodamine fluorescein その他 観察に専用フィルター要 体外診断医薬品として承認されているCISH用プローブキット 体外診断医薬品として承認されているCISH用プローブキット
FISH 法の判定基準
判 定
内 容
陽性
HER2/CEP17比 ＞2.2
（または, HER2遺伝子コピー数の平均値が核１個あたり＞６）equivocal
HER2/CEP17比 1.8∼2.2
（または, HER2遺伝子コピー数の平均値が核１個あたり４∼６）陰性
HER2/CEP17比 ＜1.8
（または, HER2遺伝子コピー数の平均値が核１個あたり＜４） 日本では（ ）内の判定を用いるような体外診断用医薬品は承認されていない HER2検査ガイド第３版 （トラスツズマブ病理部会作成，2009年9月）HER2 FISH
17 cen
17 cen
HER2
HER2
p
q
HER2/17cen(CEP17)比＝1.0
HER2/17cen(CEP17)比＝5.0
陰性
陽性
病理と臨床 2011;29増：266−271 図2当院の乳癌HER2検査結果
20%
2%
10%
13%
40%
14%
HER 2 検査
(2005年∼2013年7月）Score 0
Score 1
Score 2
Score 3
FISH 陽性 陰性 22% 21% 4% 1% 16% 8% 4% 17% 40% 41% 15% 15% Score 0 Score 1Score 2 FISH 未検査 Score 2 FISH 陰性 Score 2 FISH 陽性 Score 3
2005年∼2011年3月 262例
2011年4月∼2013年7月 119例
Score 2 25.9% → 24.4%
FISH陽性率 12.8% → 20.8%
未検査381例
American Society of Clinical Oncology-College of American Pathologists Guideline
Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer
American Society of Clinical Oncology-College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer
American Society of Clinical Oncology-College of American Pathologists Guideline
Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer
American Society of Clinical Oncology-College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer
消化管のコンパニオン診断
• 胃 癌 HER2 タンパクの過剰発現
遺伝子の増幅
• 胃腸管間質腫瘍
（GIST：
G
astro
i
ntestinal
S
tromal
T
umor)
c-kit タンパク，遺伝子変異
PDGFRA遺伝子変異
•
大腸癌 EGFRタンパクの発現
KRAS遺伝子変異
ToGA試験
11.4%
11.8%
18.6%
58.2%
94 1815 96 514 212 176 354 19症例数 3,280例
Score 1 610例
Score 0 1,909例
Score 2 388例
Score 3 373例
FISH陽性率 23.0％
HER2-免疫組織化学
Lancet 2010;376:687-6974.9%
15.7%
54.6%
94.9%
胃癌のHER2検査成績
33
1
3
Score 3 Score 2 Score 1 Score 0
3
1
13
20
8.1%
2.7%
35.1%
62.5%
2010年11月〜2013年8月
胃癌症例 ３７例
（男性２５例，女性１２例）
生検：３２例
手術： ５例
陽性
陰性
（Score 0, Score 1)
Score 2
胃癌における使用抗体による反応性の違い
SV2-61γ
HercepTest
4B5
21％ 20％ 13％ 16％ 12％ 5％ 21％ 13％ 3％ 49％ 62％ 86％Score 0
Score 1
Score 2
Score 3
癌と化学療法 2013；40：755−759
症例 107例 (手術検体 89例 生検 18例）
Score 3 + Score 2/FISH陽性 14.0％
Score 3 + Score 2/FISH陽性 29.9％
• 1.過剰発現しているHER2タンパクの局在：乳癌では細胞膜全周性であるが，胃癌では癌細胞の側 方ある
いは側方と基底側の細胞膜にみられ，内腔
側には見られない
•
項 目
胃 癌
乳 癌
標本作成のプロセス 共 通 固定液 ：10％中性緩衝ホルマリン 切除標本：6時間以上48時間程度 6時間以上48時間程度 共 通 固定液 ：10％中性緩衝ホルマリン 切除標本：6時間以上48時間程度 6時間以上48時間程度 染色方法−試験試薬 共 通共 通 スコアリングの方法 染色強度に基づくスコアリングは共通染色強度に基づくスコアリングは共通 HER2発現様式 腫瘍内の均一性 発現部位 不均一性が高い 側方／側方・基底膜側 均一性は80％以上 細胞膜の全周性 HER2検査 IHC法 FISＨ法 検査の順序 切除：陽性癌細胞が10%以上 生検：陽性癌細胞 １集塊 以上 陽性：HER2／CEP17 2.0 IHC法を先行して実施 陽性癌細胞が30%以上 陽性：HER2/CEP17 2.2 境界域：1.8∼2.2 いずれを先行させてもよいGIST(胃腸管間質腫瘍)
のコンパニオン診断
• c-kit（CD117）
（免疫組織化学）
• c-kit 遺伝子変異
（ダイレクトシーケンス法）
•
PDGFRA遺伝子変異
PDGFRA: platelet- derived growth factor receptorα gene (血小板由来増殖因子受容体α遺伝子）
消化管の間葉系腫瘍
（2008年10月∼2013年8月）
胃手術 胃生検 十二指腸 小 腸
大 腸
合 計
GIST
11
1
2
3
0
17
平滑筋腫
2
1
2
5
広義の微小GIST
10
10
神経鞘腫
1
1
合 計
23
2
2
3
3
36
GISTの免疫組織化学
HE
SMA
Desmin
c-kit
CD34
S100
GIST(胃腸管間質腫瘍)の診断
HE染色標本でGISTの可能性
免疫染色の実施
腫瘍内科もしくはGISTを専門とす る医師のいる施設へのコンサルト c-kit, PDGFRAの遺伝子変異検索GISTの確定診断
KIT
CD34
Desmin
S100 protein
GIST
平滑筋腫
神経
腫
＋
−
＋
＋あり
−
ともに−
c-kit, PDGFRAの遺伝 子変異の検索も考慮大腸癌のコンパニオン診断
• EGFR タンパクの発現
免疫組織化学（IHC)
• KRAS 遺伝子変異
PCR-rSSO法 ダイレクトシーケンス法
ARMS
(amplification refractory mutation system)
-PCR法
EGFR 保険点数： 690点 KRAS 保険点数：2,100点
