圧力発芽誘導を利用した芽胞数の迅速測定技術
重田有仁・中西魅加子・杉原正洋・塩野忠彦・松下利恵・橋本顕彦・青山康司
Rapid Counting Method for Bacterial Spores Using Hydrostatic Pressure-induced Germination SHIGETA Yujin, NAKANISHI Mikako, SUGIHARA Masahiro, SHIONO Tadahiko, MATSUSHITA
Rie, HASHIMOTO Akihiko, AOYAMA Yasushi
Staining with 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) is widely used as a rapid counting method for viable bacteria. However, bacterial spores are not stained by CFDA. We studied a method of staining bacterial spores using CFDA after hydrostatic pressure-induced germination. The B.subtilis spores were stained using CFDA by pressurization at 50 MPa or more. The stained spore counts by fluorescence microscopy were almost equivalent to viable counts measured in the cultivation method. Twelve types of Bacillus spores and Geobacillus stearothermopilus spores were measured using this method. The difference of the measured values between the staining method and the cultivation method was within one log-cycle. We also inoculated B.subtilis spores in a liquid seasoning and measured the counts after hydrostatic pressure-induced germination (100 MPa, 40°C, 15 min) using a commercially available rapid measurement device. The correlation coefficient of the rapid method and the cultivation method was 0.99. The results suggested that the CFDA staining method using pressurization may be used for rapid counting of bacterial spores.
Keywords: bacterial spores, rapid measurement, pressure-induced germination,CFDA staining キーワード：細菌胞子，迅速測定，圧力誘導発芽，CFDA 染色 食の安全・安心に対する消費者ニーズに応えるため，食 品企業においては製品や原料中の微生物数を迅速に把握し， 安全性と品質を保証した製品を市場に出荷できる衛生管理 体制の確立が強く求められている．一方，一般的に行われ ている培養法による微生物検査では結果判明に 2～5 日間 を要するため，製品や原料，製造環境の微生物汚染状況を より迅速に測定する新たな微生物の迅速測定法に対するニ ーズが高まっている． 近年，様々な迅速測定法が開発されているが，その内の ひとつである蛍光染色法は，微生物細胞を蛍光色素で染色 し検出する方法で，短時間（十～数十分）で検査可能とい う利点を有し，現在いくつかのメーカーから測定装置が販 売されている．しかし強固な外壁を有し，休眠状態にある 芽胞については，細胞内に蛍光色素が浸透しにくいため， 測定が困難である．耐熱性を有する芽胞は食品等の加熱殺 菌後も残存する可能性があり，腐敗や日持ち低下，食中毒 発生の大きな要因の一つであるため，芽胞についても迅速 に測定できる技術の開発が望まれている． これまで筆者らは，圧力（静水圧）による芽胞の発芽誘 導作用について研究してきた1)． 圧力には殺菌作用があり， 芽胞の殺菌技術としても古くから研究されてきたが，20～ 200MPa 程度の圧力処理には芽胞の発芽誘導作用があるこ とも知られている2) 3)． この様な比較的低圧域において芽 胞はほとんど死滅しないが，発芽は効率的に誘導される4) 5)． この圧力発芽誘導処理を蛍光染色法に応用したところ，発 芽による外壁分解や生体活動の再開により，蛍光色素の浸 透性・染色性が高まることを見出した．すなわち，適切な 条件で芽胞を予め圧力処理すれば，蛍光染色法により芽胞 も染色可能になり，蛍光染色法で迅速（1 時間以内）に生 芽胞数を測定することができる（圧力発芽誘導染色）．芽胞 も含めた迅速測定が実現すれば，製品や原料，製造環境汚 染の早期発見と迅速な是正措置を可能にするだけでなく， 検査の効率化，出荷の早期化による製品の倉庫保管料の削 減等の出荷・管理コストの削減に資することができる． 本稿では，圧力を利用した芽胞数の迅速測定技術の開発 において得られた基礎的データならびに食品での分析例に ついて報告する． 実 験 方 法 １. 供試菌 Bacillus.subtilis（日本缶詰協会 No.1403）等の 12 種
類のBacillus 属および Geobacillus stearothermopilus の芽胞懸濁液を glucose broth （pH 7.0）に接種，35℃で 24 h 培養した後，培養液を普通寒天培地プレート（日水製 薬株式会社製）に塗布し，35℃で 5～8 日間培養して芽胞を 形成させた．顕微鏡観察により芽胞形成を確認した後に芽 胞を回収し，遠心分離（1,400×g，4℃，10min）を 3 回繰 り返すことにより洗浄し，最終的に 1/15 M リン酸緩衝液 （pH 7.0）に懸濁して 80℃，10 分間加熱して残存する栄養 細胞を殺菌した．調製した芽胞は使用時まで-80℃で冷凍保 存した． 食材由来の芽胞の調製法は以下のとおりである．ニンジ ン，ジャガイモ，レンコン，ゴボウ，サツマイモを 80℃， 30 分加熱した後に 35℃で 2～3 日間保存し，増殖してきた 微生物を釣菌してシングルコロニーを分離した．得られた コロニーから上記のBacillus 属等の芽胞と同様の方法で 芽胞を調製した． 2. 圧力処理装置 芽胞の圧力処理（静水圧処理）は，圧力処理容器（テク ノ環境機器株式会社製）を用いて行った．加圧媒体には水 を使用した．容器は常圧～400MPa の範囲で処理が可能で， 昇圧は高圧ハンドポンプ（KP-5-B 型，光高圧機器株式会社 製），圧力調整は Heise 社製の圧力ゲージ（Model-CC）を用 いて行った． 3. 発芽誘導，蛍光染色による芽胞数の測定 発芽誘導，蛍光染色による芽胞数の測定手順を図 1 に示 す．芽胞を 1/15 M リン酸緩衝液（pH 7.0）あるいは市販 の液体調味料（めんつゆ）に懸濁させた．発芽誘導処理は， 圧力処理のみ，発芽誘導物質処理のみ，圧力処理及び発芽 誘導物質の併用処理の 3 種類の方法により行った．圧力処 理のみの場合，芽胞懸濁液を滅菌済みのフレキシブルパウ チに充填し，50～200MPa，40℃，15min の圧力処理を行っ た．発芽誘導物質処理は，芽胞の発芽を誘導することが知 られている 10mM L-アラニン，10mM アスパラギン，10mM グ ルコース，10mM フルクトース，50mM リン酸カリウム，1mM イノシン6)7)を含む 1/15 M リン酸緩衝液（pH 7.0）に芽胞 を懸濁させ，0.1MPa，40℃，15min 反応させることで行っ た．圧力処理及び発芽誘導物質の併用処理は，上述した発 芽誘導物質を含むリン酸緩衝液に懸濁した芽胞を滅菌済み のフレキシブルパウチに充填し，100 MPa，40℃，15min 圧 力処理することで行った．各種の処理により発芽させた芽 胞を，孔径 0.2μm のポリカーボネート製メンブランフィル ター（ADVANTEC 社製）でろ過した後，150μg/ml の 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)溶液（Sigma
社製）をフィルター上に添加し，室温で 10 分間反応させた． CFDA 溶液をろ過により除いた後に 1/15M リン酸緩衝液(pH 7.0)をろ過してフィルターを洗浄し，蛍光顕微鏡（BX-51， OLYMPUS 株式会社製）を用いて B 励起によりフィルター上 の 20 視野の発色粒子数を計数した．芽胞濃度は以下の式に より求めた． 芽胞濃度=20 視野の平均発色粒子数×ろ過面積／視野面 積／ろ過液量 また，発芽誘導処理した芽胞懸濁液について，微生物数 の迅速測定装置（バイオプローラ KB-VKH02，光洋産業株式 会社製）を用いて芽胞濃度を求めた．蛍光染色は，迅速測 定装置用 CFDA ストック溶液（KB-VKR-21，光洋産業株式会 社製）を緩衝液（KB-VKR-22，光洋産業株式会社製）を用い て 3％（v/v）となるよう希釈した染色液を用いて，専用フ ィルター（KB-VKF-03，光洋産業株式会社製）上で室温で 10 分間反応させることにより行った.測定操作は迅速測定 装置のマニュアルに準拠して実施した. 4. 培養法による芽胞数の測定 芽胞懸濁液を 70℃，20 分間加熱活性化したのちに滅菌 した生理食塩水で段階希釈した．希釈した試料液 1ml を， 標準寒天培地（日水製薬株式会社製）を用いて混釈培養 （35℃，48 時間）し，発現したコロニー数を計測した． 実 験 結 果 1. 圧力発芽誘導染色に及ぼす圧力の影響 図 2 に本法により CFDA 染色したB.subtilis 芽胞の蛍光 顕微鏡写真を示す．図2に示すとおり，未処理の芽胞はCFDA 図 1 試験の基本的な手順 図 2 圧力処理したB.subtilis芽胞の蛍光顕微鏡画像
では殆ど染色されないが，圧力処理を施す事により染色効 果が大きく高まっていることが分かった． B.subtilis 芽胞について，50～200 MPa，40℃,15min の 圧力処理を行って芽胞数を求めた結果を図 3 に示す．本菌 については50 MPa以上の圧力において培養法とほぼ同等の 測定値が得られた． 2. 種々の芽胞に対する染色効果の検証 12 種類のBacillus 属および G. stearothermopilus の芽 胞について本法により分析した結果を図 4 に示す．菌種に より測定値の違いはあるが，培養法との誤差は概ね 1 オー ダー以内となった．種々の食品由来芽胞の分析結果を図 5 に，各菌の遺伝子同定結果を表 1 に示す．圧力処理，発芽 図 5 種々の食品由来芽胞に対する染色効果 100 MPa，40℃，15min 処理 図 4 種々の芽胞に対する染色効果 100 MPa，40℃，15min 処理 図 3 B.subtilis芽胞の圧力誘導発芽染色に対する圧力の影響 分離源 菌種 タマネギ1 B. pumilus タマネギ2 B. aerophilus ジャガイモ1-2 未同定 ジャガイモ2-1 未同定 ジャガイモ2-2 Paenibacillus polymyxa レンコン1 Rummeliibacillus pycnus レンコン2 B.amyloliquefaciens ゴボウ B.amyloliquefaciens サツマイモ2 B.amyloliquefaciens 表 1 食品由来芽胞の同定結果
誘導物質処理，圧力及び発芽誘導物質処理について芽胞数 を測定した結果，圧力処理の方が芽胞の検出数が多く，さ らに圧力処理と発芽誘導物質の併用により，特にジャガイ モやレンコンより分離した菌については染色率を高められ る場合があることも分かった． 3. 迅速測定装置による分析 迅速測定装置を用い，圧力処理（100MPa，40℃,15min） した食品由来芽胞について芽胞数測定を行った．本装置は， 蛍光顕微鏡と同様の原理で，メンブレンフィルター上に補 足した染色粒子を CCD カメラにより撮影し，観察画像を画 像処理により計数する装置である．本装置による分析にお いても，培養法とほぼ同等で，蛍光法よりも，より精度よ く芽胞数を検出できた（図 6）． 4. 食品中での発芽誘導・染色効果 市販めんつゆに，B.subtilis 芽胞（日本缶詰協会 No.1403）を添加して迅速測定装置で測定し，圧力発芽誘導 染色に対するめんつゆに含まれる成分の影響を検討した （図 7）．その結果，アミノ酸，核酸，ペプチド，糖等の成 分を含む食品系においても，本法により芽胞数を計測でき， 培養法と高い相関を有することが分かった（r=0.99）．本装 置の測定範囲は 102～105 cells/フィルターであるが，本実 験の測定範囲も 102～105 cells/ml であった（ろ過量を 1ml とした場合）． 一方，めんつゆ中の芽胞数測定において，塩分が高い試 料や食品由来の夾雑物を多く含む試料の場合は，芽胞数を 正しく測定できない場合があった．塩分は芽胞の発芽を阻 害することが知られている6)． また，蛍光法において，食 品由来の夾雑物に蛍光色素が非特異的に吸着し，観察画像 のバックグラウンド値が増加する場合がある8)．それらを 軽減するため，図 8 に示す前処理を行った．まず，試料を 希釈し，圧力処理時における食塩濃度を低下させた．また， 遠心分離により比重の軽い夾雑物を除去し，ろ過により比 較的大きな夾雑物を除去した．さらに，界面活性剤である Tween 80 による洗浄を行った．前処理を行った結果，本法 による測定値と培養法による測定値が比較的一致した（図 9）． 図 6 迅速測定装置による食品由来芽胞の測定 100 MPa，40℃，15min 処理 ※ 迅速測定装置および蛍光法による測定は，圧力処理と発芽誘導物 質を併用して発芽・染色を行った 図 8 試料の前処理手順 図 9 各種めんつゆに添加した B.subtilis芽胞の測定 100 MPa，40℃，15min 処理 ※ 迅速測定装置および蛍光法による測定は，圧力処理と発芽誘 導物質を併用して発芽・染色を行った 図 7 迅速測定装置による麺つゆ中の芽胞測定 100 MPa，40℃，15min 処理 ※ 迅速測定装置および蛍光法による測定は，圧力処理と発芽誘導物 質を併用して発芽・染色を行った
5. ふき取り検査への応用 ステンレス板上に塗布・乾燥させたB.subtilis 芽胞（日 本缶詰協会 No.1403）について，綿棒でふき取り検査を行 い，本法ならびに迅速測定装置による分析を行った．その 結果，102 cells/ml 程度まで培養法と高い相関（r=0.99） を持ちながら菌数測定できることが分かった（図 10）． 考 察 1. 圧力発芽誘導染色に及ぼす圧力の影響 圧力発芽誘導に関する完全なメカニズムは明らかにな っていないが，圧力処理によって発芽経路が活性化される こと，脱水状態にあるコアに水が浸透することが報告され ている3) 9) ．これらの作用により，CFDA の芽胞内部への浸 透と発色が可能になったものと推察される（図 2）． 圧力による発芽を評価した研究1)において，50～100 MPa で発芽率がほぼ一定になったが，本研究においても 50～ 100 MPa で検出される芽胞数はほぼ一定となった（図 3）． 高すぎる圧力は芽胞を死滅させる恐れもあることから，本 研究では圧力処理条件を 100 MPa とした． また，既報1)では，圧力発芽誘導を利用した染色に最適 な温度は 40℃であったことから，本試験における基本的な 条件は 100 MPa，40℃，15min を採用することとした． CFDA は微生物細胞内に浸透した後，細胞内のエステラー ゼにより 6-carboxyfluorescein に加水分解され，蛍光を発 生するようになる10)．従って，死滅し，エステラーゼ活性 を失った芽胞については染色されない．食品中の微生物数 の測定においては，生残している微生物数を測定すること が目的であるため，芽胞数の測定における CFDA の利用は有 効であると思われた． 2. 種々の芽胞に対する染色効果の検証 菌種によって違いが見られるものの，発芽誘導物質と比 較すると，圧力処理は各種の菌に対して一定の効果がある ことが分かった（図 5）．特に，圧力処理と発芽誘導物質を 併用した系においては，幅広い菌種に対し効果を示した． 圧力処理は発芽誘導物質のレセプターを活性化することが 報告されており3)，また，これまでの研究1)においてもア ミノ酸や糖などの栄養成分の存在下で圧力処理を行うと， 発芽率が高まることも明らかとなっている．食品等に存在 する菌種は未知であることが多いため，圧力や発芽誘導物 質を併用することで多様な菌種に対して効果的な染色，検 出が可能になると思われる． 3. 迅速測定装置による分析 これまで蛍光顕微鏡による染色芽胞の観察・計数を行っ てきたが，本技術の普及を考慮すると測定の簡易化・自動 化が可能な迅速測定装置で測定することが望ましい．そこ で，市販の迅速測定装置を用い，本技術の有用性を検証し た結果，蛍光法に比べ，迅速測定装置による測定値は培養 法による測定値に近づいた．本装置は染色芽胞をトラップ したフィルターを走査して芽胞数を算出するが，走査範囲 は蛍光顕微鏡による目視観察領域よりも広い．その結果， 精度が向上したと考えられた．また，蛍光顕微鏡観察画像 に比べ、迅速測定装置の CCD カメラで撮影した画像は画素 数，感度の面で劣るが，迅速測定装置でも芽胞を検出でき たことから，CCD カメラでの捕捉に十分な蛍光量を有して いることが明らかとなった． 本装置は試料をろ過した検査用チップをセットすれば， 約 10 分程度で測定結果を得ることができる．従って，圧力 処理 15 分，染色反応 10 分に加え，ろ過工程，測定時間を 考慮しても合計 1 時間以内には芽胞数を測定することが可 能となった． 4. 食品中での発芽誘導・染色効果 芽胞の発芽は周囲の環境（pH や水分活性等）により影響 を受けるが，圧力により誘導される発芽についても，低 pH や高濃度の食塩が存在する環境では発芽が阻害されること， アミノ酸や糖の存在下では発芽が促進されることが分かっ ている1) 11) 12) ．低塩分のめんつゆにおいては本法と培養 法と高い相関が確認されたことから，アミノ酸，糖等を含 む食品系においても圧力処理によって芽胞が発芽・染色さ れることが明らかとなった．高濃度の塩分や夾雑物を含む めんつゆ中の芽胞数測定においては，前処理が必要であっ た．食品には多様な成分，夾雑物が含まれるため，これら の操作が必須と思われた． 今後，より広範囲の食品でその効果を検証する必要はあ るが，以上の結果から，圧力発芽誘導染色と迅速測定装置 を併用することで簡便且つ迅速な芽胞数の測定法として利 用できる可能性が示された． 5. ふき取り検査への応用 ふき取り検査では，迅速測定装置の検出限界である 102 cells/ml 程度までは精度よく菌数測定できることが分か 図 10 ふき取り検査試料の迅速測定装置による測定 100 MPa，40℃，15min 処理 ※ 迅速測定装置および蛍光法による測定は，圧力処理と発芽誘導物 質を併用して発芽・染色を行った
った（図 10）．ふき取り検査のような系では発芽に影響す る成分や，ろ過や画像処理に影響する夾雑物が少ないため， 本法が比較的利用しやすいと考えられた．本法を用いるこ とで，ふきとり検査に要する時間を短縮でき，工場内の器 具や環境の汚染箇所を迅速に判別し，洗浄・殺菌などの措 置を速やかにとることができるようになると考えられる． 要 約 1）B.subtilis 芽胞について，圧力処理によって芽胞を 発芽させた結果，CFDA による染色性が高まることが明らか となった．また，染色された芽胞数を蛍光顕微鏡観察によ り計数した結果，50 MPa 以上の圧力において培養法とほぼ 同等の測定値が得られることが分かった． 2）圧力発芽誘導を利用した芽胞の染色により，市販の 迅速測定装置を用いて芽胞数を測定できることが明らかと なった．本法と培養法の相関は 0.99 であった．また，めん つゆなどの栄養成分，食塩などを含む系やふきとり検査に おいても本法は利用することができた．本法によれば，種々 の菌種の芽胞を培養法と高い相関をもって短時間に測定で きることが明らかとなった． 文 献
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