液相等電点泳動を用いた二次元泳動法の活用
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(2) 電気泳動 第 58 巻 第 2 号，2014 年. CDKL5 の非常によい基質となることが明らかとなった ５）. プロテインキナーゼの基質探索法への応用 . 我々は同様の手法を用いることにより, これまでに. 細胞機能は多様なリン酸化シグナル経路によって制御. Doublecortin-like protein kinase (DCLK) の 基 質 と し て. されていることが知られている. そのため, プロテインキナ. Synapsin II, ミ ヤ コ グ サ Nuclear Dbf2-related kinase. ーゼの基質を同定するための様々な手法が開発され, 多. homolog (PKL01)の基質として Histone を同定した 6, 7). これ. くのプロテインキナーゼの基質が同定されてきた. しかし,. らの結果は, 液相等電点分離による基質タンパク質の分画. プロテインキナーゼの生理的な基質には未同定なものが. がプロテインキナーゼの基質探索において非常に有効な. 多く残されている. そこで我々は, 組織抽出液中のタンパ ク質を MicroRotofor を用いて分画し, プロテインキナーゼ. 手法であることを意味する.. の基質とすることでより多くの基質をみいだせる手法を考. Native MicroRotofor/Native-PAGE 二次元泳動. 4). 案した .. を用いたホスファターゼ活性の検出 細胞内のリン酸化シグナルはプロテインキナーゼによる リン酸化とプロテインホスファターゼによる脱リン酸化のバ ランスで成り立っている. このリン酸化・脱リン酸化の不均 衡は様々な疾病の原因に関与することが知られている. そ のため, プロテインホスファターゼの制御機構を調べる手 法の開発が望まれている. このような背景の中で我々は, 様々なホスファターゼの蛍光発生基質となる 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP)を用いたゲル内での ホスファターゼ活性の検出法を開発した 8). このゲル内ホス ファターゼ活性検出法と MicroRotofor を組み合わせた新し いホスファターゼの活性プロファイル法について概説する. Native MicroRotofor/Native-PAGE 二次元泳動によるゲ ル内ホスファターゼ活性検出法 9)は 3 つのステップからなる.. 図 2 CDKL5 の内在性基質の検出.. 第 1 ステップとして, タンパク質試料を非変性条件下にて. MicroRotofor を用いて分離したマウス脳抽出液の各画 分と CDKL5 を[γ-32P]ATP 存在下でインキュベートし, SDS-PAGE で分離後, オートラジオグラフィーにて検出. MicroRotofor を用いて液相等電点分離する. 第 2 ステップ では, 等電点分離した試料を二次元目として. した. 黒枠は Amph1 のリン酸化バンドを示す. Native-PAGE にて分離する. 最後に, MUP を基質としたゲ. . ル内ホスファターゼアッセイを行い, 365 nm で励起すること によりホスファターゼ活性の蛍光バンドを検出する. 図 3 に. Cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5)は主に脳に発 現する Ser/Thr キナーゼであり, レット症候群という女児に 起こる進行性の神経疾患の原因遺伝子の一つである. し かしながら, CDKL5 の活性化機構や基質についてはほと んど知られていない. そこで, CDKL5 の生理的な基質を探 索するため MicroRotofor を利用した. 内在性のキナーゼを 失活させるためマウス脳抽出液を変性条件下におき， MicroRotofor を用いてタンパク質を液相等電点分離した. 得られた各画分を基質として CDKL5 を用いてキナーゼア ッセイを行い, オートラジオグラフィーにて基質タンパク質 の検出を行った. MicroRotofor で分離する前の粗抽出液を 基質にした場合には基質タンパク質は検出されなかった が（図２, レーン：Input）, 分離後のフラクション 2 において 120 kDa の基質タンパク質が検出された. 質量分析装置を. 図 3 プロテインホスファターゼ活性の検出 ラット脳抽出液を Native MicroRotofor/Native-PAGE で 分離し, MUP を基質としたゲル内ホスファターゼアッセ イにより検出した.. 用いた解析により, この基質タンパク質は Amphiphysin1 (Amph1)と同定された. キナーゼアッセイにより Amph1 は 57. . 57.
(3) 電気泳動 第 58 巻 第 2 号，2014 年. 示すように，実際にこの手法を用いてラット脳のホスファタ. zebrafish doublecortin-like protein kinase using a. ーゼ活性を検出すると, 異なる画分から 10 本以上の蛍光. highly active truncation mutant. J Biochem. 2010;. バンドが検出された. この結果は, 本手法を用いることによ. 147:711-722.. って, 様々な状況下における細胞内の多様なホスファター. 7) Kameshita I, Shimomura S, Nishio K et al.. ゼの活性をプロファイルすることが可能であることを示唆す. Expression and characterization of PKL01, an Ndr kinase homolog in Lotus japonicus. J Biochem.. る.. 2010;147:799-807. 8) Kameshita I, Baba H, Umeda Y, Sueyoshi N. In-gel. おわりに . protein. phosphatase. assay. using. fluorogenic. substrates. Anal Biochem. 2010;400: 118-122.. MicroRotofor を用いた液相等電点泳動を利用するとタン. 9) Baba H, Masuda Y, Sueyoshi N, Kameshita I. In-gel. パク質の効率の良い分離・回収を簡便に行うことができる. 本稿では, この手法を二次元電気泳動法に応用すること. phosphatase. により, プロテインキナーゼおよびプロテインホスファター. dimensional electrophoresis. J Biochem. 2012;152:. ゼを介したリン酸化研究への応用例を紹介した. 液相等電. 557-563.. 点分離を利用した二次元電気泳動法は, リン酸化研究だ けでなく様々な他の研究分野においても広く応用される可 能性を秘めていると考えられる. 今後, 本手法がより幅広 い分野で利用されることによりその応用範囲が益々拡大さ れていくことを願う. 文 献 1) Kameshita I, Tsuge T, Kinashi T et al. A new approach for the detection of multiple protein kinases using monoclonal antibodies directed to the highly conserved region of protein kinases. Anal Biochem. 2003;322:215-224. 2) Sugiyama Y, Sueyoshi N, Shigeri Y et al. Generation and application of a monoclonal antibody that detects a wide variety of protein tyrosine kinases. Anal Biochem. 2005;347: 112-120. 3) Sugiyama Y, Sueyoshi N, Kameshita I. Twodimensional expression pattern analysis of protein kinases. after. separation. MicroRotofor/SDS–PAGE.. Anal. by Biochem.. 2006;359:271-273. 4) Senga Y, Nagamine T, Sekiguchi M et al. Detection of protein kinase substrates in tissue extracts after separation by isoelectric focusing. Anal Biochem. 2011:408:345-347. 5) Sekiguchi M, Katayama S, Hatano N et al. Identification of amphiphysin 1 as an endogenous substrate for CDKL5, a protein kinase associated with X-linked neurodevelopmental disorder. Arch Biochem Biophys. 2013;535:257-267. 6) Shimomura S, Nagamine T, Hatano N et al. Identification. of. an. endogenous. substrate. of 58. . 58. assay. using. non-denaturing. two-.
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