原 著
倭女羅i熾56第三、魏言〕
実験的ぶどう膜炎におけるロイコトリエン（LT）
特に：LTB4の基礎的研究
東京女子医科大学付属第二病院眼科（指導者：宮永嘉隆教授） シン リキ ユウ コ神 力 祐 子
（受付平成3年1月24日）Basic Research of Leukotriene B4 in tlle Experim6ntal Uveitis
Yuko SHINRIKI
Department of Ophthalmology（Director：Prof． Yoshitaka MIYANAGA）
Tokyo Women’s Medical College Daini Hospital
Recently， much attention has been given to leukotriene（LT）as a chemical mediator of uveitis． The author examined LTB4 and other LTs in cases of experimental uveitis in rabbits． Experimental uveitis was indused by 1）injection of antigen into the vitreous body，2）Arthus type， and 3）Autoimmune type． We have comfirmed that LTB4 was reiated closely between other LTs in our study which LTs inj㏄ted in vitreous body and estimated LTs levels in aqueous humor．
These results clearly indicate the significance of LTB4 in ocular inflammation．
緒 言
ぶどう膜炎におけるchemical mediatorとし
て古くはhistamin， serotonin， bradykinin等の
autacoidの研究に始まり，1970年代にprostag− landins（PGs）が注目を集め，多くの研究成果が 報告された．その後，leukotrienes（LTs）の作用 も研究されるようになり，金らにより眼科領域に おけるLTsの関与の重要性が報告された1）2）．即 ち，これらの報告によれば実験的ぶどう膜炎にお ける家兎眼組織中にLTC4， LTD4が活性化，増量 し，眼炎症と強く相関することが判明している． しかし，強い白血球遊走能を持つLTB4について はまだ充分な研究がなされていない．そこで，著 者は白血球の遊走が主体となる眼炎症において， とりわけその作用の強いLTB4がどのように関与 するかを検討する目的で，以下のごとく基礎的研 究を行った． 材料および実験方法 1．実験動物 実験動物は体重約2，500gの雄性有色家兎を実 験的ぶどう膜炎作製に12匹，LTsの硝子体注入に 5匹，合計17匹使用した． 2．実験方法 1）実験的ぶどう膜炎の作製 Table 1のごとく3種のぶどう膜炎を作製し た． （1）抗原の硝子体注入によるぶどう膜炎 家兎眼を0．4％塩酸オキシブプロカイン（ベノ キール⑪）にて表面麻酔し，前房水を27G針付き1 ml注射器に0．2ml採取した．次に，角膜輪部より 5mm上外方の毛様体扁平部より，生理食塩水に 溶解した10％egg albumin（EA，和光純薬）を硝 子体中央部に0．2m1注入した．他眼は同様の操作 により，生理食塩水を硝子体注入して比較対照と した． （2）Arthus型ぶどう膜炎
Table l LTB40f experimental uveitis
LTB4〔p mol／ml〕
Uveitis Antigen Clinical丘ndings Aqueous?浮高盾
Vitreous @body InjeCtion intO 10％EA Hypere卑ia of conjunctiva 2．79 0，423
vitreous body
@ （N＝2）
and iris
Posterior synechia of iris
Myosis
Flare of anterior chamber
Precipitat of lens
Vitreous opacity
Arthus type 1％BSA Discharge 5．98 1．97
（N二2） Hyperemia of conjunctiva and iris
Myosis
F｝are of anterior chamber Fibrin in anterior chamber Fundus invisible
Autoi㎜une type Choroid 〔一〕 0，833 〔一〕
（N＝4） Ciliary Vitreous opacity
4．08 0，631
body
Retina Exudates in peripheral retina 3．57 0，321 All three Snow ball in vitreous body 4．02 0，807
retinal haemOrrage
Contro1（N‘罵2） 〔一〕 〔一〕 〔一〕 0，884
Contro1（N＝1） Saline 〔二〕 0，661 0，420
脈絡膜抗原硝子体注入を除いて，各ぶどう膜炎の前房水中にコントロールに比較して高いLTB4
値を示した．
2％bovine serum albumin（BSA，和光純薬） とFreund complete adjuvant（CFA， Difco）の 等量乳化混液を作製し，家兎のfoot pads 4ヵ所 に各0．1ml，背部皮下1ヵ所に1．6mlを注射した． 2週間後，booster』としてさらに1m1．を背部皮下 に注入した．booster後1週間目に血清を2ml採 取し，沈降抗体法により抗体価の上昇を確かめた 後，（1）と同様の操作で1．0％BSA生理食塩水0，2 mlを抗原として硝子体中に注入し， Arthus型ぶ どう膜炎を惹起させ，約24時間後に炎症所見を確 認した． （3）実験的自己免疫性ぶどう膜炎（EAU） ウサギの脈絡膜抽出液，虹彩抽出液，．網膜抽出 液，および三種の混合液についてそれぞれを抗原 として，EAUの作製を試みた．松島の方法3）に準 じて有色家兎眼をネンブタール麻酔下で摘出し Fig．1のこ．とく抗原抽出を行りた．即ち，摘出し たウサギ眼より脈絡膜，虹彩，網膜を分離し，リ Extraction of antigens Retina Choroid 畢 ↓
Added phosphate buffer total volume 5． O皿1
旦 ↓ Homogenize〔30times〕 5 ↓ Freeze〔一70℃．15皿in〕 5 ↓ Stir 〔＋4℃，ユ2hrs〕 畢 ↓ ■ ／ ＼ Ciliary body ↓ 〔0．067匿，pH7．0〕 Centfif㎎e〔16，000G，1hr〕 旦 ／ ＼ 尋 ξ 尋 尋 尋 ／ ＼ Precipitate Supernatant Precipitate SupernatanしPrecipitate Supernatant
■ 畢 ‘
Antigen
Fig．1Manufacture of antigens
眼組織を分離し，上記のごとく処置した後，上清をそ
ン酸緩衝液（0．067M， pH 7．0）を加え，全量を5．O mlとした．ついで小型ホモジナイザーに30回かけ て均質化した後，凍結融解を3回反復操作した． これを約24時間4℃で撹搾して抗原の抽出を行 い，さらに16，000G 1時間遠沈し，上清をそれぞ、 れの抗原として使用した．脈絡膜，虹彩，網膜各々 と三者全てを混合した抗原（混合抗原）について CFAとの等量乳化混液を作製した．（2）と向様に 家兎を4種の抗原で感作した後，各々の抗原を硝 子体注入して炎症を惹起させた． 2）LTB4抽出方法 LTB4抽出はFig．2のごとく河野らの方法4）に 準じギ行った． ゆ 炎症所見を確認した家兎は，過量のチオペン タールナトリウムにて致死せしめ，直ちに前房水 を採取した後，眼球摘出し，ディスポ注射器にて 硝子体中央部を吸引採取した．この前房水と硝子 体にあらかじめ準備しておいた氷冷下4倍量の
80％エタノールを加え室温で30分放置後，
4℃4，700G，20分間遠沈した。さらに時を移さず 上清中に含まれている有機溶媒をN2ガスにて除 去し，pH 5．6に調整し蒸留水を加えて全量を5m1 とした．これをあらかじめエタノールで処理したSEP−PAKカラムC18カートリッジ（Waters
Aqueous hu皿or of rabbit eye
◆■Added 4 times of ethano1
〔stand in ice 脚ater〕
ぐ一Centrif㎎e 4，700G for 20皿in at 4℃
／ ＼
Precipitate Superllatant
←匿Removal of ethanol under vaccuo〔below 30℃〕 ぐ■Added of distilled water
5ml oftotal vo1㎜e ◎■Adjust at pH 5曜6
Applyi㎎to C 18 SEP−P超colu㎜
ぐ一〇。OQ25聾acetic acid buffer 5ml ぐ■Ethanol：0．0025皿acetic acid buffer 1 20：80 pH 5．6 5ml 2 30：70 pH 5．6 5ml 3 60：40 pH 5．6 5皿1 Samples l RIA Fi9．2 Extraction of LTB4 Assoc．）に充填し，0．0025M酢酸緩衝液，20％お よび30％エタノールで洗浄した．その後，60％エ タノールでLTsを溶出し， N2ガスにて2ml以下 に再濃縮した．．
3）LTB4の測定
2）で抽出した検体のLTB4はLTB4〔3H〕
assay reagents system（Amersham）を使用し RIA法で測定した． 〔3H〕LTB4100μ1，抗しTB4血清100μ1，50mM Tris塩酸緩衝液100μ1を加え24時間4℃に放置し た．翌日dextran−coated charcol 200μ1を添加後 4℃，2，000Gで15分間遠沈し，上清について液体 シンチレーションカウンター（パッカード）で3H を測定した．
4）LTs硝子体注入による前房水中のLTsの
動態 LTB4（Amersham）， LTC4， LTD4， LTE4（い ずれもマルポ）はエタノールを減圧下に除去し25 μg／mlに調整した．家兎の前房水0．2mlを吸引の 後，LTを1種ずつ各々0．2ml硝子体中に注入しAqueous humor of rabbit eye
／
Precipitate
／ Precipitate
命一Added 4 times of ethanol
〔stand in ice water〕
●一Centrifuge 4，700G for 20皿in at 4℃
＼ Supθrnatant
φ■Added of CH2C12 30ml
phosphate buffer （0．1懸， pH7．4） 10ml ←Centrif㎎e 2，000G for 15min at 4℃
／ ＼ Supernatant
Applyi㎎to C 18 SEP−P魅colu㎜ ◎■Wash with water 10m1 ◆瞳Hethanol：0．1％AcOH 1 60：40 3ml 280：203皿1 370：30100μl S…皿Ples I HPI、C RIA
た．1時間後，2時間後に前房水を採取し，2）と 同様の操作で直ちにLTsを抽出した．右眼の前房 水でLTB4，左眼の前房水でLTC4， LTD4， LTE4
をFig．3のごとくRIA法（New England
Nuclear）にて測定した． 対照には生理食塩水を使い，同様に測定を行っ た． 結 果 1．実験的ぶどう膜炎の肉眼的所見（Table 1） 抗原の硝子体注入によるぶどう膜炎では，抗原 注入後8日目に，結膜および虹彩の充血，縮瞳， 前房混濁，硝子体混濁などの強い眼内炎症状を呈 した．Arthus型ぶどう膜炎では，眼内炎所見に加 えて多量の分泌物，フィブリン析出などを認め， 今回作製したぶどう膜炎の中では最も強い炎症反 応を示した．実験的自己免疫性ぶどう膜炎におい ては脈絡膜抗原では炎症反応は認められなかっ た．その他の抗原では前眼部には肉眼的に炎症所 見を認めなかったが，虹彩抗原では硝子体の混濁， 網膜抗原では網膜周辺部の滲出斑を認めた．混合 抗原では硝子体草筆球状混濁，網膜出血などさら に強い炎症所見を認めた． 2．実験的ぶどう膜炎におけるLTB4 無処置眼を除く全ての前房水か・らLTB4が検出 された．Arthus型ぶどう膜炎は5．98pmo1／mlで 最も高値を示した．肉眼的に前眼部に炎症所見の 認められなかった虹彩，網膜および混合抗原注入 眼でも各々4．08，3．57，および4．02pmol／mlが検 出された．炎症所見の認められなかった脈絡膜抗 原注入眼は対照の生理的食塩水注入眼とほぼ同じ 低値であった。 硝子体のLTB4はArthus喚ぶどう膜炎が1．97 mol／m1で最も高値を示した．しかし無処置眼で も0．884pmo1／ml検出され，他のぶどう膜炎は低 値であった． 3．正Tsの硝子体注入による前房水中1、Tsの動 態について（Fig。4，5） 生理食塩水を硝子体注入した対照（n＝2）では 前房水中のLTsの値は全例0．1pmo1／ml以下で あった．LTB4注入群で前房水中のLTB4が上昇し，1
時間値は2時間値よりも高値であった， LTC4注入群ではLTB、が1時間値で，またD4， E4が2時間値で高値を示した．LTD4注入群でもLTB4の1時間値は2時間値
よりも高く，一方，C4， D4， E4は2時間値が高かっ た． LTE4注入群ではLTC4， D4が2時間値， E4が1 時間値および2時間値で高値であった． 考 察LTsはアラキドソ酸から5・lipoxygenaseに
よって合成される一連の代謝産物である．眼科領 域では実験的アレルギー性眼内炎の際にlipox− ygenaseが活性化されるという報告5）や，実験的ぶ どう膜炎においてLTC4， LTD4が遊離されるとい う報告2）があることから，LTB4も眼炎症に関与し ている可能性は高いと考えられる．今回，我々は 種々の実験的ぶどう膜炎を惹起しそのLTB4の動 態を検討した． 前房水中のLTB4は，最も強い炎症所見を呈し たArthus型ぶどう膜炎で最高値を示した．肉眼 的には眼炎症が確認されなかったEAUの脈絡膜 抗原注入眼では対照とほぼ同じ筆順を示したが， その他のぶどう膜炎では，その肉眼的炎症所見に 応じて前房水中にLTB4が増加した． ぶどう膜炎発症時の血液房水柵の破壊はすでに 確認されており，この時アラキドソ酸カスケードが刺激されてcyclooxygen3se系のPGsが増加
することは解明されている事実である．同一カス ケード内のlipoxygenase系も同様に刺激を受け てLTs等が活性化されることは考えられる．今回 測定されたLTB4の由来は不明であるが，実験的 ぶどう膜炎の発炎初期にはぶどう膜の血管拡張と 多核白血球の浸潤がみられることから，．血液中の 多核白血球からLTB4が遊走し，集積した白血球 からさらにLTB4が産生増量して前房水中に増加 することは推察できる． 一方，硝子体中のLTB4の測定値は全て低値で 必ずしもその炎症強度を明確に反映していなかっ た．硝子体はゲル状で抗原などの異物が長く局所 に留まったり，周囲組織からの細胞浸潤にやや時 間がかかるとされている．今回は硝子体中央部か1」T levels 〔P皿ol〆ml〕 2．5 2．0 1．5 1．0 0。5 く0．1 0 ○ ○ ● LT levels 〔pmol／m1〕 ．2．5 2．0 1．5 1．0 0．5． ○○● ○○● ○○● ＜0．1 0 ○○ ● ※Control〈0．1〔N＝2〕 0 1hour ● 2hours ● ● ○○● ○○ ○○ LTB4 LfC4 LTD4 1、τE4 ．LTB4 ．LTC4 LTD4 LTE4
a．五TB4 injected 〔N＝12〕 b．1TC4 injected 〔N＝12〕
Fig．4 LT levels in aqueous humor when each LTs inlected in to the vitreous
bodies LTB4， LTC4を注入すると前房水中のLTB、は1時間後に増加しその後減少する傾 向が認められた． LT levels 〔P皿ol／m1〕
”ト
2．5 2．0 1．5 1．0 0。5 ＜0．1 0 ○ ○ ● ● ● ○○ ○○ ● ○○ 1」T levels 〔pmol／m1〕 2．5 2．0 1．5 1．0 0．5 くO．1 0 ※Contro1＜0．1〔評＝11〕 0 1hour ● 2hours ● ● ○● ○○ OO O● ○ 1、TB4 LTC凄 LTD4 LTE4 1、TB4 LTC4 LTD4 LTE4c．LTD4 injected 〔N＝12〕 d．1、TE4 injected 〔N＝12〕
Fig．5 LT levels in aqueous馳humor when each LTs injected in to the vitreous
bQdies
LTD4を注入した場合，前房水中のLTB4は1時間後に増加しその後減少する傾向が
ら主として採取しており，硝子体採取に際して周 辺部を完全に採取しきれなかった可能性はある． しかし，血液網膜関門の存在も考慮するとLTB4 の硝子体中への遊離は少ないものと考えられる．
LTsを直接硝子体中に注入した後の眼内の
LTsの動態に関しては，’前房水中のLTB4のほか LTC4， D4， E4も測定した． LTs硝子体注入後の炎 症所見は肉眼的には一過性で10分後には消失する ものであった．LTB4の硝子体注入により前房水中にはLTB4
のみが増加した．Battacheerjeeらの報告6）では， 実験的にLTB4を前房に注入した場合，前房水中 の白血球が2∼3時間より集積しはじめ，4時間 が最高値を示したとされる．またLatanzaらは実 験的眼外傷後，前房水中のLTB4は6時間まで増 加すると報告7）している．今回はLTB4の1時間値 が2時間値を上回ったが2時間以降の測定を行っ ていないためLTB4がこの後減少するか，再度増 加するかは不明である．いずれにしてもこの結果 ではLTB4は早い時期に極大に達するものと考え られる．従って一連の実験操作により，すでに血液房水柵が破壊されLTsの増加は前房水中の
LTsの増加として反映されていることが推測さ れる．LTC4， D4， E4はSRSと総称され，金によ れば正常ウサギ眼組織にA23187を作用させると 虹彩，毛様体，脈絡膜および結膜から強いSRSの 遊離がみられるが，アレルギー性ぶどう膜炎発症 眼の前房水中にSRSは認められなかったという 報告2）されている．一方Latanzaらは実験的眼外 傷後，前房：水中のLTC4も6時間まで増加すると 報告7）している．眼組織に対する刺激によりSRS の前房水中への遊離は異なるようである． LTC4の硝子体注入後1時間でLTB4が増加し， 2時間値でLTD4とLTE、が増加した． LTD4硝子体注入後も1時間でLTB4が増加し，2時間値で
LTC4， D4， E4が増加した． LTE4ではLTB4は変 化せず，2時間値でLTD4と：LTE4が増加したがわずかであった．これらのことからLTC4と
LTD4は， LTB4との相互関係があり硝子体内に注 入されるとまずLTB4を遊離し，ついでやや時間 をおいてSRSであるLTC、， D4が遊離される傾向 があることが推察される．すなわちLTC4， D4の遊離はLTB4とは違ったpathwayを通るため2時
間値の方が大とな：ると考えられる．LTE4はLTD4 の代謝物でありLTB、とは明らかな相互関係がな いことも示唆された． LTsの眼組織に対する作用はまだ十分に解明 されていない．生体の炎症反応には多くのchemi− cai mediatorやcytokinesなどが，その病態，三 型によって関与し合っており‘，もとよりLTsだけ で炎症を説明することはできないが，今回の実験 から眼炎経時にはLTB4も関与していることが示 唆された．臨床的にもベーチェット病の眼発作な どの病態には白血球集積の因子としてLTB4の関 与は十分想定されるものである．今後はさらに多 くのぶどう膜炎における，他の起炎物質との関連 についての研究が待たれるところである． 稿を終えるにあたり，ご指導，ご校閲いただきまし た宮永嘉隆教授に深謝いたします．』 文 献 1）金工媛，宮永嘉隆，河野茂勝ほか：モルモット眼組織からのslow reacting substance（SRS）の 遊離．炎症 4：31−36，1984
2）Kin K：Rerease of slow reacting substance
from rabbit ocular tissues． Jpn J Ophthalmol 28 ：263−273， 1984 3）松島利明：自己の網膜抗原を用いた実験的ぶどう 膜炎に関する研究．玉眼 81：1064−1073，1977 4）河野茂勝，山村秀樹，南部文男ほか：モルモット 肺組織から遊離したロイコトリエンの測定法，高 速液体クロマトグラフィによる測定．免疫実験操 作法 XIII：4459−4466，1984 5）藤原久子：眼組織におけるリポキシゲナーゼ代謝 物質と炎症について．眼紀 35：671−676，1984 6）Battachrjee P， Hammond B， Salmon JA et
a1：Chemotactic response to some ara−
chidonic acid lipoxygenase products in the rabbit eye． Eur∫Pharmaco1ア3：21−28，1981
7）1、atanza I．， Alfaro DV， Bockmah R et al：． Leukotrienes levels in the aqueous humor fo1． Iowing experilnental ocular trauma， Retina 8： 199−204， 1988
