九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
本格焼酎の品質向上と酵母育種に関する研究
工藤, 哲三
https://doi.org/10.11501/3088191
第5章 優良キ ラー焼酎酵母の造成及び その遺伝 ・ 育種と実用化試験
5 . 1 緒 日
雑菌の混入防止策は 、 微生物を取り扱う生産工程には 必要不可欠な技術であるが 、 開放発酵方式による清酒や 焼酎等の伝統的な醸造工業に おい ては 、 雑菌の混入を完
全に防止する こ とはかなり難しい 。 発酵系に侵入する雑 菌は細菌 、 糸状菌及び野生酵母等多種多様であり 、 中で も優良培養株と同種の野生酵母に対しての有効な侵入防 止法はほとんどない
醸造酵母はそれ ぞれの酒類に応じ て長年かけて選抜さ れた 優良株であり 、 焼酎酵母である宮崎酵母もその 一 つ である 。 前章で述べたように焼酎穆より検出される野生
酵母は大部分が キ ラー感受性酵母であり 、 野生キ ラー酵 母の存在は稀であ っ た 。 本章では 、 こ のような状況を考 慮に入れて 、 野生酵母の混入を防止し移管理を容易にす る こ とを目的として 、 キ ラー プラ ス ミドの宮崎酵母への 導入を行い 、 野生酵母の増殖を抑制する機能を有する酵 母の造成を試み た 。
プラ ス ミドの導入法としては 、 性的援合や細胞融合等 の細胞質のみならず核の融合を伴う方法や 、 細胞質のみ を目的の菌株に導入する細胞質導入( C y t 0 d u c t i 0 n )法な
どがある 。 一般的な↑生的接合や細胞融合法では 、 両者の
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核の合体により雑種が生まれ優良性が損なわれる危険性 がある 。 大内らは 、 こ の雑種化を防ぐ方法とし て反復戻 し交配法14 4 )や核融合欠損変異株( karl)を利用する
Cytoduction 145)法により優良清酒酵母のキラー化を実 現し てい る
本研究では 、 核融合欠損変異株を用いたCe 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法と Cy t 0 d u c t i 0 n法により焼酎酵母のキラー化を
試みるこ とにした 。 キラー形質とし てK 1及びk 2を選んだ 。 K 1のキラートキシ ン はK 2のキラートキシ ンに比較し て耐
熱性はないがキラー活性は強く 、 一方K 2トキシ ン は30 OC におい ても失活しにくい 。 焼酎穆では穆温度が30 OCを超
えるこ ともあるので 、 育種したキラー宮崎酵母の野生酵 母に対する淘汰能力に つい て試験醸造を行い検討するこ とにした
5 . 2 実験方法 5 . 2 . 1 使用 菌株
表5- 1に使用した菌株を示す 。
5 . 2 . 2 C e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法による焼酎酵母
のキラー化
ホモ タリズム酵母である宮崎酵母を胞子形成培地にお い て胞子形成させ 、 その菌体 の一白金耳をZ y m 0 1 y a S e
1 0 0 T (生化学工業; 1 m g / 10m 1 )液に懸濁させ 、 30 OC 、 15分 処理後Y P D薄層プレ ート上に接種し た 。 胞子嚢中に4個の
困 株
用使
表5-1
現 型 型 - 表
子伝
株 遺 菌
KIL-b(k1)]
KIL-b (k2)] [next-o]
a/α pho 3 α his4，kar1^'1[
a his4，kar1^'1[
a leu-1，kar1^'1 α his4^'15，kar1^'1
a/α 5055
T-101 (野生焼酎酵母) 宮崎酵母
5038 5 170 5044
-山山『守』
択 培
表5-2 選
%
%
% 0.67 2.0 5.0 base
nitrogen グルコース
AB混液残 寒天 Yeast
2.0 %
※AB混液100ml中の組成
Tryptophan，Arginine，Methionine 各48mg Tyrosine，Leucine，Isoleucine，Lysine 各72mg Phenylalanine 1 20mg，Aspartic acid 200mg，
Valine 300mg，T hreonine 400mg ，Uracil 48mg Adenine sulfate 200mg
132 -
胞子を形成し てい る胞子嚢を 、 L e i t z製ミク ロ マニ プレ ーターを用い て胞子解剖を行い 、 単胞子をYPDプレ ート
上に4 m m間隔で碁盤目状に並べた 。 こ のプレ ートを 、 3 0 OCで4 � 6時間ふ卵器中で培養した 。
ホ モタリズム酵母の単胞子は 、 胞子発芽後2度目ある
い は3度目の分裂に おい て性の転換が起こ り 、 未転換の 細胞と転換 した細胞の問で接合が起こ る 。 従 っ て 、 胞子 は発芽後2回目の出芽までは接合能を有し 、 ヘテ ロ タリズ ム酵母の a(または α)型単相株と α(または a)型胞子と の間のC e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n gが可能である 。
単胞子培養後 、 プレ ート上に並べた単胞子のそれぞれ に 、 キラー親株の単相株をミク ロ マニ プレ ータ で援触
させ 、 3 0 OC 、 4 8時間培養した 。 各交雑で得られる コ
ーを最少培地(グル コ ー ス2 % 、 y e a s t n i t r 0 g e n b a s e o . 6 7 % 、 寒天2 % )に移植し3 0 OC 、 4 8時間培養後キラー検 出用YP D - M Bプレ ートにレ プリカを行 った 。 キラー活性を 有し最少培地で生育する コ ロ ー をキラー導入株とし て
選択した 。
5 . 2 . 3 細胞質導入(C y t 0 d u c t i 0 n )法による焼酎酵母の キラー化
C y t 0 d u c t i 0 nの方法はおおむね西谷ら1 '" 6 )の方法に従 い 菌体調製 、 プロ トプラ スト形成 、 融合 、 細胞壁再生及
ぴ融合株の濃縮を行 った 。 すなわちYP D培地で3 0 OC 、 24
時間培養した前培養菌体o . 2 m 1を同培地50 m 1に後種し、
3 0 OC 、 9時間振と う培養を行 った 。 培養液を3， 000 r p mに て遠沈集菌し、 滅菌水で2回洗浄後、 2. 5 m 1のS T溶液(1 M
S 0 r b i t 0 1、10mM T r i s -H C 1 p H 7 . 4 )に懸濁後、 o . 5 M E D T A
(pH 7.5) O.lml、 β-m e r c a p t 0 e t h a n 0 1 O. 0 5 m 1を添加し 3 0 OC 、 10分間加温した 。 遠沈集菌後2. 5 m 1のS T溶液で洗 浄し、 o . 25m g Z y m 0 1 y a s e 1 0 0 Tと10mM E D T Aを含むS T溶液 2 . 3 m 1加え 、 30 OCにて10 "-' 3 0分間浴菌した 。
集菌後S T溶液で2回洗浄しS T C溶液(1 M s 0 r b i t 0 1、 10mM T r i s -H C 1、 10mM C a C 1 2 、 pH 7 . 4 ) 1 m 1に懸濁させた 。 融合
相手株も同様の処理を行い 、 両者をほぼ同じ菌数でS T C 溶液に 混合し30 OC 、 1 5分間振と うした 。
集菌後1 m 1のP T C溶液(3 5 %ポリエチレ ン グリ コ ー ル40 o 0、 10mM T r i s -H C 1 p H 7 . 4 10m M C a C 1 2 )を加え 、 30 OC 、 2 0分間融合処理した 。 集菌後S T C溶液で2回洗浄しo . 5 m 1 のS T C溶液に懸濁した 。 そのo . 1 m 1を1 M s 0 r b i t 0 1を含む ヒ スチジ ン を抜い た選択培地(表5 - 2 )に塗沫し 、 同培地 を重層後30 OC 、 7日間培養し細胞壁の再生を行 った 。
次に再生プレ ートを破砕しヒ スチジ ン を抜い た選択培 地50 m 1に入れて25 oc 、 4 8時間培養した 。 こ の1m 1をとり 、 融合相手のキラー親株の培養液1m 1とともにpH 4 . 5 のY P D 培地10 0 m 1に加え て25 oc 、 4 8時間培養し、 キラー化して
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い ない 宮崎酵母を殺し 、 次にヒ スチジ ンを抜い た選択培 地に上記のY P D液体培地の培養液より1 m 1加え 、 添加した キラー親株数を減少させた 。 こ の操作によりキラー化し た宮崎酵母を濃縮し 、 目的の融合株の遺伝標識である酸 性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有せずキラー活性のみを有する
コ ロ ニーを選抜した 。 5 . 2 . 4 4 分子解析
得られた融合株の遺伝解析は胞子解剖により行 った 。 胞子形成及びミク ロ マニピ ユ レ ー シ ヨ ンは第3章に記載
した方法に準じた 。 融合株の核融合はヒ スチジ ン要求性 、 酸性ホ ス ブ ア ター ゼ活性及びキラー活性によ っ て確認し た 。
5 . 2 . 5 D N A含量の測定
D N A含量の測定はBurtonの方法を改変したAiglel-47)ら の方法に従 った o Y P D液体培地5 0 m 1を用い て28 oc 、 24時 間培養後 、 遠沈集菌し9%NaCl溶液2 0 0 m 1に懸濁し てヘ マ
トメ ーターで菌数計測した 。 約1 x 1 0 9の細胞数を遠沈集 菌し て採取した 。 こ れにo OCに冷却した2m 1のH C 1 0 4と2m 1
の蒸留水を加えo OC下2 0分間振と うした 。 遠沈集菌後同 操作を繰り返した 。 次に7 0 OCに て2m 1の1 . 5 M 日C1 0 4を加
え3 0分間D N Aの抽出を行 った 。 遠沈沈殿に つい ては同操 作を繰り返した 。 両者を合わせた全上澄液を6 m 1と し 、
こ の2 . 5 m 1に1 . 5 m 1の4 %ジ フ エ ニ ルア ミ ン及びo . 01%の パ ラア ルデヒ ドを含む酢酸溶液 を加え 、 室温で24時間発色 させ 、 6 0 0 n mの吸光度よりDN A含量を測定した 。 DN A標品
はS 1 G M A 社 製さけ精 子 DN A N a s a 1 tを用いた 。 なお細胞数
測定の際 、 出芽したばかりの細胞のうち親細胞の大きさ の約1/3以下の細胞はl個とし て計測せず 、 それ以上の細 胞を1個とみなした 。
5 . 2 . 6 二重鎖- R N Aのア ガロ ー スゲル電気泳動 第4章4 . 2 . 1 2に記載した方法で行 った 。
5 . 2 . 7 発酵試験
5 0 0 m 1容三角フ ラ ス コに麹1 5 0 g 、 水220m 1及び酵母培養 液o . 5 m 1を添加し 、 M e i s s e 1管を付け2 8 ocに て発酵させた 。
また酵母エキ スo . 3 % 、 ペプト ンo .6 %及びグル コー ス 1 5 . 0 %のYP D培地を 、 クエ ン酸によりp H 4 . 0に調整した培 地でも同様な発酵試験を行 った 。
5 . 2 . 8 中間工業規模によ る焼酎仕込試験
宮崎酵母とK 1キ ラー プラ ス ミド を導入した宮崎酵母を 使用し て 、 総原料6 0 k gの焼酎仕込試験を行 った 。 仕込配
合を表5 - 3に示す 。 製麹は河内源一郎商店(株)製自麹 菌を使用し て4 8時間製麹を行 った 。 一次修は25 OCで仕込 を行い 、 30 OC以下で7日間発酵させ二次仕込に供した 。
二次仕込は仕込温度2 6 OCで行い14日開発酵させ 、 熟成謬
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を蒸留した 。
5 . 2 . 9 工業規模による焼酎仕込試験
一日に米 1 6 t及び甘藷 8 0 tを処理する工場におい て試
験醸造を行 った 。 K 1及びK 2を導入した宮崎酵母と鹿児島 工試酵母を使用して甘藷製穆を造りエタ ノー ル収量及び
修中の酵母の純度を検討した 。
5 . 3 結 果
5 . 3 . 1 C e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法によるキラー酵母の 造成
C e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法で宮崎酵母のキラー化を行う
ために使用したキラー親株は核融合欠損株( k a r 1 )である
が 、 こ のka r 1変異株の核融合欠陥は不完全なため雑種の
形成もかなりの頻度で生ずる1.， 8 ) 。 従 って 、 選択培地で 生育しキラー活性を有する コ ロ ニ ーは 、 宮崎酵母にキラ ー プラ ス ミドが導入されたか もしくはキラー親株と宮 崎酵母が核融合をしてい る可能性が考えられる 。 表5- 4 に示すように 、 得られたキラー活性のある コ ロ ニーは 、 酸性ホ ス フ ァ ター ゼ、活性を有する コ ロ ニ ーと同活性のな い コ ロ ニ ーに分かれた 。
宮崎酵母は高リン酸培地で酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を 有しない 。 こ の劣性の遺伝標識は 、 核の融合まで起きて い るのならキラー親株が同活性を有しており 、 核融合株 でキラー活性を有する株は同活性があると考えられる 。
表5-3 中間工業規模焼酎仕込試験の仕込配合
原料
米 大麦
くみ水
一次穆 20 kg
24 L
二次回参
40 kg
66 L
計
20 kg 40 kg 90 L
表5-4 Cell to spore mating法による宮崎酵母のキラー化
回収コロニー 表現型
組み合わせ接合数回収コ 酸性ホスファターゼ(+ ) 酸性ホスファターゼ( - ) ロニー数・余 キラー ( + ) キラー ( + )
宮崎酵母
x 5038(K1) 140 12 10 2
※回収コロニー数はhis-の培地で、生育し、 キラー活性をもっコロニー数
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こ のCe 1 1 t 0 s p 0 r e m a t i n g法で得られた10株のうち8株 は同活性があり核融合株と考え られた 。 こ のこ とを確認 するためにD N A含量を調べたとこ ろ 、 表5 - 5に示すように 同活性のある株は宮崎酵母の約1 . 8倍にな っ て おり 、 核 が融合し ていると判断した 。 一方 、 同活性のない株は宮 崎酵母とほぼ同じD N A含量であ った 。
キ ラー活性を有する株の4分子解析を行 ったとこ ろ 、 キ ラー性を有し酸性ホ ス フ ァ ター ゼ活性のない株は
h i s一:his+ =0:4及びKILL+:KILL- = 4:0に分離した こ とか ら宮崎酵母の細胞質にキ ラー プラ ス ミドが導入され 、 核 は融合し ていないと判断した 。 大島ら1 '" 9 )もこ の方法に よりウイ スキー酵母のキ ラー化を行い 、 同様な結果を得
ている 。
方 、 酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有するキラー株の4 分子解析では 、 同活性を有する単胞子培養株と活性のな い 単胞子培養株に分かれた 。 またヒ スチジ ン要求性に つ い ては要求性のある単胞子培養株と要求性のない 単胞子 培養株に分かれた 。 こ れらに つい ては4分子をそ ろ っ て
回収できた胞子嚢はないが 、 以上の結果より核が融合し ていると判断した 。
Cell to spore mating法による目的株の取得数は2株 のみであ った 。 こ の2株はキ ラー活性が弱いか生育の遅
る よ て
し ら1 " " )も指摘 は大内
‘" と
の L-
ー..，.
。 L-
た
い 株であ つ
ヰAい の形で
中広その
も し に胞子形成の際親株の形質が必ず
つ
る焼酎
。
よ る
細胞質導入( C y t 0 d u c t i 0 n )法に 酵母のキ ラー化
られ
え
と 考 い ない ため
して 胞子に移行
5 . 3 . 2
再生率 と
ト化率 ス
プラ ト
，， ‘•• 、 プロ
r--、 1i
Z y m 0 1 y a s e処理前後の生菌数
ス ト化率は トプラ
ロ プ
再生率は 、 た 。
一数で計算 し ロ
をYP D平板培地上の コ
と
をZ y m 0 1 y a s e処理前菌数
ロ 一数 の コ
ト上 レ
再生プ
の結果を表5-6
。 そ 求めた
して ト化率で除 プラ ス
ト プロ
と再生率は ト化率を高める
ス プラ プロ ト
よ うに 、
に示す
も同様の結果 が 、 本実験で
る 言われて い る3 g}と
低下す
。
た
が得 られ
融合株の濃縮 ( 2 )
酵母の細胞融合に おける融合率は10 -" 以 下 1 5 0 )と かな イ マ ン チ ン
ス で細胞壁再生後の ヒ
L-ー.，.
。 そ り低頻度である
一 親株の 培 養
一フキ
り1 m 1採取 し 液体培地培養液 よ
ス ナ
句"
る L-
で混合培養す にpH 4 . 5のYP D液体培地中
も 液1 m 1 とと
した 添加 し
い ない 宮崎酵母を殺 て
一化 し
一フキ
よ り と
菌数を て
培地で培養 し ナ ス
マ イ ン チ ン
ス 一親株は ヒ
一フキ
-フ
宮崎酵母にキ
。
た
し 目的株を濃縮 方法で
せ る
さ減少
ト ア フ YPD-MBプレ か っ酸性ホ ス て
し し と る株を分離
目的株 れた
を有す
さが導入
一 活 性 ド
一フ ス 上でキ
プ 一フ
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表5-5 Ce11 to spore mating法により造成した キラー宮崎酵母のDNA 含量
供試菌株 酸性ホスファターゼ DNA含量 活性 μg/ 10 Bce 11
宮崎酵母 - 4.34
キラー宮崎酵母(Kt-42) - 4.28
キラー宮崎酵母(K ト3) + 7.43
表5-6各菌株のプロトプラスト化率と再生率
菌株 プロトプラスト 再生率 b 化率 岨(% ) ( % )
宮崎酵母 72.4 2.0
6 5.0 16.2
90.8 1.4
99.2 0.3
5038 (Kt) 48.0 2 5.0
5170 (K2) 45.0 12.3
95.3 8.7
B-86 95.0 4.6
5045 90.2 14.4
a (1-溶菌後生菌数/溶菌前生菌数) x 100
b 再生菌数/(溶菌前生菌数×プロトプラスト化率/100) X100
ター ゼ活性を有しない コ ロ - 5 - 7 )。
( 3 ) 融合株の4分子解析
を選抜した(図5 - 1 、 表
得られた融合株に胞子を形成させ4分子解析を行 った。
表5 - 8に示すように 、 酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有せず キラー活性を保持する単胞子培養株は 、 すべてヒ スチジ
ン要求性がなく最少培地において生育し 、 4胞子全てが キラー性を保持していた。 それ らの単胞子培養株中に は 、 4胞子中キラー活性の脱落した単胞子培養株等も存
在したが 、 大部分はキラー活性を保持していた。
一方 、 酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有しキラー活性も保 持する融合株は 、 胞子回収率が悪く4胞子まとめて回収 できたのは2組のみであ ったが 、 多くの単胞子培養株に ついて調べたと こ ろ 、 ヒ スチジ ン要求性のある単胞子培 養株とそうでない単胞子培養株は 、 ほぼ2 : 2に分かれた 。
こ の こ とから酸性ホ ス ブ ア ター ゼ、活性を有する融合株は 、 核融合し雑種化していると判断した。
( 5 ) 融合株のD N A含量
D N A含量を調べてみると表5 - 9に示すように 、 酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を保有しないキラー活性の融合株は 、 宮 崎酵母と ほとんどD N A含量が変わらなか ったが 、 同活性 を有する株は宮崎酵母の約1 . 7倍と な った。 こ の こ と か
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表5-7 融 合 株 の 濃 縮 出 現 率残
親株 宮崎酵母 宮崎酵母
濃縮処理 5038(K1) 5170 (K 2)
キラー親 2.6 % 2. 1 % 株の添加
hisマイナス 22.5 % 96.9 % 培地による培養
※キラー活性をもち、 酸性ホスフアターゼ、活性のない コ口ニーの出現率
図5-1キラー宮崎酵母のキラー作用
プレート右:YPD-MB培地;キラー活性を示す。
プレート左:酸性ホスフアターゼ活性検出用培地
両プレートの右上:しキラーを導入した宮崎酵母(酸性ホスブアターゼ活性+) 両プレートの左上:しキラーを導入した宮崎酵母(酸性ホスフアターゼ活性ー) 両プレートの右下:んキラーを導入した宮崎酵母(酸性ホスフアターゼ活性+) 両プレートの左下:K2キラーを導入した宮崎酵母(酸性ホスファターゼ活性ー)
表5-8 キラー宮崎酵母の4胞子解析
供試菌株 酸性ホスフア his- : his+
ターゼ活性
宮崎酵母 。 4
キラー宮崎酵母(Kl-27) 。 4
キラー宮崎酵母(Kl-12) + 2 キラー宮崎酵母(K2-67) 。 4 4胞子全て回収した胞子嚢数は上から、 4ヶ、6ケ、2ヶ、5ヶ
表5-9 融合株の DNA 含量
酸性ホスファターゼ DNA含回
KILL +: KILL-
o : 4 4 : 0 4 : 0 (0:4) 4 : 0
供試菌株 活性 μg/108cell
5038 + 2.45
宮崎酵母 - 4.34
キラー宮崎酵母(K1-1) - 4.28
キラー宮崎酵母(K2-58) 4.54
キラー宮崎酵母(K 2-5 ) + 7 . 69
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ちも核が融合し てい る こ とが確認された 。 以上の結果か ら 、 酸性ホ ス フ ア ターゼ活性を有せずキラー活性を保持
する株が 、 目的とする宮崎酵母のキラー化した株である
と判断した 。 なお細胞の大きさも親株である宮崎酵母と ほとんど変わらなか った 。
( 6 ) 二重鎖RN A ( d s -R N A )のアガロ ー ス ・ ゲル電気泳動
図5 - 2 にキラー形質を支配するds-RNAのアガロ ー ス ・ ゲ ル電気泳動の結果を示す 。 キラ一発現に必須のM-d s R N A 及びL 、 Mを含むウイ ル ス様粒子の主要な外被蛋白を コ ー
ドし てい るL-dsRNAが融合株に存在する こ とを確認でき
。た
5 . 3 . 3 キラー焼酎酵母による発酵試験
( 1 ) 発酵経過
図5- 3にY P D培地及び米麹を使用し ての発酵試験の経過 を示す 。 キラー導入株の発酵は その初期におい てやや親 株より遅れた以外ほとんど変わらなか った 。
( 2 ) 香気成分
発酵終了後蒸留を行い 、 蒸留液の成分分析をした 。 表
5 - 1 0に示すように 、 エタ ノー ル収量はキラー導入株の方
が高くなり 、 香気成分の一 つの指標であるA/ B比 1 5 1 )が低
くな ったが 、 官能評価は親株の宮崎酵母を使用した場合 とほとんど区別できない 香気を有し てい た 。
、‘，a''LU LKM ，，Et、
M -d s R N A _-þ. 1 .93
2.23
�- 4.26 L-dsRNA ー炉
�- 6.4 6
�- 9.31
.- 23.3
2 4 5 6
図5-2 キラー宮崎酵母のアガロースゲル電気泳動
1:5170(K2キラー酵母) 2 :キラー宮崎酵母(K2-68) 3 :宮崎酵母
4 :キラー宮崎酵母(Kl-5) 5:5038(K1キラー酵母)
6 : マーカー(HindIII fragment ofλD N A )
- 146 -
� 3 4
5 培養時間(日)(-EC∞円\切)醐湾代決鎚巡
仁αJ
培養時間(日)
」111114lil-- ー寸111!
「te F HJ
3
250円\切)酬策代決鐙巡
1HA斗l
図5-3 キラー宮崎酵母の発酵試験
( a) : YPD培地(グルコース15%，pH4.0)培養温度:280C
( b) :焼酎麹培地(焼酎麹7旬、 水110ml)培養温度: 280C
0:宮崎酵母
ム:キラー宮崎酵母(Kt-5) 企:キラー宮崎酵母(んー58)
: 5038(Ktキラー親株)
表5-10 発 酵 試 験 結 果
菌株 エタノー 酢酸 n-C30H iso-C40H iso-C50H A/B ル収量(ml)エチル P B A
宮崎酵母 45.6 68 190 238 459 1. 93 2.42 1. 25
キラー宮崎
酵母(Kt-5) 47.6 88 181 278 478 1. 72 2.64 1. 54
キラー宮崎
酵母(Kz-58) 51.7 77 183 232 413 1. 78 2.25 1. 27
エタノール以外は、 25%エタノール濃度中の濃度表示mg/L
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5 . 3 . 4 キラー焼酎酵母と野生酵母の混合培養試験 宮崎酵母にK 1及びK 2プラ ス ミドをそれ ぞれ導入した融 合株が 、 実際の焼酎穆におい てキラー作用を発揮し て野 生酵母を淘汰する こ とができるかどうかを確認するため 、
Y P D培地及び全麹式発酵におい てキラー宮崎酵母と野生
酵母を1 : 1の割合の初発菌数を接種し て 培養を行い 、 相 対菌数の変化を検した 。 図5 - 4に示すように 、 K 1より耐 熱性のあるK 2のほうが穆温度3 0 OC以上になる こ ともある 焼酎穆におい て 、 キラートキシ ン は安定したキラー作用 を発揮できるのではないかと考え られた 。 しかし 、 キ フ 一作用の強いK 1は2 5 ocよりキラートキシ ン の失活が始ま るが 、 一度キラー感受性酵母に吸着されたキラートキシ
ン は失活しにく いと言われ ており 1 4 2 ) 、 L-守 の混合培養試 験の結果でも耐熱性のあるK 2キラープラ ス ミドを導入し た宮崎酵母よりK 1キラープラ ス ミドを導入した株のほう が 、 穆中における野生酵母の増殖を抑え る こ とが明らか にな った 。
5 . 3 . 5 中間工業規模による焼酎仕込試験
総原料6 0 k gの仕込試験を行 ったと こ ろ 、 宮崎酵母もキ
ラ一宮崎酵母ともに発酵経過は順調であり 、 酵母数は両 者とも10 Bオ ーダーに達し 、 二次官要最終まで発酵が進ん だ 。 一次穆及び二次穆の最終穆の分析結果を示す表5 - 1 1
100
50
25 渓 75
hw罰Q議掴衣回特 ( a)
100
戸、75 沢
hwb抑Q籍組夜回特
-l
∞O1
5 6
培養時間(日)
。
培養時間(日)
キラー宮崎酵母と野生酵母の混合培養における菌数の変化
培地:YPD(pH4.3) ， 培養温度:30 OC
(a) 0:キラー宮崎酵母(Kl-5) o:T-I0l(野生焼酎酵母) (b) 0:キラー宮崎酵母(K2-58) o:T-I0l(野生焼酎酵母) 図5-4
のように 、 キラー宮崎のほうが若干穆中のエタ ノー ル濃 度が高くなり 、 エタ ノー ル収量は宮崎酵母の23 . 9 Lに対 し24 . 2 Lにな った 。
キラー形質の脱落に つい ては表5 - 1 2に示すように 、 一 次穆におい てはほぼ100 %の コ ロ ニ ーがキラー活性を保 持し てい た 。 二次穆におい ては次第にキラー形質を脱落 したが 、 最終穆では50 %の コ ロ ニ ーはキラー活性を保持 してい た 。
5 . 3 . 6 工業規模による焼酎仕込試験
工業規模で行 った試験では 、 対照とした鹿児島酵母を
使用した穆よりもエタ ノー ル収量が多か った(表5- 1 3 )。
こ の場合 、 親株である宮崎酵母を同工場におい て同条件 下で試験してい ない ので 、 明確にはできない が 、 こ れま
でに記述したように発酵試験や中間工業規模での試験で もキラー化した宮崎酵母の方がエタ ノー ル収量が上昇す る傾向があ った こ と 、 工場規模の試験に対照として用い
た鹿児島工試酵母は 、 鹿児島県のみならず多くの焼酎
場で使用されて 、 エタ ノー ル収量の高い こ とはよく知ら れて おり 、 それを上回 った こ となどから 、 本キラー醇母 は ア ル コ ー ル収量に関して良好と推測した 。
試験醸造では甘藷穆を使用したため品温は二次穆の2
日目及び3日目は30 OCを こ え35 oc前後ま で上昇した 。 し
表5-1 1 一 次、二次最 終穆の分析結 果
供試酵母 pH 酸度工タ)-)�(覧) 直糖(%) 全糖(%) 穆量(L) 酵母 数 ( /ml)
一次謬 宮崎酵母 3.8 13.5 14.8 3.0 7.6
キラ ー宮崎酵母(Kl-5) 3.7 13.7 15.3 2.2 6.9
二次穆 宮崎酵母 4.2 5.4 16.6 O. 11 1.3
キラ ー宮崎酵母(Kt-5) 4.3 5.2 16.5 0.10 1.5 酸度は穆10 mlあたりのO.lN NaOH滴定 数
表5-1 2 穆中における キラー脱落率
キラ ー脱落率 a
測定結果 一次官参 二次穆
3日目 最終 3日目 5日目 最終
測定 3/197 0/146 70/434 58/135 32/63 コロニー数 b
脱落率 (% ) 1.5 。 16.0 43.0 50.7
a YPD培地上に形成したコロニーをレプリカによりYPD-MB培地 に移し、 キラー感受性酵母を噴霧して2 0 0Cで培養しコロニ
ーのキラー活性を判定した。
bキラー脱落率 : キラー活性のないコロニー数/全コロニー数
- 152 -
42.9 6.0X10B 43.8 3.1X10B 149.0 3.5X10B 153.3 2.1X10B
エタノール収量 表5-1 3
使用菌株 収量
201 205 192 キラー宮崎酵母(K 1-5)
キラー宮崎酵母(K 2-67) 鹿児島工試酵母
原料1tあたりの収量(L)
二次穆 ーう
一次醸 →そ一
ト
3.0 2.0
(泊。[)()
安否
尻Jtロミ
E 時
士十i
d
n川v ・v
10 14
間(日)6
発 酵
2
時
的変化※
ll.:キラー宮崎酵母(K1-5)，�:キラー宮崎酵母(K2-67) 0:鹿児島工試酵母
※メチレンブルー染色法により判定した。
図5-5目夢中における生細胞数の経
そ一一次醸
100← i
i→←
二次穆 ータ，_ 75
・ーぷ
色目
標50
時金 It
25
6 nHU
14発 酵 時 間(日)
図5-6 キラー宮崎酵母の純度の変化※
※YPD培地上に検出されるコロニーの酸性ホスファタ ーゼ活性の有無により判定した。
0:キラー宮崎酵母(Kt-5)・:キラー宮崎酵母(Kz-67)
一 154 -
かし 、 K 1及びK 2を保有するキラー宮崎酵母は穆末期にお い ても対照の鹿児島工試酵母よりも生細胞数が多か った (図5 -5 )。 エタノ ー ル収量の増加は こ の穆末期におい て も生細胞数の多い こ とによると推察した。
また 、 キラー宮崎酵母の純度は 、 図5 - 6に示すように 、 一次穆におい てはK 1を持つ酵母もK 2を持つ酵母もほぼ
100 % であ ったが 、 二次穆につい てはK 2を保有する酵母 の純度が下がる傾向がみられた。 こ の こ とから 、 野生酵 母を淘汰するためにはK 1を保有する酵母のほうが有効と 考え られた。 官能評価につい ては 、 親株の宮崎酵母が雑 味のない す っきりした香味を有する焼酎を造る傾向があ るが 、 キラー宮崎酵母も親株同様な性質が認められた。
5 . 4 考 察
焼酎酵母とし て選抜された優良株である宮崎酵母を使 用し てい る工場の焼酎穆より検出される野生酵母は大部 分がキラー感受性酵母であり 、 野生キラー酵母の存在は 稀であ った。 本章では 、 こ のような特性と状況を利用し 、 キラー プラ ス ミドの宮崎酵母への導入を行い 、 野生醇母 の増殖を抑制する機能を有する焼酎酵母のキラー宮崎酵 母の造成を行 った次第を論述した。 キラー形質とし てK J 及びK 2を選んだが 、 K 1 のキラートキシ ン はK 2のキラート キシ ン に比較し て耐熱性はない がキラー活性は強く
方K 2トキ シ ン は3 0 OCに お い ても失活しにくい 。 焼酎穆で は穆温度が3 0 OCを超えるこ ともあるので 、 K 7のキラー プ ラ ス ミドを保有するキラー酵母の方が有利と推測された が 、 K 1のキラー プラ ス ミドを保有する酵母の方が野生醇 母抑制力や増殖力等に優れ てい た 。
造成したキラー宮崎酵母にキラ一発現に必須のM - d s R N A及びL 、 Hを含むウイル ス様粒子の主要な外皮蛋白を
コ ー ドし てい るL-dsRNAが融合株に存在するこ とを確認 できた 。 キラ一発現にはこ の二重鎖RN Aだけでなく多く の染色体遺伝子が必要であり 、 少なくとも3 0個のM A K遺 伝子がM - d s R N Aの複製に関与し てい ると考えられ てい る 。
旦企1 変異株ではキラー感受性株になると報告され てい る 。
大内1 4 4 )等は清酒酵母協会7号をC y t 0 d u c L i 0 n法に よりキ
ラー化した際 、 こ の酵母がM A K遺伝子に関し ては野仕 即J と判断し てい る 。 宮崎酵母のM A K遺伝子に関し ては不明 であるが 、 キラー プラ ス ミドを導入したとこ ろ キ ラー 活性を保有しか っキラー感受性にならなか った こ となど
から 、 野生型と推考した 。 清酒酵母協会7号同様M A K遺伝 子に関し ては 、 やはり野生型と考えられ てい る 。
焼酎酵母とキラー化焼酎酵母を使用し て試験醸造を実 施したとこ ろ 、 キラー化焼酎酵母では エタ ノ ール収量が 増加する傾向がみられた 。 エタ ノ ール収量が増えるのは
一 156 -
謬末期におい ても生細胞数の多い こ と が原因のー っと考 え られる 。 焼酎におい ても 、 清酒醸造と同様に百夢中のエ タ ノー ル濃度が上昇するに つれ死細胞数が増加すると推
測された 。 原らI 52>は協会7号酵母からエタ ノー ル耐性 変異株を分隊し その変異株がキラートキシ ンに対し て も抵抗性を示すこ とから 、 細胞壁になん らかの相違があ ると推論し てい る 。 穆末期におい てもキラー化した宮崎 酵母に生細胞数が多か っ たこ とは 、 Cytoductionの際細 胞壁を酵素で溶解し融合再生させるとい う手段を用い て おり 、 L-ーヲ・降 の時に細胞壁に変化が起 こ りエタ ノー ル耐性が 増大したと推測も可能である 。
5 . 5 小 括
キラー プラス ミドの宮崎酵母への導入を行い 、 焼酎謬 中の野生酵母の増殖を抑制する機能を有するキラー宮崎 酵母を造成した 。 キラー形質とし てはK 1及びK 2を選ぴ
遺伝 マー カとし ては宮崎酵母が高リン酸培地におい て酸 性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有しない とい う性質を利用した 。 造成に当た っ ては 、 宮崎酵母の雑種化を避けるために核 融合欠損キラー株を使用し 、 Cy t 0 d u c t i 0 n法に よるキラ
プラス ミドの導入を行い 、 酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性が なくキラー活性を保持する コ ロ ニ ーを分離した 。 融合処
理及び再生後キラー親株を添加し て培養するこ とに より
キラー形質を有する融合株を濃縮し 、 分隊効率を上げる こ とができた 。 一方 、 宮崎酵母の胞子嚢胞子とキ ラー親 株との接合によるC e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法では良好なキ ラー宮崎酵母は得られなか った 。
得られた融合株は酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性のある単胞 子と活性のない 単胞子に分かれ 、 宮崎酵母とキラー親株 が核融合してい る こ とが分か った 。 こ れ らのうち酸性ホ
ス フ ア ター ゼ活性の認め られない 融合株のD N A含量は親 株とほぼ同量であり 、 4分子解析の結果K 1 L L + : K 1 L L - =
4 : 0とな った 。 単胞子培養株は全て 酸性ホ ス フ ア ター ゼ 活性を有せずキラー活性を有した 。 また アガ ロ ー ス ・ ゲ
ル電気泳動の結果か ら 、 キラープラ ス ミド( d s - R N A )を保 有して い る こ とが確認された 。 造成したキラー焼酎酵母 を使用して発酵試験を行 ったと こ ろ 、 発酵経過及び香気 成分等は親株とほぼ同様の性質を示した 。
中間工業試験規模及び工業規模の焼酎試醸でも造成酵 母は発酵経過も良く 、 特に穆末期におい ても酵母生細胞 数も多く 、 エタ ノ ー ル収量も多か った 。 またK Iキラープ ラ ス ミドを有する焼酎酵母のほうが百夢中の酵母純度も高 く 、 K 2キラープラ ス ミドを有する酵母より野生酵母の淘
汰には有効であ った 。
- 158 -
終 主早
酒類の中では ロ ー カルなイ メ ー ジが強く 、 地場で消費 される こ とが多か った本格焼酎は 、 昭和5 0年頃に広ま つ
った焼酎ブー ムによ っ て全国的に消費されるようなり 生産量も大幅に増加した 。 こ のブー ムにも昭和6 1年頃よ り陰りが見えはじめ 、 しかも平成2年度の酒税法の改正 による焼酎の酒税率の引上げは 、 本格焼酎にと っ て ウイ
スキーや清酒との競合を余儀なくされ 、 品質の向上及び 製造工程の合理化に つい て 一層の努力が求められ てい る 。 本論文では 、 こ のような状況を鑑み 、 本格焼酎製造技術 及ぴ品質の向上を図る こ とを目的とし て 、 用水や蒸留法 の検討 、 焼酎穆における培養酵母と野生酵母のやj別法及
び野生酵母の挙動の確立さらに焼酎酵母の育種などに つ い て追究した次第を記述した 。
第1章では 、 宮崎県内の焼酎工場におい て使用され て いる用水の水質分析を行い水質を把握した 。 さらに得ら れた調査結果に基ずい て県内を 4 つの地区に分け 、 それ ぞれの地区における水質及び水量に つい て考察した 。 県 北部は湧水の利用が多く 、 溶解成分が比較的少ない軟水 で水質は良好であるが 、 水量は十分とは言えず 、 今後水 量確保に留意しなければならない 。 県東部は沖積平野に 焼酎工場が点在し 、 深度30m 以下の浅井戸を多く利用し
ている 。 水量は豊富であるが 、 水質的にはN0 3 -N等の多 い井水もあり 、 環境の汚染からくる水質悪化が懸念され る 。 県南西部では 、 深度1 0 0 m 前後の深井戸も多く水 も豊富であるが 、 水質的にはシ ラスと火山性の地質の影 響下にあり 、 S i 0 2が多いという特徴がある 。 浅井戸に つ い ては 、 県東部と同様N0 3 - N が多く割水等の使用には
十分注意が必要である 。 深井戸の中に鉄分の多い井水も あり 、 S i 0 2の共存下での効果的 な除鉄法は今後の課題で ある 。 県南部では 、 海岸近くの工場におい て 一部塩水化 し ている井水もあ ったが 、 河川の伏流水を利用し ている 用水は概し て良好.な水質であ った 。
第2章では本格焼酎の品質に大きな影響を及ぼす蒸留 工程に つい て検討した 。 減圧下で蒸留を行う減圧蒸留法 は 、 常圧で蒸留を行う従来の蒸留法と異なり 、 低い 混度 で蒸留が進行するために フ ル フ ラールなどの蒸留時の二 次生成物が少なく 、 蒸留終了時におい てもガス臭がほと んどない留液が得られた 。 高級脂肪酸エ ステルの留出 も従来の常圧蒸留法よりかなり少なくな った 。 こ の製法 による品質の官能評価は穀類製焼酎に つい ては淡麗な酒 質になり評価が高く 、 一方 、 甘藷製焼酎では逆に評価が
低か った 。 還流機能を有する蒸留機は蒸留歩合を上げる こ とができ 、 βー フ ェ ネチル ア ル コ ールや有機酸など後
- 160 -
留部に多く留出する成分の留出が少なくな った 。 高級脂 肪酸エ ス テ ルの留出 パター ン も 、 後留部に留出量が多く なるなど従来の常圧蒸留機と異なる留出経過となるこ と が明らかにな った 。 官能評価に つい ては還流部を終始使 用し て蒸留した場合には評価が低くなる傾向があり 、 穀
類焼酎では後留部のみ還流機を使用した場合の評価が高 い こ とが分か った 。 次に 、 蒸留 により分離除去できない 甘藷焼酎の苦味物質を活性炭処理による除去を試み 、 黒 斑病甘藷由来の苦味物質イポメ ア マ ロ ンは活性炭添加量
o . 03% 、 29時間処理により94%除去でき 、 官能評価でもほ
とんど苦味を感じない こ とが分か った 。
第3章では焼酎穆中の野生酵母に つい て 検討した 。 焼
酎製造では野生酵母と添加培養酵母の判別法が見い だ さ
れ ておらず 、 謬に於ける酵母の挙動は把握できなか った
が 、 宮崎酵母は高リン酸培地におい て酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有しない こ とを見い だし 、 こ の性質を利用する
こ とで 野生酵母の検出が可能にな った 。 さらに 、 α ー メ
チルグル コ シ ドを糖源とするT T C染色法を併用するこ と によ っ て 、 野生酵母との識別がより明確になるこ とを示
した 。 次い で 、 こ の判別法を採用するこ とにより 、 " 差 しもと " により酒母を育成する工場におい ては 、 " 差し
もと " を繰り返すうちに添加された培養酵母が次第に淘
汰され野生酵母に置き換る こ とを明らかにした 。 また
本判別により 、 焼酎自夢中の野生酵母の挙動が明白になり 微生物管理が容易になる こ とを示した 。 さらに 、 本方法 を用い て焼酎穆より分離した野生酵母1 9株に つい て諸性 状を検し 、 い ずれもs. c e r e v i s i a eに属すると同定した 。
それらの生活環は大部分が H 0型ホモタリズム株であ った が 、 そのうち2株は胞子嚢胞子の単胞子培養株にa型接合 能を有する単相株が存在し 、 H q型ホモタリズム株と推測 できた 。
焼酎修中からのキラー酵母の検出に つい ては 、 清酒穆 か ら多くの検出事例があるにもかかわらず報告が なか っ た 。 焼酎穆中の野生キラー酵母の検索を行 ったと こ ろ ほとんどがキラー感受性酵母であ ったが 、 一工場よりキ ラー酵母を分離した 。 分離したキラー酵母B - 8 6株は
s. c e r e v i s i a eに属しH 0型ホモタリズム株であ った 。 B -
8 6株の生産するキラートキシ ンは 、 至適p Hが4 . 5前後で 3 0 OCで はキラー活性がほとんどなか ったが 、 グリセリン
添加により3 0 OCに おい ても活性が保持された 。 B - 8 6株は キラー酵母同志の殺し合い パターンからK 1タイプのキラ ー酵母と推考され 、 4分子分析の結果K 1 L L + : K 1 L L - = 4 : 0 に分隊しキラートキシ ン生成の遺伝子本体は細胞質に存 在する こ とが明らかにな った 。 アガ ロ ー スゲル電気泳動
- 162 -
により二本のRN Aの バンドが検出された 。 そのH-dsRNAの 分子量はK 1やK 2のH-dsRNAのほぼ中間の約1 . 8 k bであ った 。 B - 8 6株は4 0 OC培養によるキ ュ ア リン グ試験の結果 、 清酒
野生 キラー酵母K L 8 8株と同様100 %キラー性を失 った 。 濃度O.lppmのシ ク ロ ヘキシ ミド処理では 、 K L 8 8株は4 1 % キラー性が脱落したが 、 B - 8 6株は9 %と同処理に抵抗性 があ った 。 培養温度3 1 ocで鹿児島工試酵母と本B - 8 6株と の混合培養を行 ったと こ ろ 、 B - 8 6株がキラートキシ ンを 産生し て鹿児島酵母の増殖を抑え 、 優位に増殖する こと が確証できた 。
第5章ではキラー焼酎酵母の育種を試み 、 その酵母を 使用した実地醸造試験の結果に つい て述べた 。 キラー プ ラ ス ミドの宮崎酵母への導入を行い 、 焼酎百夢中の野生酵 母の増殖を抑制する機能を有するキラー宮崎酵母を造成 した 。 キラー形質とし てK 1及びK 2を選ぴ 、 遺伝子 マー カ
とし ては宮崎酵母が高リン酸培地に おい て酸性ホ ス フ ア ターゼ活性を有しない とい う性質を利用した 。 造成に 当 た っ ては 、 宮崎酵母の雑種化を避け るために核融合欠損 キラー株を使用し 、 C y t 0 d u c t i 0 n法によるキラー プラ ス
ミドの導入を行い 、 酸性ホ ス フ ア ターゼ活性がなくキラ ー活性を保持する コ ロ ニーを分離した 。 融合処理及び再 生後キラー親株を添加し て培養する ことによりキラー形
質を有する融合株を濃縮し 、 分離効率を上げる こ とがで きた 。 一方 、 宮崎酵母の胞子嚢胞子とキラー親株との援 合によるC e 1 1 t 0 S P 0 r e m a t i n g法では良好なキラー宮崎 酵母は得られなか った 。 得られた融合株は酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性のある 単胞子と活性のない単胞子に分かれ
宮崎酵母とキラー親株が核融合し ている こ とが分か った こ れらのうち酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性の認められない融 合株のDNA含量は親株とほぼ同量であり 、 4分子解析の結
果K 1 L L + : K 1 L L一 = 4 : 0とな った 。 また 、 単胞子培養株は全
て酸性ホ ス フ ア ター ゼ活性を有せずキラー活性を有した 。 アガロ ー スゲル電気泳動の結果から 、 キラープラ ス ミド
( d s - R N A )を保有し ている こ とが確認された 。 造成したキ
ラー焼酎酵母を使用し て発酵試験を行 ったと こ ろ 、 発酵 経過及び香気成分等は親株とほぼ同様の性質を示した 。 中間工業試験規模及び工業規模の焼酎試醸でも造成酵母
は発酵経過も良く 、 特に穆末期におい ても酵母生細胞数 も多く 、 エタ ノール収量も多か った 。 またK 1キラープラ
ス ミドを有する焼酎酵母のほうが穆中の酵母純度も高く K 2キラープラ ス ミドを有する酵母より野生酵母の淘汰に は有効であ った 。
- 164 -
謝 辞
本稿をまとめるにあたり 、 懇切なる御指導を賜 った九 州大学 、 緒方靖哉教授をはじめ問 、 江藤守総教授 、 |司 、 林田晋策教授 、 問 、 藤尾雄策教授に対し深甚の謝意を表 します 。
また 、 研究遂行にあたり終始御指導い ただい た国税庁 醸造試験所長 、 西谷尚道博士ならびに多くの御助言をい ただい た宮崎大学 、 三浦道雄教授 、 岡 、 太田一良博士 、 同 、 水光正仁博士に深謝い たします 。
さ らに研究に御援助い ただい た宮崎県食品加工研究開 発セ ン タ一 、 永野和良所長 、 岡 、 中山法親副所長 、 岡 、 柏田雅徳微生物応用科長 、 問 、 日高照利主任研究員 、 同 、 柚木崎千鶴子主任技師 、 演川悟特別研究員(現宮崎県消 防防災課主幹) 、 南九州大学 、 中山貫三教授 、 宮崎県技 術情報セ ン ター 、 日高輝夫研究員 、 山田和史氏 、 都築太 左衛門氏 、 高橋勝南氏 、 金丸一平氏 、 下中野健氏ならび に試料採取や実験に御協力い ただい た宮崎県酒造組合連 合会 、 渡辺慎助会長 、 向 、 永山久春専務ほか同組合傘下 の組合員の皆様に感謝い たします 。
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G e n e t i c s
N • K a w a k a m i ， H . M 0 n d 0 ， H . K a w a k a m i : Y e a s t N e w s - J a p a n ， 9 ， 2 4 ( 1 976 )
A . W a 1 1 i n ， T . E r i k s s 0 n : P h y s i 0 1 . P 1 a n t . ，28 ， 3 3 ( 197 3 )
N • G u n g e ， A • T a m a r u : J a p a n . J . G e n e t . ，53 ， 4 1 ( 1 977 ) USA.，73，
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