沖縄股業 (J.Okinawa
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黒麹菌を用いた固体発酵によるサトウキビエキスの開発
広瀕直人・照屋亮・三枝隆裕 I)• 和田浩二 2)（沖縄県股業研究センター，＂沖縄工業裔等専門学校， 2) 琉球大学農学部）
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要約 サトウキビ粉砕物に黒麹菌を接種して固体発 酵を行った後に搾汁し，サトウキピエキスを得 た．サトウキビエキスはアンジオテンシン I 変 換酵素阻害活性及び抗変異原性を有していた． 黒麹菌によるさとうきび粉砕物の固体発酵は， 泡盛蒸留廃棄物を添加することで促進された． キーワード：サトウキビ，黒麹菌， Aspergillusl
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固体発酵，クエン酸，泡盛蒸留粕 緒言 沖縄県の基幹作物として広く栽培されている サトウキビ (Saccharums
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hybrid) は血圧上 昇抑制効果が認められている T ーアミノ酪酸(GABA)
(Hayakawa ら， 2004) をはじめミネ ラルやビタミンなど多様な有用成分を豊富に含 んでいる（氏原ら， 2004). また，サトウキピ の搾汁液を浪縮して製造される黒糖（含みつ糖） はサポナリン等のフラボン配糖体（荻•前田， 2008) やフェノール性抗酸化成分 (Takara ら，2
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ポリコサノール (Irmak ら， 2006) などを含有し，ポリフェノールに由来す る動脈硬化抑制作用 (Inafuku ら， 2007),LDL
酸化抑制作用や糖類分解酵素阻害作用（前田・ 荻， 2008) など，多種の機能性が報告されてい 2016年 5 月 9 日受付 2016年 7 月 6 日受理 る． このようなサトウキビの持つ生理機能性を 生かした加工技術として，筆者らは乳酸発酵に よって GABA を増強したサトウキビ乳酸発酵 飲料を開発した（広瀬ら， 2008). また，サト ウキビ酢は飲用酢市場の成長に伴い注目を集め ており，ラジカル消去能抗変異原性，がん細 胞の増殖抑制ナチュラルキラ一細胞の作用活 性化などの豊富な機能性が報告されている（吉 元ら， 2001). ー方， 沖縄県では黒麹菌(
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luchuensis) を利用した独特の蒸留酒である泡 盛の製造が盛んである．黒麹菌が生産するクエ ン酸は蒸留廃棄物中に残存し，蒸留廃棄物より 固形分を除去した液部は「もろみ酢」として利 用され，人気を博している．また，焼酎麹菌は 植物細胞壁溶解酵素群を著量に生産し，焼酎膠 の機能性に寄与している（伊藤， 2005) ほか． 抗酸化能の増大（石川ら， 2005) や，ポリコサ ノールの遊離 (Musa ら， 2004) などが報告さ れており，固体発酵による植物体の分解産物に は，多様な生理活性の付与が期待される．蒸留 廃棄物のうち固形分は可消化養分やタンパク質 を含有している（玉城ら, 2013) が，一部が飼 料として利用されているのみであり，高付加価 値素材への転換（古田ら， 2010) など有効利用 技術の開発が望まれている．2
8
沖縄典業第48巻第 l 号 (2017) 本報では，クエン酸を含有し，かつ，高い機能 性を有した発酵飲料の開発を目的として，サト ウキビ粉砕物を発酵基質とした黒麹菌による固 体発酵を試みた． 材料及び方法1
.
供試試料 黒麹菌は市販の種麹（焼酎用黒麹種菌，ビオッ ク）を卓上ミル (IFM-800, 岩谷産業）で粉砕 して用いた．サトウキビは春植の Ni15 (粟国 島産. 3 月中旬収穫）を用い，サトウキビ用シュ レッダー (CSS-NS。01, 日特機械工業）で破砕 して用いた．シュレッダー破砕物（以下サトゥ キビ破砕物と称する）は使用時まで一 20℃で保 存した．泡盛蒸留廃棄物は久米仙酒造（沖縄県 那覇市）より入手した．泡盛蒸留廃棄物より1
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rpm X
20 分間の遠心分離で固液分離し． 泡盛蒸留粕（固部）および泡盛蒸留廃液（液部） としたなお，蒸留粕は凍結乾燥して供試した．2
.
固体発酵方法とサトウキピエキスの調製方法5
0
g のサトウキビ破砕物を 500 ml 容の三角 フラスコに取り， 121℃で 15 分間オートクレ一 ブ殺菌した後に 1.0 g の種麹を接種し. 30℃で 静囮して発酵を行った．泡盛蒸留廃棄物の添加 では，蒸留粕の凍結乾燥品を 1.5g
(湿重量で5
.
0
g に相当）または蒸留廃液 5.0 g をサトゥ キビ破砕物に添加した後に良く混合し．ォート クレーブ殺菌を行った．発酵中は毎日 1 回，撹 拌操作を行った．発酵後のサトウキビ破砕物に1
2
0
ml の蒸留水を加えて卓上ミルで粉砕し， 油圧プレス (P-1D, 理研機器）を用いて 24.5 MPa で 5 分間加圧して搾汁した（搾汁率 ~60 ％）．搾汁液を 10,000rpm X
10 分間の遠心分 離次いで No.2 ろ紙でろ過して固形分を除去 した後に 150 ml に定容し．サトウキビエキス を得た．3
.
液体発酵方法 油圧プレスを用いてサトウキビ破砕物を搾汁 し（搾汁率 =67%), 50µm メッシュパスした 後に 121 ℃で 15 分間オートクレープ滅菌して 用いた.5
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ml のサトウキビ搾汁液に種麹を1
.
0
g 接種し，ジャーファ一メンター (LTI-700, 東京理化器械）を用いて発酵を行った．発酵温 度は 30℃とし，通気量は 0.5 ml/min とした． 発酵液は 10,000rpm X
10 分間の遠心分離，次 いで No.2 ろ紙でろ過した後に分析に供した．4
.
分析方法 アミノ酸の分析にはアミノ酸分析システム (LC-VP アミノ酸分析システム．島津製作所） を使用した． カラムは Shim-packAmino-Na
（島津 GLC) を用い. o- フタルアルデヒドを反 応試薬として蛍光強度 (Ex=348r
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Em=450
nm) を蛍光検出器 (RF-lOAX.L, 島津製作所） で測定した．有機酸の分析には有機酸分析シス テム (LC-lOA. 島津製作所）を用いた．カラ ムは Shim-packSPR-H (
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2 本直 列．島津 GLC) を用い．移動相は 5mM p —ト ルエンスルホン酸緩御液には 5mM p- 卜）に工 ンスルホン酸と 100µM EDTA を含む 20m M
Bis-Tris を用いた．流速を 0.7 ml/min とし，力 ラム温度は 40℃とした．検出器には電気伝導 度検出器 (CDD-6A. 島津製作所）を用いた． 糖組成は液体クロマトグラフ (LC-20A, 島津 製作所）で分析した． カラムは AsahipakNH2P-50 (
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Shodex) を用い，移 動相は 75% アセトニトリル．流速を 1.0m
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とし，カラム温度は 40℃とした．検出器には 蒸発光散乱検出器 (ELSD-LT. 島津製作所） を用いた． アンジオテンシン 1 変換酵素広瀬・照屋・三枝· 和田：黒麹菌を用いた固体発酵によるサトウキビエキスの開発 29 (ACE) 阻害活性は道畠らの方法 (2003) を参 考に， Hip-His-Leu (和光純薬工業）を基質に 用いた ACE (ウサギ肺由来，シグマ• アルド リッチ）の阻害活性を HPLC 法で測定した．抗 変異原性は，変異原に Trp-P-2 (和光純薬工業）， 供試株にサルモネラ菌 (Salmonella typhimurium) TA-98 株を用いたエームス法（新本， 2000) に より測定した．試料は滅菌水で希釈し，メンブ レンフィルター (0.45µm) でろ過して供試し た． 結果および考察
,
.
黒麹菌によるサトウキピの固体発酵と液体 発酵の比較 麹菌は固体発酵において種々の酵素を菌体外 に生産することが知られている（岩下， 2005) ことや．液体発酵ではアミラーゼやセルラーゼ などの酵素生産が固体発酵よりも低くなること (Iwashita ら. 1998) など．固体発酵と液体発 酵では大きく挙動が異なる．ー方で，液体発酵 では無菌培養が容易であることや，培養のパラ メータ一を管理しやすいことなど利点も多く， 液体麹開発も進められている（小路ら.2
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そこで，サトウキビ破砕物の固体発酵と，サト ウキビ搾汁液を用いた液体発酵について，それ ぞれ 30℃で発酵して，クエン酸の生成星を指 標として発酵程度を比較した．その結果，固体 発酵では発酵 3 日目までに pH が大き＜低下し， クエン酸の生産量が約 1.6% に達した．総遊離 アミノ酸は発酵 1 日目で急激に減少し， 3 日目 には 9 割程度を消費していた．グルタミン酸は 発酵初期に増加するが，その後は減少し， GABA の蓄租は見られなかった． ショ糖は発 酵初期に速やかに分解されてブドウ糖及び果糖 が生成するが，その後の減少は見られなかった （図 lA). ー方，液体発酵では pH の低下は緩 やかであり，クエン酸生成母は発酵 5 日目でも 0.05% 程度であった．総遊離アミノ酸は微増傾 (A2)4固体発酵
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0 1 2 3 4 5 0 2 0 0 0 発酵＂数（日） 図,. 黒麹菌によるサトウキピの固体発酵と液体発酵の比較． 30℃で発酵を行った．•
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pH,• ; Brix, X ; クエン酸，◆；総遊離アミノ酸，△ ；グルタミン酸， □;
GABA, • ：ショ糖，〇；プドウ糖，◇;
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沖縄農業第48巻第 l 号 (2017) 向であったが． グルタミン酸や GABA の増減 は小さかった．また．ショ糖の分解は固体発酵 に比べて遅く．単糖の生成もゆるやかであった （図 18) ことから．液体発酵では黒麹菌の生 育が不良であることが推察された．以上の結果 より．黒麹菌によるさとうきびの発酵は．生育 が良好でクエン酸を多く生産する固体発酵が適 することが明らかとなった．小路ら (2013) は， 液体麹の製造において穀皮が存在する玄麦の利 用で酵素の生産性が高まることを報告している． 本研究ではサトウキビ搾汁液を液体発酵の培地 として使用したが．搾汁残演の配合等によって 酵素の生産性が変化する可能性がある．今後．菌体の生育やクエン酸生成に関与する発酵条件
を特定し．検討を進めてい＜必要がある．2
.
固体発酵の発酵温度 黒麹菌の最適生育温度は 37 ℃前後である （比嘉， 2007) が．黒麹菌のクエン酸生産は 32 ℃で最大となる（谷口ら， 2001) など，麹菌で (A) 発酵坦度 30℃ 24 6 18 5 ~ こ-、1.5 ゼc:c 12 4 至~.、 I は生育に適する温度と物質生産に適する温度が 異なる場合が多い（岩野ら， 1987). そこで， サトウキピ破砕物の固体発酵を 30℃および 37 ℃で行い，クエン酸の生成量を指標として発酵 程度を比較した．その結果， Brix や pH の低下 には大きな差異は見られなかったものの， 37℃ ではクエン酸の生成且が減少し，発酵 l 日目に 見られるグルタミン酸の蓄積も小さくなったこ とから，発酵温度は 30℃が適していると考え られた（図 2).3
.
泡盛蒸留廃棄物の添加が固体発酵に及ぽす 影響 黒麹によるサトウキビ破砕物の固体発酵では． 発酵中に遊離アミノ酸が少なくなり．単糖が消 喪されずに残存した（図 1, 2) ことから，サ 卜ウキビ原料だけでは窒素源の枯渇によって発 酵が制限されていることが示唆された．そこで， 粗タンパク質を 4 割程度含む未利用資源である 泡盛蒸留廃棄物（野原ら， 2002) の添加につい,
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；出▲;
Brix, X ; クエン酸，◆；総遊離アミノ酸，△ ;グルタミン酸， □;
GABA, ●：ショ糖， Q; プドウ糖，◇；果糖．広瀬・照屋・三枝•和田：黒麹菌を用いた固体発酵によるサトウキビエキスの開発
3
1
て検討した結果を図 3 に示す．培地の pH は無 添加の 5.2 から泡盛蒸留廃棄物の添加によって 4.2-4.3 に低下したが．発酵 l 日目には添加の 有無による差異は見られなくなった. Brix の 低下は泡盛蒸留粕添加区が最も大き＜．次いで 泡盛蒸留廃液添加区となった．クエン酸の生成 は発酵 3 日目でほぽ頂点に達したが．生成量は 泡盛蒸留粕および泡盛蒸留廃液添加区で無添加 区の 1.5 倍程度に高くなった．発酵前の培地中 における総遊離アミノ酸母は．無添加の 171 mg/lOOml に対して泡盛蒸留粕添加区は 220mg
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泡盛蒸留廃液添加区では 236 mg/lOOml と増加したが．発酵 6 日目には．そ れぞれ 17, 22 および 15 mg/lOOml まで減少し． (A) 無添加（対照） 24 6 2 18s
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、-1.5 • aビ 12l 4 至門 l 6 3 減少率は 90.3,
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93.5% であった．また， 発酵 2 日目のグルタミン酸の蓄積が泡盛蒸留粕 添加区で高くなった．ショ糖の動向は各試験区 において大きな差異は無く，発酵 2 日目でほと んどが分解された．ー方，単糖は泡盛蒸留廃棄 物添加区で，発酵 3 日目以降に減少した．糖類 総量（ショ糖，ブドウ糖および果糖の総和）で は無添加の 10.3% に対して泡盛蒸留粕添加区 は 11.4%, 泡盛蒸留廃液添加区では 14.3% と増 加した．発酵 6 日目には，それぞれ 8.0, 4.0 お よび 6.0% まで減少し，減少率は無添加の 22.6 ％に対して，泡盛蒸留粕添加区は 65.0%, 泡盛 蒸留廃液添加区では 58.1% と，大きく増加した． これらの結果より，泡盛蒸留廃棄物の添加によっ溢吾星
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2 (C) 泡盛蒸留廃液添加 24 6返J曽
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2 発酵 H 数 (n) 図 3. 黒麹菌によるサトウキピの固体発酵における泡盛蒸留残澄添加の影唇•
；出▲；Brix,X ; クエン酸，◆；総遊離アミノ酸，△ ；グルタミン酸， □;
GABA, ●：ショ糖，〇；プドウ糖，◇；果糖． 4 6 8 4 6 83
2
沖縄殷業第48巻第 l 号 (2017) て． 糖分の消投が進み． サトウキビ破砕物の固 体発酵が促進されることが明らかとなった発 酵後の総遊離アミノ酸残存品が同程度であった ことから．泡盛蒸留廃棄物添加の添加拭を増や すことで． 更に糖分の消毀を進めることが可能 と考えられるが， 泡盛蒸留廃棄物由来の風味や． 残存する糖分がさとうきびエキスの食味に及ぽ す影響も含めて． 更なる検討が必要である．4
.
サトウキピエキスの機能性 サトウキビ破砕物を黒麹菌で固体発酵させ， 搾汁して得られたエキスについて機能性を評価 したその結果 ACE 阻害活性は泡盛蒸留廃 棄物の添加によって研くなり，いずれの場合で も発酵 2 日目に最大俯を示した （図4). 泡盛 をはじめとする各種焼酎の蒸留廃菜物中にはア ミノ酸やミネラル等の多くの有用成分を含み （瀬戸 U ら.2
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麹菌が生産するクエン酸を 生かした「もろみ酢」として利用されている． また，泡盛蒸留廃棄物の液体部分を原料とした 「もろみ酢」には 1f1L/王上昇抑制作用の指標とな る ACE 阻害活性が見出されている（比嘉ら． 60o
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（ま）起迎惇理
。 (A) ACE阻害新性 無添加泡盛蒸留泡盛蒸留 （対照） 粕旅）J[I 廃液涼）JII2
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また，斉藤ら (1992) は酒粕よ り ACE 阻害活性を見出し．寄与物質が麹菌の プロテイナーゼにより生成した 2~5 残基のペ プチドであると推測しているサトウキピエキ ス中の ACE 阻害活性も短鎖ペプチドが関与し ていることが推測され．発酵と共に更に分解さ れて活性を失ったものと思われた． ー方． 抗変 異原性は発酵の進行と共に高くなり．泡盛蒸留 粕添加区で高いようであった（図 4). 食品中 に含有される成分には． ポリフェノール類をは じめとして抗変異原性を有する物質が多く見出 されている（大江， 1991). また． 後藤 (2003) は消酒の醸造中に抗変異原性が菩梢することを 報告しており，渡辺ら (2004) はリパーゼ活性 が高い麹菌を利用したみそは脂肪酸含有品が高 ＜．抗変異原性が向上したみそになることを報 告しているサトウキピエキスにおいても，発 酵の進行と共に抗変異原性を有する物質が菩梢 しているものと考えられた 以上の結果より．黒麹菌によるサトウキビの 固体発酵によってクエン酸を含有するサトウキ ビエキスの製造が可能であり，泡盛蒸留廃棄物9
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（ま）起医眺嵌蕊
(B) 抗変異原性 無恭加泡盛蒸留泡盛蒸留 （対照） 粕旅）JU 廃液蔀加 図 4. 黒麹菌による固体発酵で得られたサトウキピエキスの機能性 30℃で固体発酵を行った. mean土標準誤差 (n=3). 口 ；発酵前， ● ；発酵 2 日目， ●;
発酵4 日目．広瀬・照屋・三枝•和田：黒麹菌を用いた固体発酵によるサトウキピエキスの開発 33 の添加によって固体発酵が促進されることが明 らかとなった．泡盛蒸留廃棄物のうち蒸留廃液 （液部）は「もろみ酢」としての利用が確立さ れているが，蒸留粕（固部）の用途開発に寄与 するものと思われる．今後はサトウキビ由来や 黒麹菌が産生する酵素による分解産物がもたら す機能性に併せて，泡盛蒸留粕由来の機能性付 与も視野に入れた機能性評価を進め，より高付 加価値を有する発酵飲料の開発に向けて研究を 進めてい＜ことが必要である． 謝辞 サトウキビ原料を提供頂いた JA おきなわ粟 国支店の皆様．泡盛蒸留廃棄物を提供頂いた久 米仙酒造の皆様に感謝致します．
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引用文献 後藤邦康 2003. 消酒中の抗変異原性．醸協 98:4
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比嘉賢一・入福濱寿・照屋亮・照屋隆司 2003. もろみ酢の微生物制御に及ぽす酢酸添加の影 菩および市販製品の品質分布に関する研究． 沖縄エ技報 5:
7
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比嘉賢一・照屋亮・池亀孝 2004. 保険機能因 子強化飲料及びその原材料の品質評価研究． 沖縄エ技報 6:
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比嘉賢一 2007. 沖縄黒麹もろみ酢の製造方法 に関する研究 (I) 製麹条件の検討．沖縄エ 技報 9:
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広瀬直人・氏原邦博・照屋亮•前田剛希・吉武 均• 和田浩二• 吉元誠 2008. r ―アミノ酪 酸 (GABA) を増強したサトウキピ乳酸発酵 飲料の開発．食科工 55:
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古田吉史・丸岡生行・中村彰宏・大森俊郎・園 元謙二 2010. 乳酸菌を利用した焼酎蒸留粕 の高付加価値素材への転換プロセスの構築． 生物工学 88:
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石川絹子・森下真希・小泉幸道・福田靖子 2005
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セサムフラワの微生物処理が抗酸化機能 性に及ぽす影響．名古屋女子大紀 51:
2
7
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3
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伊藤消 2005. 焼酎麹菌の酵素生産の特徴．醸 協 100:
8
3
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8
4
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岩野君夫・三上重明・福田消治・能勢晶・椎木？1
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焼酎白麹の各種酵素生産に及ぽす製麹 条件の検討．醸協 82:
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34 沖縄股業第48巻第 l 号 (2017)
