喘息モデルモルモットの病理学的検討

喘息モデルモルモットの

  病理学的検討

目 次

第1章 緒論

1

第2章 卵白アルブミン反復吸入曝露によるモルモツト気道

    における病理組織学的及び免疫組織化学的検索

4

緒言

5

材料及び方法

6

結果

9

考察

18 要約 19

第3章 卵白アルブミンの感作及び誘発により作製した

    モルモット喘息病態モデルにおける病理組織学的

    及び免疫組織化学的検索

21 二三 主只 名‘ 22

材料及び方法

23

結果

26

考察

36 要約 37

第4章 総括

    謝辞

    文献

、

第1章

緒 弘日翻

 近年の分子生物学、免疫学、アレルギー学の進歩は、気管支喘息

の病態とその発症機序の解明に大きく寄与している。喘息は1型ア

レルギー反応の代表疾患として、特異的IgE抗体を介した肥満細胞

の脱穎粒現象に始まり、気管支平滑筋収縮を惹起するヒスタミン、

SRS．A（Slow Reac6ng Subs倣ce of anaphyla泊s）などの化学物質、アラキドン酸

カスケードなど、生化学的研究が70年代から80年代前半にかけて

なされてきた。80年代後半から、好酸球願粒蛋白のMBP（M勾or Basic

Pr◎te祖）が気管支上皮を障害することが報告され、好酸球などの炎症

細胞の気道粘膜への浸潤という炎症反応の側面が注目されてきた

12｝。気道におけるアレルギー性炎症反応に関与する炎症細胞には、

肥満細胞や好酸球の他にも好中球、リンパ球、マクロファージ及び

血小板などの血液由来細胞と、気道粘膜上皮細胞、自律神経を含め

た下部気道を形成している細胞がサイトカインなどの伝達物質を介

して相互にネットワークを作り、特別な形の気道炎症の形態をとる

という概念が世界的なレベルで広く認められるようになってきた4・

22｝。

 気管支喘息の疾患としての特徴は、発作性呼吸困難、喘鳴を主徴

とする気道収縮反応、ヒスタミン、アセチルコリンなどの非特異的

気管支平滑筋収縮物質の吸入に対する反応性冗進状態川、肥満細胞、

好酸球、リンパ球などの気道粘膜への細胞浸潤などである38｝。アレ

ルギー性瑞息患者がアレルゲン曝露によって惹起される気道反応に

は、抗原吸入直後より始まり、10∼30分をピークとする典型的な

気道収縮反応として捉えられる即時型喘息・反応（immediate as㎞a6C

response：IAR）、抗原吸入後3∼12時間後に徐々に出現する気道閉塞

を特徴とした遅発型喘息反応（1ate ast㎞a也response：LAR）、及び吸入後24

時間以後の、僅かな刺激や誘因で発作を起こしうる気道反応性冗進

状態である後遅発型喘息反応（post」ate asthma痘c response：P−LAR）の3種類

に大別できる。

 一方、気管支喘息の病因、病態の解明とその治療法の確立は、優

れた動物モデルの開発によって可能となる。上述したように、喘息

一2．

の気道病理像から好酸球性気管支炎なる概念も提唱されているが、

その病態生理の機序の解明が進んだのは動物モデルの利用によると

ころが大きい。このように、喘息モデルに関する研究は数多くなさ

れてきたが、その作製は基本的には比較的少量の抗原を単回もしく

は反復曝露して能動的もしくは受動的感作を行い、抗原特異的IgE

を産生さた後、同一抗原で誘発を行ってアレルギー反応を惹起させ

るものである7・3｝。しかしながら、ヒトの慢性気管支喘息という点

で考えると、絶えず経気道的に感作された状態、すなわち、感作処

置のみを施した動物において、経時的に病理組織学的検討を行った

報告は少なく36）、特にアポトーシス及び細胞増殖活性を示す細胞の

動態に注目した報告はない。また、IARからLARに推移する過程で、

両病態に対する経時的な病理組織学的検討を実施した報告も少な

い。

 そこで、著者は実験動物の中でもアセチルコリンやヒスタミンに

対する感受性が強く、アナフィラキシー反応の主な反応の場が呼吸

器系であるモルモット2°−5｝を用い、抗原として卵白アルブミンを反

復吸入曝露させることにより感作動物を作製し、曝露回数を重ねる

ことによって気道に対しどのような変化が認められるかを病理組織

学的及び免疫組織化学的に検討した川。更に、同様の操作で作製し

た感作成立モルモットに対し、同一抗原によるブースター処置及び

室警を行って畦息病態モデルを作製し、気道における変化を病理担

織学的及び免疫組織化学的に経時的な検討を加えた33）。

一3一

第2章

      卵白アルブミン反復吸入曝露による

モルモット気道における病理組織学的及び免疫組織化学的検索

       緒 言

 アレルギー患者がアレルゲン曝露によって惹起される気道反応に

は、活性化した粘膜内の肥満細胞から遊離されるヒスタミンや各種

の化学遊走物質によって誘発される即時性の気道収縮瑚と、持続的

な気道破壊を特徴とする遅発型喘息反応があり、後者は抗原誘発後

3ないし4時間で認められ、7ないし8時間でピークに達し、その

後数日間持続する2η。さらに、遅発型喘息反応はその重症度に比例

して、非特異的な種々の刺激に対して気管支の気道反応性充進を引

き起こすとされており5｝、気管支喘息の最も重要な病態であるとと

もに、臨床上の重症度とも関連している。

 近年、気管支喘息における種々の免疫・アレルギー性反応の炎症

としての側面に注目が集まり、気管支喘息はアレルギー性炎症反応

として把握されつつある。気道系におけるアレルギー性炎症反応に

関与する炎症細胞には、好酸球、好中球、肥満細胞、リンパ球、マ

クロファージなどがあり、これらの細胞の機能に種々のサイトカイ

ンが影響を与えていると考えられる。事実、気管支喘息の最も重要

な病態である気道過敏性は、実験的にインターロイキンー2（以下

IL−2と略）の投与により誘発することが注目されており29’川、サイト

カインが各種遊走細胞の誘導や、更なるサイトカイン産生刺激作用

を介して気管支喘息病態に重要なメディエーターとして働いている

可能性が示唆されている4〕。

 実験動物における喘息病態モデルに関しては、これまでに多くの

作製がなされ、研究が行われてきた2θ一5｝。しかしながら、喘息病態

作製には、動物に能動的な感作を成立させた後、一定期間をおいて

再度抗原曝露による誘発を行う方法が主流であり、喘息病態モデル

作製過程で、抗原の反復曝露による感作処理のみを実施した動物、

すなわちヒトのアレルギー性喘息に置き換えた場合、「絶えず抗原

に曝露され、その後の抗原吸入誘発発作が生じる前の状態」に相当

する動物に対し、経時的な病理組織学的検討を行った報告は少ない。

また、喘息モデル作製過程で、アポトーシスや細胞増殖活性に注目

．5一

した報告は未だ見られていない。このような状況の下、本試験にお

いて、霧化した卵白アルブミンをモルモットに吸入曝露し、その曝

露回数の相違による気道の変化を病理組織学的及び免疫組織化学的

に検索した3η。

      材料及び方法

1．実験動物

 本実験には4週齢の雄性Hartley系モルモット（日本医科学動物資

材研究所より購入、使用時体重約250g）計23匹を用いた。実験を

通じてこれらの動物は温度23±2℃、湿度50±10％、照明時間7：00

∼19：00の環境下で飼育し、水（水道水｝及び餌（CG−7；日本クレア）を

それぞれ自由に摂取させた。

2．実験方法

 吸入感作は有馬ら勾の方法に準じて行った。すなわち、モルモッ

トをアクリル製exposure chamber（300【w｝×400｛D）×300｛H｝㎜）に入れ、卵 白アルブミン（Grade正，Sigma，＆Lou｛s， MO，1％wヴvol in O．9％so（嚢um chloride）

を超音波ネブライザー（15㎡／mi砥NE−u10B，オムロン株式会社、東京）

を用いて、無麻酔、自発呼吸の条件下で、1日1回10分間、吸入曝

露を行った（Fig 1）。この操作を0回（無処置対照）、2，5，8，及び10

回連続して行い、感作処理を行った。なお、モルモットの一般状態

から喘鳴呼吸やチァノーゼが認められた時点で感作成立と判断し

た。

3．病理組織学的検索

 吸入曝露の0回（無処置対照）、2，5，8，及び10回のそれぞれの時

点（n＝4∼5）で、動物をエーテル麻酔下で放血致死せしめ、気管及

び肺を採取した。気管の断端から10％緩衝ホルマリンを注入し、採

取した気管及び肺の固定を行った。モルモットの気管及び肺の一定

部位（右肺後葉、主気管支直下）を切り出し、パラフィン包埋、薄

切後、ヘマトキシリン・エオジン、ギムザ、アルシアン・ブルーPAS、

トルイジンブルーの各染色を施し、光学顕微鏡下で観察を行った。

一6一

﹀﹂内 ﹂富一〇↑但コ全

→←

   。。9℃

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o コ 号》一・ o ．7 ﹀コ﹂ヨP一 〇一︼ロヨひO［ ●◎× 「一 ｸ  デ  切O＃Φヨ①︷一〇 嘲一一⊂切︷﹁釦︷⋮Oコ O↓    n﹁σq⊂嘲コΦ①〇一頓切σ＜O＞三＃釦，一画＝Oコ゜ O巻。﹁剛≡。三巴書田﹁三c切↓。﹁ωΦ云三Nロニ。⊃ 一

4．アポトーシス細胞の検出

 病理組織学的検査で用いたものと同じホルマリン固定、パラフィ

ン包埋切片を使用した。

 アポトーシス細胞の検出には、Apop−TagTMPIus−Peroxidase m sim Apoptosis Detecdon kit（Oncor lnc．， Gaithersburg， MO）を用いたTdT−mediated dUTP−bio目n nick end

labeling（以下TUNELと略｝法111に従った。

 この方法は、アポトーシス細胞においてヌクレオソーム単位で分

断されたDNA切断部位を、末端基転移酵素（Te㎜inal deoxynucleo6dyl

仕ansferase｝と、ビオチン化したデオキシウリジン（dUTP−bio6n）を用いて

標識し、3’，3−（∬am垣oben亘dme（以下DABと略、DAB Tablets S・1300， DAKO Japan klc．，

京都）で発色し、検出する方法である。なお、対比染色としてメチ

ルグリーン染色を施した。

5．PCNA細胞の検出

 病理組織学的検査で用いたものと同じ切片を使用した。切片は脱

パラフィン後、オートクレープ（SS−320， TOMY SEIKO Co． Ltd，東京）で

熱処理（121℃，15min．）を行い、内因性パーオキシダーゼ除去のため

に、5％珪02，5分間処理を行った。蒸留水及びtris b鵡red saline（以下TBS

と略）でリンスした後、抗proliferaang cell nuclear an6gen｛以下PCNAと略） 抗体（DAKO−EPOS An目一PCNAIHRP；DAKO Japan lnc．，京都｝を60分間インキュ

ベートした。蒸留水及びTBSでリンスした後、 DABで発色し、ヘマ

トキシリンによる対比染色を施した。

6．組織学的評価方法

 気管及び肺について、光学顕微鏡による検索を実施した。肺につ

いては便宜上3種類の大きさの異なる気管支にっいて検討を加え

た。すなわち、全周に気管支軟骨が認められる部位をBronchusとし

て1箇所、気管支軟骨が散在する部位をSmall bronc垣oleとして2箇所、

軟骨を認めず、平滑筋のみが存在する部位をTem血al bronchioleとして3

箇所、それぞれ任意に選択し、鏡検を行った。好酸球などの炎症細

胞浸潤や病変の程度については次の5段階に分類し、以下に示す評

点を賦して評価した。一：ほとんど認められない（score：Ol、±：ご

一8一

く僅かに浸潤又は存在する（score：1｝、＋：軽度に浸潤又は存在する

（score：2）、甘：中等度に浸潤又は存在する（score：

3）、杵＋：重度に浸潤又は存在する（score：4｝。

 なお、病変の分布が一様でないような場合は、±∼＋のように中

間として表し、評点も1．5とした。アポトーシス細胞及びPCNA細胞

については、切片上の全視野について高倍率（×400｝下で観察し、

その出現数をカウントした。

7．統計学的分析

 全ての計量値は平均±標準偏差で表し、t検定（不等分散の場合

はCochran−Cox法）を行った。有意水準は両側5％以下とした。

       結 果

1．病理組織学的検索結果

 Table 1に病理組織学的検索結果を示した。2回目曝露時より気管

支の収縮を認め、リンパ球の気管あるいは気管支粘膜下への軽度な

浸潤が認められるようになった。これらの所見はその後も散発的に

認められたが、10回目の曝露（感作成立時）には全例にやや強い

気管支収縮と気管支もしくは血管周囲の水腫（Fig．2）、並びに肺気腫

が認められた。また、出血や好中球浸潤、泡沫細胞の集籏を伴うも

のも見られた。

 好酸球の浸潤度をFig．3に示した。曝露o回（con仕ol）にも少数で↑ま

あるが好酸球の存在が認められたが、10回目の感作成立時（Fig．4｝に

はやや浸潤が強くなる傾向が認められた。

2．アポトーシス細胞の動態

 切片あたりのアポトーシス細胞数の推移をTable 2及びFig．5に示

した。曝露回数を重ねるに従ってアポトーシス細胞が増加する傾向

が認められ、曝露0回の対照群に比し、曝露8回目及び10回目では

有意（P〈0．05）な増加を示した。なお、アポトーシス細胞は気管や気

管支の上皮細胞には少数しか認められず、大多数が末梢の肺胞上皮

に認められた｛Fig．6）。 ．9．

Table

1

Histopathological

findings

in

guinea

pigs

sensitized

with

OA

inhalation

Times

of

OA

sensitization

。

2

5

8

10

No.

of

guinea

pigs

ex

釧

ined

4

4

5

5

5

Grade

一土+

tt

一士+

tt

一+ + 一士+

tt

冊

Pulmonary

bronchoconstriction

'..

4

a )

1

0

2

1

400

1

221

00131

Lymphocyte

infiltration

in

tracheal

submucosa

4

2

0

2

0

3

2

0

0

320

03200

Lymphocyte

infiltration

in

bronchial

submucosa

4

301

0

311

0

410

32000

o F 開閉 4

Neutrophil

infiltration

in

bronchial

submucosa

4

4

0

0

0

5

0

0

0

500

21200

Peribronchial

and

perivascular

edema

4

4

0

0

0

5

0

0

0

500

00500

Foam

cell

(macrophage)

aggregation

4

3

1

0

0

5

0

0

0

4

1

0

2

3

0

0

0

Emphysema

4

4

0

0

0

5

0

0

0

500

02120

Alveolar

hemorrhage

4

4

0

0

0

5

0

0

0

5

0

0

21110

OA

Ovalbumin.

a)

No.

of

guinea

pigs.

No

pathological

changes

，

士

Very

slight

changes

，

+

Slight

changes

，

件 出

oderate

changes

，

j~

Severe

changes.

Fig． 2．  Bronchoconstriction， lymphocyte infiltration and

       Peribronchial edema after inhalation for 10 times．

      Hematoxylin ＆ eosin stain、 X33．

．11一

Fig． （score） 2 1．5 1 0．5 0

圏T・achea図

闘B・・nchus田

Small bronchiole Terminal bronchiole       0    2    5     8    10        Times of sensitization

3．  The degrees of eosinophil infiltration in guinea

   pigs sensitized with OA inhalation．

12一

1］1．1 Fig．4．

_{EosinoPhil infiltration after}

10 times． Giemsa stain． X66．

inhalation for

一13一

甦

弓ρ一︶一Φ N°  培￠ヨぴΦ弓 O市 卯UO◎庁O庁］O OΦ一一ω ③口合 ㊥OZ︾lOOoo一け一くΦ    σq已HOΦP U］oqω ωΦ類ロ﹂●﹂NΦ牛 培一け庁 O︾ 一口げρ一ρ庁一〇口 OΦ声一ω 一口 声巨 庁声ooψo自Φ O市 O＞ ロ一ヨΦロo︹     ロ     や      ザ ロΦ﹃Pω戸汁声N口け↑○目一 Z已ヨぴΦ吟 O吟 oq⊂一口ΦP   ◎一〇qc◎ Φ×口自﹄口Φ口    累已ヨぴΦ内 O殉 但弓OO庁O庁O﹄O OΦ一﹂ロ     言尋Φ弓o殉 勺O之︾lbO◎o一古﹄＜Φ 8ご゜。 さ。。σ・NO σ1くハOT÷命 ↓O°O ドωSO 冨O°O Nぱ◆O 疇Φ゜◎。 1十汗1−←｜一←1十 巴゜c。 ﹂蓉﹄ 一8緬 く°。°﹃鯵 富◎。°O糞   S9   ⇔°品 ﹂㌍ΦO ﹂⑩゜ΦO 声ぱ゜き 1十1十1十1十1十 ω◆ぺO 声﹄Φ ◎。°O◎。 ﹂ド⑩⑩ 日゜OO‡ ．14． O＞ ⋮ O＜P一●C己一目゜  ＜ρ一⊂Φ◎o P叶Φ Φ×b弓Φ◎ocoΦ餌 鱒畳 ⋮ ロ一唱一叶凶OPOけ一尾 烏﹂殉市Φ弓Φ⇔や 市弓Oヨ 幹プΦ ﹀◎o庁Φ弓﹄co民 ﹂口△一〇③古Φロ ∀︿O°O﹂° ρm ヨΦPO 峠 CO］︶・ ＜ρ一⊂Φ ○吟 O 汁一ヨΦ 口Φ昌ω戸け↑N口庁﹂∩VO・

Φ⊃⑩ω三＼⑩二Φ〇三ぢPαo昔千o．o之 800 600 400 200 0 0 _{2     5}

Times of sensitization

8 10 臼9．5．

 Number of aPoptotic cells in guinea Pigs

sensitized with OA 

inha｛ation．

＊＊：Significantly different from the valUe of

O time sensitization 

（P〈0．01）． 一15・・

Fig.6. Many

TUNEL

positive

，

apoptotic cells

i

n

alveolar

regions after inhalation f

o

r

1

0

t

i

m

e

s

.

TUNEL

s

t

a

i

n

.

X132

.

-Φ⊃ωω＝＼の＝8Φ≧三切oα＜之Oユも．o之 200 150 100 50 0 ＊＊ 0

_{2     5     8   10}

No． of times of sensitization Fig．7．

 Number of PCNA positive cells in gulnea Plgs

sensitized with OA inhalation．

＊＊：Significantly different from the value of

O time sensitization 

（P〈0．01）． 一17一

3

.

PCNA

陽 性 細 胞 の 動 態 窃 片 あ た り の

PCNA

陽 性 細 胞 数 の 変 動 を

T

a

b

l

e2

及 び

F

i

g

.

7

に 示 し た 。 曝 露

O@)

か ら

8

回 目 ま で は ほ と ん ど 差 を 認 め な か っ た が 、

1

0

回 目 ( 感 作 成 立 時 ) に は 有 意

(

p

く

0

.

0

1

) な 著 し い 増 加 が 認 め ら れ た 。 な お 、

PCNA

陽 性 綿 胞 の 分 布 は ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 場 合 と 開 様 に 、 末 桔 ' の 肺 胞 上 皮 に 多 く 認 め ら れ た 。 考 察 端 息 モ デ ル の 作 製 に は 種 々 の 方 法 が 知 ら れ て い る が 、 基 本 的 に は 能 動 的 も し く は 受 動 的 に 感 作 し た 動 物 に 対 し 、 同 一 抗 原 に よ る 誘 発 を 行 っ て ア レ ル ギ 一 反 応 を 惹 起 さ せ る も の で あ る 7. 8)。 し か し な が ら 、 抗 原 の 反 復 曝 露 に よ る 感 作 時 に 、 感 作 成 立 に 至 る 過 程 で 、 気 道 に お け る 病 理 学 的 な 検 討 を 符 っ た 報 告 は 少 な く 、 僅 か に 気 管 支 の 基 底 膜 の 肥 庫 、 筋 層 肥 大 な ど が 感 作 成 立 時 に 認 め ら れ た と い う 報 告 が あ る に 過 ぎ な い 36) 。 ま た 、 同 時 に ア ポ ト ー シ ス 及 び 細 胞 増 殖 活 性 を 示 す 細 胞 の 動 態 に 注 目 し た 報 告 は な い 。 そ こ で 、 著 者 は 抗 原 と し て 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 反 復 吸 入 曝 露 さ せ る こ と に よ り 感 作 動 物 を 作 製 し 、 曝 露 回 数 を 重 ね る こ と に よ っ て 気 道 に 対 し ど の よ う な 変 化 が 認 め ら れ る か を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た 。 感 作 成 立 動 物 の 剖 検 及 び 病 理 組 織 学 的 検 査 で 、 肺 に お け る 出 血 並 び に 肺 気 躍 が 認 め ら れ た 。 肺 気 腫 は 気 道 の 閉 塞 に よ り 空 気 が 吸 入 さ れ て も 呼 出 さ れ に く い 状 態 で 生 じ 、 ま た 、 肺 出 血 は 血 管 平 滑 筋 収 縮 及 び 血 管 透 過 性 冗 進 の 結 果 生 じ た こ と が 類 推 さ れ た 。 事 実 、 本 実 験 に お い て も 組 織 学 的 に 著 し い 気 道 収 縮 が 認 め ら れ 、 出 血 と と も に 血 管 及 び 気 管 支 周 囲 の 水 題 も 認 め ら れ た 。 こ れ ら の 病 態 は 、 い わ ゆ る ア ナ フ ィ ラ キ シ ー 状 態 に 相 当 す る 変 化 で あ る と 思 わ れ る 。 し か し な が ら 、 ア ナ フ ィ ラ キ シ ー だ け で は 説 明 で き な い 現 象 と し て 、 本 実 験 に お い て

2

由 自 の 処 置 時 よ り 軽 度 で は あ る が リ ン パ 球 の 浸 潤 及 び 貯 謹 球 の 増 加 傾 向 と と も に 、 ア ポ ト ー シ ス を 恭 唆 す る

TUNEL

陽 性 細 龍 の 経 時 的 か つ 有 意 な 増 加 傾 向 、 な ら び に 吸 入 曝 露

1

0

@ ) 自 の 感 作 成 蝿 1

8-立 時 に PCNA陽 性 細 胞 数 の 増 加 が 認 め ら れ た 。 好 酸 球 や リ ン パ 球 な ど の 炎 症 綿 胞 の 浸 潤 は 気 管 や 気 管 支 粘 膜 下 が 主 体 で あ っ た の に 対 し、 TUNEL及 び PCNA陽 性 縮 胞 は 、 末 梢 の 肺 胞 上 皮 細 胞 に 椙 当 す る 部 位 に 多 く 認 め ら れ た 。 何 故 TUNEL及 び PCNA陽 性 綿 胞 が 、 標 的 絹 胞 で あ る と 思 わ れ る 気 管 、 ま た は 気 管 支 上 皮 に 出 現 せ ず 、 肺 胞 上 皮 に 認 め ら れ る の か は 不 明 で あ る が 、 今 後 、 よ り 詳 細 な 究 明 が 必 要 と な る も の と 思 わ れ た 。 本 実 験 に お い て 、 ア ポ ト ー シ ス 細 胞 及 び PCNA陽 性 細 胞 の 増 加 の メ 力 ニ ズ ム に つ い て は 明 ら か に さ れ な か っ た 。 し か し な が ら 、 癌 治 療 の た め に IL-2を 投 与 さ れ た 患 者 に お い て 、 い わ ゆ る vasucular leak S戸drome 以 下 VLSと 略 ) が 生 じ る こ と が 知 ら れ て い る 。 VLSの 病 態 と し て は 、 肺 水 腫 を 伴 っ た 血 管 透 過 性 の 完 進 、 脂 7 1 < の 彦 出 及 び 末 梢 の 好 酸 球 増 加 な ど が 認 め ら れ る 23，37)。同様の VLSは 実 験 的 に 大 量 の IL-2 を 投 与 し た と き に も 認 め ら れ る し 10， 28)0 Zhangらねlは ヒ ト 組 み 替 え IL-2 を 投 与 し た ラ ッ ト に お い て 、 血 管 内 皮 へ の 障 害 、 間 質 の 浮 腫 、 気 管 支 及 び 肺 胞 上 皮 の 損 傷 な ど を 観 察 し て お り 、 特 に 、 肺 飽 上 皮 の 損 傷 は 主 に type-II細 胞 に 見 ら れ 、 そ の 細 胞 葉 の 特 徴 な ど か ら ア ポ ト ー シ ス に よ る も の と 類 推 し て い る 。 以 上 の 事 実 か ら 、 本 実 験 で 認 め ら れ た 病 変 は 、 VLSに き わ め て 類 似 し た 病 態 で あ る と い え 、 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 反 復 吸 入 曝 露 に よ る 感 作 成 立 過 程 で 、 経 時 的 な ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 増 加 に IL-2な ど の サ イ ト カ イ ン が 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 された。 要 約 こ れ ま で に 、 モ ル モ ッ ト を 用 い た 端 患 モ デ ル 作 製 過 程 で 、 抗 原 の 反 復 曝 露 に よ る 能 動 感 作 の み を 施 し た 動 物 に お い て 、 経 時 的 な 組 織 学 的 検 索 を 実 施 し た 報 告 は 少 な く 、 特 に 、 ア ポ ト ー シ ス 及 び 細 胞 増 殖 活 性 に 注 巨 し た 報 告 は な い 。 本 実 験 で は 、 霧 化 し た 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 経 気 道 的 に モ ル モ ッ ト に 吸 入 さ せ 、 そ の 回 数 の 相 違 に よ る 気 道 の 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 -19

-疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し 、 以 下 の 結 論 を 得 た 。 1 ) 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 10回 曝 露 に よ る 感 作 成 立 時 に 、 肺 の 出 血 、 気 麗 及 び 気 管 支 あ る い

i

ま 血 管 局 囲 性 の 水 腫 と い っ た ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 様 の 変 化 が 認 め ら れ た 。 ま た 、 細 胞 増 殖 活 性 を 示 唆 す る PCNA陽 性 細 胞 数 の 増 加 が 晃 ら れ た 。 2) ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 様 の 変 化 以 外 に 気 管 及 び 気 管 支 粘 膜 に お け る り ン パ 球 な ら び に ま 子 酸 球 の 増 加 傾 舟 が 認 め ら れ た 。 3) 肺 胞 上 皮 細 胞 に お い て 、 曝 露 回 数 を 重 ね る こ と に よ り 、 ア ポ ト ー シ ス 細 胞 数 の 増 加 傾 向 が 認 め ら れ た 。 4) ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 発 生 原 鴎 に つ い て は 明 ら か に さ れ な か っ た が 、 そ の 特 徴 な ど か ら 、 実 験 動 物 や 癌 患 者 で IL-2投 与 に よ っ て 生 じ る と さ れ て い る VLSに 類 似 し た 変 化 で あ る こ と が 示 唆 さ れた。 20

-第

3

章

卵 白 ア ル ブ ミ ン の 感 作 及 び 誘 発 に よ り 作 製 し た モ ル モ ッ ト 端 息 病 態 モ デ ル に お け る

病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 検 索

1-緒 品 一一 回 好 酸 球 は 、 以 前 、 ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 反 応 に よ っ て 遊 離 さ れ た ケ ミ カ ル メ デ ィ エ ー タ ー の い く つ か を 中 和 な い し 不 活 化 す る 酵 素 、 た と え ば Histaminase叫， Aryllsulfatase39I ， Phospholipase D川 な ど を 有 し 、 と ス タ ミ ン 遊 離 を 抑 制 す る Eosinophil-derived inhibitor川 を 放 出 し た り 、 さ ら に 好 酸 球 の 頼 粒 蛋 自 の ひ と つ で あ る Eosinophil peroxydaseが 一 連 の Leuko位ien

B

4

，

U

，

D4を 不 活 化 す る 151な ど 、 ア レ jレ ギ 一 反 応 を 鎮 静 化 す る 方 向 に 働 く と 考 え ら れ て き た 。 し か し な が ら 、 最 近 に な っ て 、 好 接 球 顎 粒 蛋 白 で あ る M

可

orbasic protein久12I ， Eosinophil cationic protein2SI ， Eosinophil崎derivedneurotoxin 及 び Eosinophilperoxydase13I [ こ は 組 織 傷 害 性 が あ る こ と 、 ま た 、 好 酸 球 は 強 力 な 炎 症 性 メ デ ィ エ ー タ ー で あ る いuko住ienU 川や Plateletactivating factor を 産 生 す る 24Iこ と が 明 ら か に な っ た こ と な ど か ら 、 好 酸 球 は ア レ ル ギ 一 反 応 に お け る e飴ctor細 胞 と し て 位 置 づ け ら れ る よ う に な っ て き たい，18I。 ア レ ル ギ ー 性 端 息 患 者 の 気 道 反 応 に は 、 気 道 収 縮 反 応 で あ る 即 時 型 瑞 怠 反 応 (immediate asthruatic response IAR)、 気 道 関 塞 を 特 徴 と し た 遅 発 型 端 息 反 応 (late asthruatic response LAR

1

、 及 び 気 道 反 応 性 冗 進 状 態 で あ る 後 遅 発 型 端 患 反 応 (post-late asthmatic response p-LARlの 3種 類 が 挙 げ ら れ 、 特 に 、 LAR及 び p-LARに お い て 気 道 の 好 重 量 球 浸 潤 が 著 明 で あ る 。 貯 酸 球 浸 潤 は 端 息 死 の 病 理 診 断 の 一 部 で あ り 、 ま た 、 好 酸 球 浸 潤 部 位 で は 気 道 上 皮 の 破 壊 像 も 認 め ら れ て い る 13，判。 こ れ ま で に 多 く の 端 息 動 物 モ デ ル を 用 い た 研 究 が 数 多 く な さ れ て き た 。 中 で も モ ル モ ッ ト は 実 験 動 物 の 中 で ア セ チ ル コ リ ン 、 ヒ ス タ ミ ン に 対 す る 過 敏 性 が 高 い こ と 、 ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 反 応 で は 主 た る 反 応 の 場 は 呼 吸 器 系 で あ り 、 反 応 が 軽 度 の 場 合 に は 呼 吸 器 系 だ け の 症 状 が 観 察 さ れ る こ と か ら 、 ヒ ト の 気 管 支 端 息 モ デ ル と し て 広 く 使 わ れ て き た 20，H， 3S1。 こ れ ら の 端 患 モ デ ル の 病 理 組 織 学 的 研 究 で 、 気 管 支 端 患 と 気 道 内 好 酸 球 浸 潤 と の 関 連 性 、 重 要 性 が 論 議 さ れ て き た が 、 端 息 と ア ポ ト ー シ ス 及 び 細 胞 増 殖 活 性 に 注 目 し た 報 告 は 無 い 。 -22帽

そ こ で 本 試 験 で は 、 第

2

章 で 報 告 し た 操 作 に よ り 感 作 成 立 動 物 を 作 製 し 、 同 一 抗 原 に よ る ブ ー ス タ ー 処 置 及 び 誘 発 を 行 っ て 、 誘 発 後 の 経 時 的 な 靖 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 検 討 を 行 っ た 問 。 材 料 及 び 方 法 1. 実 験 動 物 本 実 験 に は

4

適 齢 の 雄 性 Hartley系 モ ル モ ッ ト ( 自 本 医 科 学 動 物 資 材 研 究 所 よ り 購 入 、 使 用 時 体 重 約 250 g) 計 17匹 を 用 い た 。 実 験 を 通 じ て こ れ ら の 動 物 は 混 度 23土 2

o

c

、 湿 度 50土 10%、 照 明 時 間 7:00 '" 19:00 の 環 境 下 で 飼 育 し 、 水 { 水 道 水 } 及 び 餌 (CG々 ; 日 本 ク レ ア ) を そ れ ぞ れ 自 由 に 摂 取 さ せ た 。 2. 実 験 方 法 吸 入 感 作 、 ブ ー ス タ ー 処 理 及 び 誘 発 は 有 馬 ら 21の 方 法 に 準 じ て 行 っ た 。 モ ル モ ッ ト を ア ク リ ル 製 expos旧e chamber (300(W) X 400 (D) X 300 (H) mm)に 入 れ た 後 、 1%卵 自 ア ル ブ ミ ン (Grade

m

， Sigma， St.Louis， M O， 1 % wt/vol in 0.9% sodium chloride) を 超 音 波 ネ ブ ラ イ ザ ー (1.5 mlImin.， NE-UIOB， オ ム ロ ン 株 式 会 社 、 東 京 ) を 用 い て 、 無 麻 酔 、 自 発 呼 吸 の 条 件 下 で 、 1 自 1回 10分 間 、 吸 入 曝 露 を 行 っ た (Fig. 1)。 こ の 操 作 を 10回 繰 り 返 す こ と に よ り 感 作 処 理 を 行 っ た 。 感 作 の 成 立 は 、 モ ル モ ッ ト の 一 般 状 態 か ら 端 鳴 呼 吸 や チ ア ノ ー ゼ の 出 現 で 確 認 し た 。 感 作 成 立 後 、 1及 び 2遇 自 に 1%卵 白 ア ル ブ ミ ン を 5分 間 吸 入 醸 露 さ せ 、 ブ ー ス タ ー 処 理 を 行 っ た 。 な お 、 こ の 際 、 ヒ ス タ ミ ン に よ り 誘 発 さ れ る 致 死 的 な ア ナ フ ィ ラ キ シ ー シ ョ ッ ク を 避 け る た め に 、 吸 入 開 始 15分 前 に diphe出ydramine (Sigma， St. Louis， MO) 60mglkgを 腹 腔 内 に 投 与 し た 。 2由 自 の ブ ー ス タ ー 処 置 か ら 1週 間 後 に 誘 発 を 行 っ た 。 誘 発 は 2% 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 10分 間 吸 入 醸 露 す る こ と に よ り 行 っ た 。 な お 、 前 述 と 詞 じ 理 自 で 吸 入 曝 露 15分 前 に diphenhy合 加 山e

，

60mglkgを 腹 控 内 に 投 与 し た (Fig.8)。 情 23帽

¶⊥← 0

↓↓ ↓↓↓

        10

↓↓↓↓

．17 ▽

24

､

     （Day）

31∼33

↓∼櫛

●●   ●●   ●●   ，．

←▽←櫛

SensitiZation， 1％ Ovalbumin inhalation， 10㎡n． B。。，ter，1％0，alb、。i。 i、h。1ati。、，5㎡、（Diphenhydra。i。e，60。g／k日， ip，15而， Provocation，2％Ovalbumin inhalation，10㎡n（Diphenhydramine，60㎎／kg， ip， S・1・ificed・t O，1，3，6，24， a・d 48 h・・urs aft・・p・・vO・ati・n， ㌶ 臼98．S・hematlρ・川u・t・a目・n・，Of gxP・柵nt・l d咄・f・・    and prbvocatlon of guln号a θ｜gs by．OA lnhiila目on・ before inhalation）． 15㎡h before inhalation）， sensitization ’ 寸N 1

3. 病 理 組 織 学 的 検 索 動 物 は 誘 発 前 ( 対 照 群 ) 、 誘 発 後 1，3， 6， 24及 び 48時 間 自 に エ ー テ ル 麻 酔 下 で 放 車 致 死 せ し め (n=2'" 3)、 気 管 及 び 蹄 を 採 取 し た 。 気 管 の 断 端 か ら 10%緩 衝 ホ ル マ リ ン を 注 入 し 、 採 取 し た 気 管 及 び 肺 の 固 定 を 行 っ た 。 モ ル モ ッ ト の 気 管 及 び 肺 の 一 定 部 位 ( 右 肺 後 葉 、 主 気 管 支 直 下 ) を 切 り 出 し 、 パ ラ フ ィ ン 包 埋 、 薄 切 後 、 ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン 、 ル ナ 、 ギ ム ザ 、 ア jレ シ ア ン ・ ブ ル ー PAS、 ト ル イ ジ ン ブ ル ー の 各 染 色 を 施 し 、 光 学 顕 微 鏡 下 で 観 察 を 行 っ た 。 4. ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 検 出 病 理 組 織 学 的 検 査 で 用 い た も の と 同 じ ホ ル マ リ ン 毘 定 、 パ ラ フ ィ ン 包 埋 切 片 を 使 用 し た 。

ア ポ ト ー シ ス 縮 胞 の 検 出 に は 、 Apop-Tag™Plus-Peroxidase in situ Apoptosis Detection kit(Oncor Inc.， Gaithersburg， MO)を 用 い た TUNEL法 11)に 従 っ た 。

こ の 方 法 は 、 ア ポ ト ー シ ス 縮 胞 に お い て ヌ ク レ オ ソ ー ム 単 位 で 分 断 さ れ た DNA切 断 部 位 を 、 末 端 基 転 移 酵 素 (Tenninal deoxynucleotidyl 位ansferase)と 、 ピ オ チ ン 化 し た デ オ キ シ ウ リ ジ ン (dUTPゐ10位 け を 用 い て 標 識 し 、 3'，3-diaminobenzidine (DAB Tablets S-300， DAKO JapanInc.， 京 都 ) で 発 色 し 、 検 出 す る 方 法 で あ る 。 な お 、 対 比 染 色 と し て メ チ ル グ リ ー ン 染 色 を 施 し た 。 5. PCNA縮 胞 の 検 出 病 理 組 織 学 的 検 査 で 用 い た も の と 関 じ 切 片 を 使 用 し た 。 切 片 を 脱 パ ラ フ ィ ン 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ (SS-320，TOMY SEIKO Co.Ltd.， 東 京 ) で 熱 処 理 (121oC， 15 min.)を 行 い 、 内 因 性 パ ー オ キ シ ダ ー ゼ 除 去 の た め に、 5%H202， 5分 間 処 理 を 行 っ た 。 蒸 留 水 及 び TBSで リ ン ス し た 後 、 抗 PCNA抗 体 (DAKO司EPOSAnかPCNAlHRP; DAKO Japan Inc.，京都)を 60分 間 イ

ン キ ュ ベ ー 卜 し た 。 蒸 留 水 及 び TBSで リ ン ス し た 後 、 DABで 発 色 し 、 ヘ マ ト キ シ リ ン に よ る 対 比 染 色 を 施 し た 。 6. 組 織 学 的 評 価 方 法 気 管 及 び 肺 に つ い て 、 光 学 顕 微 鏡 に よ る 検 索 を 実 施 し た 。 肺 に つ い て は 便 宜 上 3種 類 の 大 き さ の 異 な る 気 管 支 に つ い て 検 討 を 加 え ー2

5-た 。 す な わ ち 、 全 局 に 気 管 支 軟 骨 が 認 め ら れ る Bronchusを l箇所、 気 管 支 軟 骨 が 散 在 す る Small bronchioleを 2箇 所 、 軟 骨 を 認 め ず 、 平 滑 筋 の み が 存 在 す る Terminalbronchioleを 3箇 所 、 そ れ ぞ れ 任 意 に 選 択 し 、 鏡 検 を 行 っ た 。 好 酸 球 な ど の 炎 症 細 胞 浸 潤 や 病 変 の 程 度 に つ い て は 次 の 5段 階 に 分 類 し 、 以 下 に 示 す 評 点 を 賦 し て 評 価 し た 。 一 : ほ と ん ど 認 め ら れ な い (score: 0)、 土 : ご く 僅 か に 浸 潤 文 は 存 在 す る (score 1 ) 、 + 軽 度 に 浸 潤 又 は 存 在 す る (score 2)、 + + - 中 等 度 に 浸 潤 又 は 存 在 す る (score: 3)、 件 + 重 度 に 浸 潤 文 は 存 在 す る (score: 4)。 な お 、 病 変 の 分 布 が 一 様 で な い よ う な 場 合 は 、 土 ' " " + の よ う に 中 間 と し て 表 し 、 評 点 も 1 .5と し た 。 ア ポ ト ー シ ス 締 胞 及 び PCNA細 胞 に つ い て は 、 切 片 上 の 全 視 野 に つ い て 高 倍 率

(x

400)下 で 観 察 し 、 そ の 出 現 数 を カ ウ ン ト し た 。

7

.

統 計 学 的 分 析 全 て の 計 量 値 は 平 均 土 標 準 偏 差 で 表 し 、 t検 定 ( 不 等 分 散 の 場 合 は CochrarトCox法 ) を 行 っ た 。 有 意 水 準 は 両 側 5%以 下 と し た 。 結 果 1. 病 理 組 織 学 的 検 索 結 果 卵 白 ア ル ブ ミ ン に よ る 誘 発 後 の 経 時 的 な 組 織 学 的 変 化 を Table 3に 示 し た 。 誘 発 1時 間 後 よ り 、 肺 に お け る 軽 度 か ら 中 等 度 な 血 管 周 囲 性 の 浮 腫 が 認 め ら れ 、 誘 発 6時 間 後 に 最 も 強 い 変 化 が 認 め ら れ た 。 ま た 、 気 管 支 収 縮 は 、 誘 発 l及 び 6時 間 後 に そ れ ぞ れ l例 ず つ 認 め ら れ た 。 そ の 他 、 肺 の 局 所 性 の 出 血 、 好 中 球 及 び 泡 沫 細 胞 の 浸 潤 も し く は 集 践 が 認 め ら れ た が 、 い ず れ も 軽 度 あ る い は 少 数 例 に 過 ぎ な い も の で あ っ た 。 一 方 、 好 酸 球 の 浸 潤 (Fig. 9)は 時 間 の 経 過 と と も に そ の 程 度 が 増 す 傾 向 が 認 め ら れ 、 誘 発 6時 間 後 で 対 顛 群 に 比 較 し て 明 ら か に 浸 潤 程 度 が 強 く な っ た (Fig. 10)。 そ れ 以 降 は ほ ぼ プ ラ ト ー に 達 し た よ う に 患 わ れ た が 、 気 管 上 皮 及 び 気 管 粘 膜 下 に お け る 浸 潤 は 誘 発 48時 間 後 に 最 も 強 く な っ た (Fig.11)。 26

-Table

3.

Time-related

histopathological

findings

in

sensitized

guinea

pigs

after

provocation

by

OA

inhalation

Time

(hr)

after

OA

provocation

Pre

1

3

6

24

48

provocation

Number

of

guinea

pigs

examined

3

3

3

3

3

2

Grade

of

the

lesions

一士+

tt

一土+持 同士+

tt

一+

+

Anaphylactic

lesions

Perivascular

edema

in

lungs

3

a )

101

1

1

101

020

1

300

2

Pulmonary

bronchoconstriction

3

201

0

300

0

2

100

300

2

Other

lesions

Alveolar

hemorrhage

3

3

000

201

0

3

0

0

0

201

2

Neutrophil

infiltration

in

bronchial

submucosa

3

300

0

2

1

0

0

3

0

0

0

300

2

Foam

cell

a

回

regation

in

lungs

3

300

0

300

0

300

0

201

2

一

No

pathological

changes

，土

very

slight

ch

鉱1g

es

，

+:

slight

changes

，

tt:

Moderate

changes

，

a):

Number

of

guinea

pigs.

「 r4 、

(

s

c

o

r

e

)

凶 一

凶

回

園

3

4

2

。

3

6

2

4

4

8

T

i

m

e

(

h

r

)

a

f

t

e

r

o

r

o

v

o

c

a

t

i

o

n

F

i

g

.

9

.

The degrees o

f

eosinophil infiltration i

n

lung

tissue o

f

sensitized guinea pigs after provocation

with O

A

i

n

h

a

l

a

t

i

o

n

.

-Fig． 10，  （a｝：No Pathological changes at pre−provocation，

       and  （b）：moderate to severe eosinoPhil infiltratior｜        at small bronchiolar ml」cosa or submucosa at 6 hrs       after provocation． Luna stain． X33．

1

゜ビレ

Fig． 11．  （a｝：No Pathological changes at pre−provocation，

       and 

_{（b） ：moderate to severe eosinoPhil infi｜tration}

       at tracheal mucosa or submucosa at 48 hrs after

       provocation． Luna stain． X33． 一30一

2

.

ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 動 態

F

i

g

.

1

2

及 び

T

a

b

l

e 4

に 示 し た よ う に 、 誘 発

6

時 間 後 ま で は 新 滅 す る 傾 向 が 認 め ら れ 、 誘 発

3

及 び

6

時 間 後 で 有 意 (pく

0

.

0

5

) な 減 少 が 認 め ら れ た 。 し か し な が ら 、 誘 発 24時 間 後 で は 対 照 群 に 比 し 有 意 (pく

0

.

0

1)

か つ 急 激 な 増 加 が 認 め ら れ た 。 そ の 後 、 誘 発 48時 間 後 に は 対 照 群 の レ ベ ル に 復 し た 。 な お 、 TUNEL陽 性 細 胞 の 分 布 は 気 管 文 は 気 管 支 上 皮 よ り も 末 梢 の 肺 胞 上 皮 に 多 く 認 め ら れ た

(

F

i

g

.1

3

)

。 3. PCNA陽 性 細 胞 の 動 態 卵 白 ア ル ブ ミ ン 誘 発 後 の 経 時 的 な PCNA陽 性 細 胞 出 現 数 の 変 化 を

F

i

g

.

1

4

及 び

T

a

b

l

e 4

に 示 し た 。 誘 発

3

時 間 後 に 一 過 性 の 増 加 が 認 め ら れ た が 害 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 そ の 後 、 24時 間 ま で は 対 照 、 群 と 同 じ レ ベ ル で 推 移 し た が 、 誘 発 48時 間 後 に は 再 び 増 加 傾 向 が 見 ら れ 、 例 数 は 少 な い な が ら 、 有 意 差 (pく

0

.

0

5

) が 認 め ら れ た 。 な お 、 PCNA陽 性 細 胞 は TUNEL陽 性 細 胞 と 同 様 、 末 梢 の 肺 胞 上 皮 に 多 く 出 現 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。 -31幽

1

8

0

ω

コ

ω ω

一 パ ザ 本本

•

•

1

5

0

1

2

0

¥ ¥

ω

一一

ω

o

•

9

0

本 -E E ' T 1 1 申

•••

T 十 l

-•••

6

0

3

0

。

一

一

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u

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z

4

8

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2

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c

a

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t

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6

‘1 2 ' v a -L n H H ， s

・

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・ 、

3

T

i

m

e

。

o

f

tissue

l

u

n

g

n H

c

e

I

I

s

apoptotic

o

f

Number

1

2

.

F

i

g.

O

A

b

y

provocation

a

f t

e

r

P I g S

gUlnea

s e n s i t i z e

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e

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:Significantly

i

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a

l

a

t

i

o

n

.

Asterisk

respec t

i

v

e

I

y

.

i

V E -H H

(

0

pre-provocat i

o

n

Dく

O

.0

1

， 32

-a

n

d

pく

O

.

0

5

o

f

v

a

I

u

e

indicates

t

h

e

Table

4.

Number

of

apoptptic

cells

and

PCNA-positive

cells

in

lung

tissue

of

sensitized

gllinea

pigs

after

provocation

by

OA

inhalation

Number

of

PCNA-positive

cells

Number

of

apoptotoic

cells

Number

of

gllinea

pigs

examined

Time

(hr)

after

OA

provocation

(") f 円

16.33

士

6.51

16.00

土

7.55

41.

33

土

19.14

15.67

士

12.06

20.67

士

17.47

45.00

士

2.83*

32.00

土

9.00

22.00

士

11.

53

16.33

士

2.52*

11.

00

士

4.36*

128.00

士

30.81

**

17.00

土

5.66

円。

ndnd

円。円。

nJU

Pre-provocation

1

3

6

24

48

OA

Ovalubmin.

Values

are

expressed

as

mean

士

SD.

ヘ**;

Significantly

diIferent

from

the

value

of

pre-provocation.

Asterisk

indicates

p く

0.05

and

P<

0.01

，

respectively.

Fig， 13． Many TUN．EL         compartment        TUNEL stain．

positive，

at 24 hrs

X132．

apoptotic cells in

after proVocation．

alveolar

一34一

Φコω切＝＼ω二8Φ≧三ωoO＜ZO﹂午﹃oZ

71CU54つ0り乙−ー

0 1 ●

3   6        24

Time （hr） after Prov◎cation ＊

王

●● 48

Fig．14．

 Number of PCNA positive cells in lung tissue

of sensitized guinea pigs after provocation by

OA inhalation． ＊：Significantly differer｜t from

the value of pre−provocation 

（O hr｝． Asterisk indicates p〈0．05． ．35，

考 察 第

2

章 で 述 べ た よ う に 、 霧 化 し た 卵 自 ア ル ブ ミ ン を 経 気 道 的 に モ ル モ ッ ト に 吸 入 曝 露 さ せ た と こ ろ 、 感 作 成 立 時 に 、 肺 の 出 血 、 気 麗 及 び 気 管 支 あ る い は 血 管 周 囲 性 の 水 腫 と い っ た ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 様 の 変 化 が 認 め ら れ た 。 本 実 験 で は 、 更 に 同 様 の 操 作 に よ り 感 作 を 成 立 さ せ た 動 物 に 対 し 、 同 一 抗 原 に よ る ブ ー ス タ ー 及 び 誘 発 処 置 を 施 し 、 モ ル モ ッ ト の 気 道 に お け る 誘 発 後 の 経 時 的 な 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た 。 本 実 験 に お い て 、 病 理 組 織 学 的 に 、 誘 発 後 比 較 的 早 期 か ら 肺 に お け る 軽 震 か ら 中 等 度 な 血 管 周 囲 性 の 浮 題 及 び 気 管 支 の 収 縮 が 認 め ら れ 、 こ れ ら の 変 化 は い ず れ も ア ナ フ ィ ラ キ シ ー を 示 唆 す る 変 化 と 恩 わ れ た 。 そ の 後 、 気 道 粘 膜 に お け る 好 酸 球 の 浸 潤 が 時 間 の 経 過 と と も に 、 そ の 程 度 が 増 す 傾 向 が 認 め ら れ た 。 こ れ ら の 病 理 組 織 学 的 変 化 は 、 い わ ゆ る 端 患 患 者 に お け る IAR及 び LARに 相 当 す る 変 化 で あ り ι22、) IARの後、 4な い し 12時 間 で 好 酸 球 浸 潤 に 伴 っ て LARに 進 展 す る 事 実 J)と も 一 致 し た 。 ま た 、 端 患 モ デ ル を 用 い た 研 究 に お い て 、 Iijimaら 18) は 即 時 型 端 患 反 応 を 示 し た モ ル モ ッ ト の 40 % に の み 遅 発 型 端 息 反 応 を 誘 発 さ せ 、 湯 )11ら 41) は 卵 白 ア ル ブ ミ ン 受 身 感 作 モ ル モ ッ ト に お い て 遅 発 型 端 患 反 応 を 認 め て い な い な ど 、 IAR及 び LARを 同 じ 実 験 系 で 確 認 で き る モ デ ル は 少 な い 。 以 上 の よ う な 観 点 か ら 、 本 端 患 モ デ ル が ヒ ト 端 息 病 態 の 研 究 並 び に そ の 病 態 の 解 明 に 有 用 な モ デ ル と な り う る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第 2章 で 示 し た 実 験 に お い て 、 著 者 は 感 作 成 立 に 至 る 過 程 で ア ポ ト ー シ ス 細 胞 と 細 飽 増 殖 活 性 を 示 す PCNA陽 性 細 胞 の 肺 胞 上 皮 領 域 に お け る 増 加 を 観 察 し た 。 同 様 の 変 化 は 本 実 験 に お い て も 認 め ら れ 、 こ れ ら の 事 実 は 前 回 の 所 見 を 裏 付 け る も の で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 本 実 験 で は 、 こ れ ら の 肺 胞 上 皮 の 変 化 の 発 生 機 序 並 び に そ れ ら の 重 要 性 を 明 ら か に す る こ と は で き な か っ た が 、 著 者 の 知 る 限 り で は 、 ヒ ト 端 息 患 者 及 び 端 息 病 態 動 物 モ デ ル に お い て 、 ア ポ ト ー シ ス 細 胞 と 細 胞 増 殖 活 性 を 示 す PCNA陽 性 細 胞 の 肺 胞 上 皮 領 域 に お け る -36幽

増 加 を 認 め た と の 報 告 は な く 、 端 息 の 発 生 機 序 あ る い は 素 因 の 一 つ に 新 規 の 可 能 性 を 示 唆 す る も の と 思 わ れ 、 今 後 、 注 目 す べ き 病 変 で あ る と 考 え ら れ た 。 要 約 霧 化 さ せ た 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 反 復 吸 入 曝 露 に よ っ て 、 能 動 感 作 を 行 っ た モ ル モ ッ ト に 対 し 、 同 一 抗 原 に よ る ブ ー ス タ ー 処 置 並 び に 誘 発 処 置 を 施 し た 。 こ れ ら の 気 道 に お け る 誘 発 後 の 経 時 的 な 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し 、 以 下 の 結 論 を 得 た 。 1 ) 病 理 組 織 学 的 に 、 誘 発 後 比 較 的 早 期 か ら 蹄 に お け る 軽 度 か ら 中 等 度 な 血 管 周 囲 性 の 浮 腫 及 び 気 管 支 の 収 縮 が 認 め ら れ 、 こ れ ら の 変 化 は い ず れ も ア ナ フ ィ ラ キ シ ー を 示 唆 す る 変 化 と 患 わ れ た。 2) そ の 後 、 気 道 粘 膜 に お け る 好 酸 球 の 浸 潤 が 時 間 の 経 過 と と も に 、 そ の 程 度 が 増 す 傾 向 が 認 め ら れ た 。 3 ) こ れ ら の 病 理 組 織 学 的 変 化 は 、 い わ ゆ る 端 患 患 者 に お け る IAR 及 び LARに 相 当 す る 変 化 で あ り 、 本 端 患 モ デ ル が ヒ ト 鴫 患 病 態 の 研 究 並 び に そ の 病 態 の 解 明 に 有 用 な モ デ ル と な り う る こ と が 示 唆 さ れ た 。 4) ア ポ ト ー シ ス 細 胞 と 細 胞 増 殖 活 性 を 示 す

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ぜA 陽 性 細 胞 の 肺 胞 上 皮 領 域 に お け る 増 加 が 認 め ら れ た 。 ヒ ト 端 患 患 者 及 び 時 患 病 態 動 物 モ デ ル で 、 間 様 の 報 告 は さ れ て い な い 。 5) こ れ ら の 肺 胞 上 皮 の 変 化 の 発 生 機 序 並 び に そ れ ら の 重 要 性 に 関 し て は 明 ら か に さ れ な か っ た が 、 今 後 、 注 目 す べ き 病 変 で あ る と 思 わ れ た 。 37

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第4章

総括

気 管 支 端 息 の 病 問 、 病 態 の 解 明 と そ の 治 療 法 の 確 立 は 、 優 れ た 動 物 モ デ ル の 開 発 に よ っ て 可 能 と な る 。 端 息 モ デ ル に 関 す る 研 究 は 数 多 く な さ れ て き た が 、 そ の 作 製 は 基 本 的 に は 能 動 的 も し く は 受 動 的 感 作 及 び 誘 発 を 持 う も の で あ り 、 感 作 の み を 施 し た 動 物 に お け る 経 時 的 な 病 理 組 織 学 的 検 討 を 行 っ た 報 告 は 少 な く 、 特 に ア ポ ト ー シ ス 及 び 細 胞 増 殖 活 性 を 示 す 細 胞 の 動 態 に 注 目 し た 報 告 は な い 。 ま た 、 IARか ら LARに 推 移 す る 過 程 で 、 再 病 態 に 対 す る 経 時 的 な 病 理 組 織 学 的 検 討 を 実 施 し た 報 告 も 極 め て 少 な い 。 本 研 究 に お い て 、 著 者 は 抗 原 と し て 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 用 い 、 こ れ を 霧 化 し て 反 復 吸 入 曝 露 さ せ る こ と に よ り 感 作 モ ル モ ッ ト を 作 製 し 、 曝 露 回 数 を 重 ね る こ と に よ っ て 気 道 に 対 し ど の よ う な 変 化 が 認 め ら れ る か を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た 川 。 更 に 、 同 様 の 操 作 で 作 製 し た 感 作 成 立 動 物 に 対 し 、 同 一 抗 原 に よ る ブ ー ス タ ー 処 量 及 び 誘 発 を 行 っ て 端 患 病 態 モ デ ル を 作 製 し 、 気 道 に お け る 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 経 時 的 な 検 討 叫 を 加 え 、 以 下 の 結 果 を 得 た 。 1 . 卵 白 ア ル ブ ミ ン 反 復 吸 入 曝 露 に よ る モ ル モ ッ ト 気 道 に お け る 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 検 索 霧 化 し た 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 経 気 道 的 に モ ル モ ッ ト に 吸 入 さ せ 、 そ の 回 数 の 相 違 に よ っ て 、 感 作 成 立 に 至 る 気 道 の 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し 、 以 下 の 結 論 を 得 た 。 1) 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 10回 醸 露 に よ る 感 作 成 立 時 に 、 ア ナ フ ィ ラ キ シ 一 様 の 変 化 と と も に 、 細 胞 増 殖 活 性 を 示 唆 す る PCNA陽 性 細 胞 数 の 増 加 が 見 ら れ た 。 2) 気 管 及 び 気 管 支 粘 膜 に お け る リ ン パ 球 な ら び に 好 酸 球 の 増 加 領 向 が 認 め ら れ た 。 -39

-3 ) 蹄 胞 上 皮 綿 抱 に お い て 、 曝 露 回 数 を 重 ね る こ と に よ り 、 ア ポ ト ー シ ス 細 胞 数 の 増 加 傾 向 が 認 め ら れ た 。 4) ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 発 生 原 因 に つ い て は 明 ら か に さ れ な か っ たが、 IL・2投 与 に よ っ て 生 じ る と さ れ て い る VLSに 類 似 し た 変 化 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

2

. 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 感 作 及 び 誘 発 に よ り 作 製 し た モ ル モ ッ ト 端 患 病 態 モ デ ル に お け る 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 検 索 霧 化 さ せ た 卵 白 ア ル ブ ミ ン の 反 復 吸 入 曝 露 に よ っ て 、 能 動 感 作 を 行 っ た モ ル モ ッ ト に 対 し 、 需 一 抗 療 に よ る ブ ー ス タ ー 処 置 並 び に 誘 発 処 量 を 施 し た 。 こ れ ら の 気 道 に お け る 誘 発 後 の 経 時 的 な 変 化 を 病 理 組 織 学 的 及 び 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し 、 以 下 の 結 論 を 得 た 。 1) 病 理 組 織 学 的 に 、 誘 発 後 比 較 的 早 期 か ら ア ナ フ ィ ラ キ シ ー を 示 唆 す る 変 化 が 肺 に お い て 認 め ら れ た 。 2) 時 間 の 経 過 と と も に 、 好 酸 球 浸 潤 程 度 が 増 す 傾 向 が 認 め ら れ た。 3) こ れ ら の 変 化 は 、 い わ ゆ る 端 息 患 者 に お け る IAR及 び LARに 担 当 す る 変 化 で あ り 、 本 鴫 患 モ デ ル が ヒ ト 端 患 の 研 究 並 び に そ の 病 態 の 解 明 に 有 用 な モ デ ル と な り う る こ と が 示 唆 さ れ た 。 4) ア ポ ト ー シ ス 綿 胞 と 細 胞 増 殖 活 性 を 示 す PCNA陽 性 細 胞 の 肺 胞 上 皮 領 域 に お け る 増 加 が 認 め ら れ た 。 5) こ れ ら の 肺 胞 上 皮 の 変 化 の 発 生 機 序 並 び に そ れ ら の 重 要 性 に 関 し て は 明 ら か に さ れ な か っ た が 、 今 後 、 注 目 す べ き 病 変 で あ る と 思 わ れ た 。 帽 40岨

謝 辞 本 稿 を 終 え る に あ た り 、 本 研 究 に 対 し 終 始 適 切 な る 御 指 導 、 御 校 関 を 賜 り ま し た 元 鳥 取 大 学 農 学 部 、 現 北 海 道 大 学 獣 震 学 部 梅 村 孝 司 先 生 に 表 心 よ り 感 諜 い た し ま す 。 ま た 、 本 論 文 の 査 読 並 び に 御 助 言 を 賜 り ま し た 鳥 取 大 学 農 学 部 上 原 正 人 先 生 、 御 助 言 と ご 鞭 援 を 賜 り ま し た 宮 崎 大 学 農 学 部 立 山 普 先 生 、 鳥 取 大 学 農 学 部 島 田 章 則 先 生 、 同 じ く 北

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智 敬 先 生 、 菱 沼 貰 先 生 の 各 諸 先 生 方 に 深 甚 な る 謝 意 を 表 します。 本 研 究 の 機 会 を 与 え て 彊 き 、 終 始 御 援 助 と 励 ま し の 言 葉 を . 賜 り ま し た 元 杏 林 製 薬 株 式 会 社 代 表 取 締 役 会 長 、 故 荻 原 秀 博 士 、 杏 林 製 薬 株 式 会 社 常 務 取 締 役 、 西 納 昏 吾 博 士 、 研 究 セ ン タ 一 所 長 、 岡 田 孝 道 博 士 に 厚 く 御 礼 申 し 上 げ ま す 。 最 後 に 、 本 研 究 遂 行 に 際 し 、 実 験 動 物 の 感 作 手 技 に 郵 指 導 を 直 い た 中 央 研 究 所 書j薬 研 究 三 部 部 長 、 大 橋 光 雄 博 士 並 び に 種 々 の 御 協 力 を 頂 い た 安 全 性 研 究 部 の 諸 氏 に 感 謝 い た し ま す 。 補 4

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