Title
Synergistic growth inhibition by acyclic retinoid and
phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor in human hepatoma cells(
要約版(Digest) )
Author(s)
馬場, 厚
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(医学) 甲第946号
Issue Date
2014-03-25
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/49079
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学位論文要約
Extended Summary in Lieu of the Full Text of a Doctoral Thesis 甲第 946 号 氏 名： Full Name 馬 場 厚 Atsushi Baba 学位論文題目
：
非環式レチノイドとPI3 阻害薬の併用による肝癌細胞の相乗的増殖抑制Thesis Title Synergistic growth inhibition by acyclic retinoid and phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor in human hepatoma cells
学位論文要約： Summary of Thesis レチノイドX受容体RXRαは，核内受容体superfamilyにおけるmaster regulatorであり，他の核内受 容体とヘテロダイマーを形成することで，正常な細胞の分化・増殖・死を制御している。近年，R XRαが異常リン酸化修飾を受け機能不全（レチノイド不応状態）に陥ることが，ヒト肝発癌に深 く関与していること，すなわち，リン酸化RXRαは，肝発癌抑制・肝癌細胞増殖抑制における重要 な標的分子であることが明らかになってきている。RXRのアゴニストとして開発された非環式レチ
ノイド（Acyclic retinoid; ACR）は，大規模臨床介入試験において，初発肝癌根治治療後の二次肝 発癌を有意に抑制し，生存率を改善することが報告されている。ACRは，ヒト肝癌細胞株の増殖を 阻害し，動物モデルにおける肝発癌を抑制するが，その機序として，ACRは肝癌細胞におけるRXR αの異常リン酸化修飾を解除し，その機能を修復することが明らかになっている。さらにACRは， 異なる作用機序を持つ薬剤と併用することで，肝発癌や肝癌細胞の増殖に対し強い抑制効果を発揮 することより，相乗効果を期待した「併用化学肝発癌予防」のkey agentとしても高い注目を集めて いる。 Ras/MAPKやPI3K/Aktシグナルの過剰活性化は，RXRαのリン酸化修飾において重要な役割を果 たしている。特にPI3K/Aktシグナルは，細胞の分裂や成長など細胞の生存促進シグナルとして機能 していることが知られており，抗癌剤のtargetとして期待されている。今回我々は，有効な新規併用 化学肝発癌予防法を開発すべく，ACRとPI3K阻害薬の併用処理が，ヒト肝癌細胞に対して相乗的な 増殖抑制効果を及ぼすか検討し，その機序について解析した。 【対象と方法】 ヒト肝癌細胞株（HLF，Hep3B，Huh7，HepG2）とヒト正常肝細胞株（Hc）を，ACRとPI3K阻害 薬であるLY294002またはBKM120で，それぞれ単独あるいは併用処理し，細胞増殖抑制の相乗効果 をMTS assayとcombination index (CI)を用いて検討した。また，HLF細胞をACRとLY294002で併用 処理し,RXRα,ERK, Aktのリン酸化と,RARβの発現をwestern blot法にて検討した。さらに,同条件 下におけるRARβ,p21CIP1,cyclin D1 mRNAの発現をリアルタイムPCR法で,apoptosisの誘導をTUN EL法およびCaspase-3活性測定法で,RXREの転写活性をluciferase reporter assayでそれぞれ検討した。 【結果】 まず始めに,ヒト肝癌細胞株HLFとヒト正常肝細胞株Hcを,ACRとLY294002でそれぞれ単独ある いは併用処理し,細胞増殖抑制に及ぼす影響を検討したところ,ACRおよびLY294002の単独処理は, Hc細胞と比較し,HLF細胞の増殖をより低い濃度で抑制すること,またこの抑制効果は,両剤の併用処 理によって相乗的に増強することが明らかになった。ACRとLY294002の併用は，Huh7およびHep3 B細胞に対しても強い増殖抑制効果を示した。また，HLF細胞の増殖は，ACRとBKM120の併用に よっても相乗的に抑制された。次に，HLF細胞を1μM ACR（IC15値）と5μM LY294002（IC25値） で併用処理したところ,相乗的なapoptosisの誘導が認められた。また同条件下のHLF細胞において,A CRとLY294002の併用は,RXRα,ERK, Aktのリン酸化を抑制し,RXRE promoterの転写活性を上昇さ せ,RARβ蛋白,RARβ mRNA,p21CIP1 mRNAの発現を増強させるとともに,cyclin D1 mRNAの発 現を低下させた。
【考察】
肝癌は近年の診断法や治療法の発展にも関わらず，未だ予後不良な癌の一つである。したがって，
有効な肝発癌予防法および治療法の開発は緊急の課題であり，ACRをkey agentとした「併用化学肝
乗的肝癌細胞増殖抑制の機序として，以下の仮説が考えられる。まずACRは，ERKやAktのリン酸 化抑制を介してRXRαのリン酸化を阻害し，その核内受容体としての機能を回復させるとともに， ACR自体がRXRαのリガンドとして作用することでRXRE promoterの転写活性を上昇させ，下流に あるRARβ，p21CIP1,cyclin D1をはじめとする標的遺伝子の発現を制御する。さらにLY294002は， PI3K/Aktシグナルを抑制することでRXRαのリン酸化を阻害し，functionalな非リン酸化RXRαを増 加させる。これらの結果，apoptosisの相乗的な誘導が起こり，肝癌細胞の増殖が強く抑制されるも のと考えられた。なお，今回相乗効果が確認されたACR（1μM）およびLY294002（5μM）の濃度 設定が，これまで行われてきた臨床試験の結果と解離していないことを特記する。 【結論】 ACRとLY294002の併用は，Ras/MAPKとPI3K/Aktシグナルの抑制を介して共同的にRXRαのリン 酸化を阻害し，最終的にはRXREの標的遺伝子の発現を制御することで，肝癌細胞に対して相乗的 なapoptosisの誘導効果と増殖抑制効果を発揮した。本研究結果は，ACRとLY294002の併用が「併用 化学肝発癌予防」を実践する上で，有効なregimenの一つであることを期待させるとともに，ACR を用いた（併用化学）肝発癌予防において，リン酸化RXRαが重要な標的分子である可能性をあら ためて示唆するものであり，今後，肝癌に対する新規化学肝発癌予防法（薬）の開発を進めていく 上で，意義深い研究結果であると考えられた。 BMC Cancer 13, 465 (2013).
