ミカンキジラミ体内でのカンキツグリーニング病原細菌の増殖と媒介特性

を定量する手法を確立し，幼虫と成虫という異なる発育 段階のミカンキジラミが感染樹上で獲得吸汁した場合， 病原細菌の保持と増殖，そして媒介の効率が異なること 等を明らかにした（INOUEet al., 2009）。本稿では，その 概要を紹介する。 I リアルタイム PCR による保毒虫体内の 病原細菌の定量 ミカンキジラミの保毒検定は，病原細菌に特異的なプ ライマーを使用した PCR による遺伝子断片の増幅とそ のアガロースゲル電気泳動によって行われる。その際， 保毒虫個体によって病原細菌の遺伝子断片を示すバンド の濃さが異なることから，保毒虫の保毒状況は一様では ないことが容易に想像されたが，これらを定量し，病原 細菌濃度として数値化する技術はなかった。 遺伝子断片の定量法として，リアルタイム PCR 法が 遺伝子を扱うほとんどすべての研究分野で急速に普及し ており，様々な検出原理に基づく機器が発売されてい る。筆者らは，蛍光標識された TaqMan プローブと専 用設計プライマーを用いる TaqMan PCR 法（使用機器 はアプライドバイオシステムズ ABI PRISM 7700）でミ カンキジラミ保毒虫の病原細菌濃度の定量解析を試み た。これは，標的遺伝子の増幅反応に伴う蛍光発光の強 度をリアルタイム測定し，標的遺伝子濃度が既知の標準 試料群との比較（検量線を作成する）によって，濃度未 知サンプル中の標的遺伝子量を高精度に推定するもので ある。筆者らは，病原細菌の定量検出に当たり，その既 知遺伝子 tuf B の塩基配列データ（OKUDAet al., 2005）を もとにプライマーとプローブを設計し，保毒虫から抽出 した DNA の一定量中に含まれる本遺伝子領域のコピー 数を計数した。保毒虫からの DNA 抽出には市販キット （キアゲン DNeasy Blood & Tissue Kit）を使用したが，

DNA 抽出効率はサンプルごとに異なることが予想され， 病原細菌遺伝子のみの絶対定量ではこの影響を強く受け るおそれがある。そこで，相対定量のための内部標準と して同一サンプル中のミカンキジラミ既知遺伝子 wing-less（THAOet al., 2000）についても定量し，病原細菌遺 伝子コピー数をミカンキジラミ遺伝子コピー数で除する ことで，病原細菌濃度とした（INOUEet al., 2009）。なお， は じ め に カンキツグリーニング病は，アジア地域と米国大陸の 熱帯∼亜熱帯気候域，そしてアフリカ大陸中南部で猛威 を振るうカンキツ類の重要かつ深刻な病害である。本病 の病原体は Candidatus Liberibacter 属の篩 し 部局在性細菌 類で，日本の南西諸島を含むアジア地域と米国大陸（一 部）における病原細菌は Candidatus Liberibacter asiati-cus とされ，これはミカンキジラミ Diaphorina citri（半 翅目：キジラミ科）によって媒介される。 ミカンキジラミは感染樹上で篩管液を吸汁する際に病 原細菌を体内に取り込んで保毒虫となり，次に保毒虫が 健全樹上で吸汁する際に，病原細菌が唾液とともに吐き 出されて伝染すると考えられているが，虫媒伝染様式に は不明な点が多い。この虫媒伝染上の特性に関しては， ミカンキジラミを感染樹上で獲得吸汁させた後に指標植 物に接種して 3 ∼ 10 か月後にその病徴を観察するとい う古典的手法で調べられたことがあり，成虫と 4 ∼ 5 齢 幼虫が保毒可能であること，いったん保毒した後の成虫 は生涯にわたって媒介能力を保持すること，潜伏期間は 成虫期に獲得吸汁した場合よりも幼虫期に獲得吸汁した 場合のほうが短いこと，次世代への経卵（垂直）伝染は しないこと等が報告されている（CAPOORet al., 1974 ; XU et al., 1988）。しかし葉の黄斑などの病徴は，微量要素 欠乏による生理障害などの症状と区別が困難（BO VÉ, 2006）であるため，媒介虫の保毒や植物の感染を確認す るに当たっては，PCR 法やリアルタイム PCR 法などの 高精度な分子生物学的手法による病原細菌（の遺伝子） そのものの検出・診断が不可欠である。また，保毒虫の 超薄切片の透過型電子顕微鏡観察によって，本病の病原 体とおぼしき “バクテリア様微生物” が中腸細胞と唾液 腺の外層細胞で多数観察されたことから（XU et al., 1988），病原細菌はそれらの組織で増殖すると考えられ ているが，増殖の具体的証拠は示されていない。 筆者らは，ミカンキジラミ保毒虫体内の病原細菌濃度 ミカンキジラミ体内でのカンキツグリーニング病原細菌の増殖と媒介特性 499 ―― 31 ―― Multiplication and Transmission of Candidatus Liberibacter asiaticus in and by Diaphorina citri. By Hiromitsu INOUE

（キーワード：ミカンキジラミ，カンキツグリーニング病原細菌， 定量 PCR，病原細菌濃度，増殖，虫媒伝染）

ミカンキジラミ体内での

カンキツグリーニング病原細菌の増殖と媒介特性

井

上

広

光

移し（図― 1 A），幼虫期に獲得された病原細菌は，長期 にわたって，より安定的に虫体内に保持される傾向が見 られた。 2 病原細菌濃度 II 章 1 節の保毒虫率調査で PCR 陽性だったサンプル について，リアルタイム PCR で病原細菌濃度を調べた ところ，幼虫獲得条件では羽化後 10 日目以降に獲得直 後の数百倍の濃度まで有意に増大した（図― 2 A）。これ は，虫体内での病原細菌の増殖を裏付ける，初めての分 子生物学的証拠である。一方，成虫獲得条件では，獲得 直後から調査期間中に病原細菌濃度が有意に増大するこ とはなかった（図― 2 B）。 3 虫媒伝染 異なる発育段階で病原細菌を獲得したミカンキジラミ 成虫の媒介能力を調査するために，5 齢幼虫と成虫に感 染樹上で 24 時間獲得吸汁させた後，健全カンキツ実生 苗上で 12 日間飼育した成虫を，検定植物としての健全 ユズ実生苗 1 株に 3 個体ずつ 30 日間接種した。接種終 了から約 3 か月後に検定植物の中位葉主脈から抽出した DNA について，通常の PCR 法で感染を確認したところ， 幼虫獲得条件の成虫を接種した株は高率（67％）で感染 したが，成虫獲得条件の成虫では感染が成立しなかった （表― 1）。また，接種が終了した供試虫の病原細菌濃度 を調べたところ，感染が成立した株に接種していた供試 虫は，感染が成立しなかった株に接種した供試虫よりも 病原細菌濃度が圧倒的に高く（表― 1），体内で病原細菌 が顕著に増殖した個体は媒介リスクが高いことが示唆さ れた。なお，PCR で陽性反応を示す保毒虫が必ずしも 媒介能力をもつわけではないこと（非媒介性保毒虫の存 本稿では詳細データを省くが，筆者らの定量 PCR アッ セイは鋳型 DNA 溶液 5μl 中の病原細菌 tuf B 遺伝子が 10 コピー以上であれば安定して検出でき，通常の PCR よりも病原細菌の検出感度が高かった。これによって， これまでのような通常の PCR 法による陽性/陰性の二者 択一的な保毒虫率調査だけでなく，キジラミ個体間の保 毒状況の量的比較が可能となった。 II ミカンキジラミの発育段階と病原細菌の 保毒・増殖・媒介特性 1 保毒虫率 異なる発育段階で病原細菌を獲得したミカンキジラミ の保毒状況の経時変化を調べるため，国内産の 5 齢（終 齢）幼虫と成虫（羽化後約 10 日間経過）をカンキツグ リーニング病に感染したラフレモン樹（沖縄県石垣島産 感染穂木による接ぎ木で感染）上で 24 時間獲得吸汁さ せた後，健全カンキツ実生苗上に移した。成虫について は，獲得吸汁直後，そして 5，10，15，20 日後にそれぞ れ一定個体数回収した。幼虫は羽化までに数日間のばら つきがあるため，獲得吸汁直後のほか，羽化日を起点と して 0，5，10，15，20 日目に一定数回収した。回収し た供試虫は個体ごとに全 DNA を抽出し，病原細菌の 16S rDNA 遺伝子に特異的なプライマー対（OI1/OI2c， JAGOUEIXet al., 1994）を使用した PCR 法によって検定し たところ，成虫獲得条件では獲得直後には 90％近かっ た保毒虫率（PCR 陽性虫率）が 10 日目以降に 50％程度 まで大きく低下し，多くの保毒虫で消化管中の病原細菌 が排出されて陰性となったことが示唆された（図― 1 B）。 一方，幼虫獲得条件では期間を通して保毒虫率が高く推 植 物 防 疫  第 63 巻 第 8 号 （2009 年） 500 ―― 32 ―― 100 75 50 25 0 保 毒 虫 率 ︵ ％ ︶ （ A ） 幼虫期に感染樹上で獲得吸汁 （ B ） 成虫期に感染樹上で獲得吸汁 獲得 吸汁 直後 獲得 吸汁 直後 0 5 10 15 20 5 10 15 20 経過日数（羽化日を起点とする） 経過日数 図 −1 ミカンキジラミがカンキツグリーニング病感染樹上で 24 時間獲得吸汁した後の保毒虫率 （ A ）5 齢幼虫期，（ B ）成虫期に獲得吸汁後，健全カンキツ樹上で飼育．ミカンキジラミ個体

から抽出した全 DNA について，病原細菌 16S rDNA に特異的なプライマー対（OI1/OI2c） を使用した通常の PCR 法で検定．各サンプリング時間当たりの調査個体数は 13 ∼ 25 個体． INOUEet al.（2009）より作図．

ミ個体群についても，現時点で成虫獲得条件では媒介し ないと断じることはできない。しかし，病原細菌を獲得 したミカンキジラミの発育段階によって，虫体内での病 原細菌の保持と増殖，媒介の効率が大きく異なることは 確言できるだろう。 媒介性保毒虫と非媒介性保毒虫では，病原細菌濃度だ けではなくその局在部位が異なることが予想される。具 体的には，病原細菌が唾液腺中に存在し，かつ吐き出し 可能な状態にあるか否かが媒介性の有無を決定するはず である。病原体が媒介虫体内で循環・増殖する虫媒伝染 性植物病害については，ウイルス病に関する研究が進展 著しい。なかでも，成虫期より幼虫期で病原ウイルスの 獲得・媒介能力が高い例として，ムギミドリアブラムシ とオオムギ黄萎ウイルス（BYDV），ツマグロヨコバイ とイネ黄葉ウイルス（RTYV）のように，アブラムシ類 や ウ ン カ ・ ヨ コ バ イ 類 で 極 め て 多 数 の 報 告 が あ る （SYLVESTER, 1980 ; NAULTand AMMAR, 1989）。より厳密な媒 介特性として，各種アザミウマ類とトマト黄化えそウイ ルス（TSWV）などのトスポウイルス類では，幼虫期に 病原体を獲得した成虫は媒介性をもつが，成虫期に初め て獲得された病原体は中腸障壁（midgut barrier）を越 えて体内に侵入せず，この場合の成虫は媒介性をもつこ とはない（GERMANet al., 1992）。この虫媒伝染様式を参 考にして，ミカンキジラミ体内での病原細菌の動態を 図―   3 のように推定してみた。ここでは，幼虫獲得条件 で病原細菌が消化管→血体腔→唾液腺の間で 2 段階の障 在）が初めて示された。 III 病原細菌の動態と防除の指針 前章までに述べた結果は，「成虫期における 24 時間の 獲得吸汁で永続的に媒介する」とした CA P O O R et al. （1974）の報告に必ずしも沿うものではなかった。この 不一致の原因として，虫媒伝染現象の確認手法の相違 （病原細菌そのものを検出するか否か）も考えられるが， 実験に使用した感染樹（病原細菌）やミカンキジラミの 起源と系統，あるいは病原性や媒介性の違い等に起因す る可能性もあり，これは今後解明すべき重要課題であ る。筆者らが使用した日本産の病原細菌とミカンキジラ ミカンキジラミ体内でのカンキツグリーニング病原細菌の増殖と媒介特性 501 ―― 33 ―― （ A ） 幼虫期に感染樹上で獲得吸汁 病 原 細 菌 濃 度 1,000 100 10 1 0.1 0.01 獲得 吸汁 直後 0 5 10 15 20 経過日数（羽化日を起点とする） ＊＊ ＊＊ ＊＊ （ B ） 成虫期に感染樹上で獲得吸汁 獲得 吸汁 直後 5 10 15 20 経過日数 ＊＊ ＊＊ 図 −2 ミカンキジラミがカンキツグリーニング病感染樹上で 24 時間獲得吸汁した後の保毒虫の病 原細菌濃度（病原細菌 tuf B 遺伝子コピー数× 1,000/ミカンキジラミ wingless 遺伝子コピー数） （ A ）5 齢幼虫期，（ B ）成虫期に獲得吸汁後，健全カンキツ樹上で飼育．各サンプリング時間 に回収したミカンキジラミ個体のうち，通常の PCR 検定で病原細菌陽性であったサンプルに ついて，リアルタイム PCR 法（アプライドバイオシステムズ ABI PRISM 7700）により病原 細菌濃度を解析．垂線は標準誤差（n ＝ 10 ∼ 22）．＊＊：獲得吸汁直後との間に有意差あり （Mann ― Whitney U 検定，p ＜ 0.01）．INOUEet al.（2009）より改変．

表 −1 ミカンキジラミのカンキツグリーニング病原細菌保毒虫 による健全カンキツへの虫媒伝染結果a） 獲得吸汁した 発育段階 感染株数/ 接種株数 接種虫の病原細菌濃度b）_（n） 感染成立株 5 齢幼虫 成虫 4/6 0/5 1,864（5） ― a）_{5 齢幼虫と成虫に感染樹上で 24 時間獲得吸汁させ，健全カ} ンキツ樹上で 12 日間飼育した後，健全ユズ実生苗 1 株当たり成 虫 3 個体ずつを 30 日間接種．接種終了から約 3 か月後に試験植 物を PCR 法で検定．b）_{病原細菌 tuf B 遺伝子コピー数× 1,000/ミ} カンキジラミ wingless 遺伝子コピー数．接種終了後の供試虫につ いて，感染が成立した株と成立しなかった株に分けて，リアルタ イム PCR 法で解析．INOUEet al.（2009）より改変．

感染非成立株 99（4） 30（8）

大略は見えてきた感がある。現在筆者らは，虫媒伝染リ スク評価に必要な個体媒介効率，そして成虫獲得条件で の虫媒伝染の有無やその確率についても精力的に調査を 行っているところである。今後さらに，媒介性保毒虫と 非媒介性保毒虫の体内における病原細菌の局在様式を高 精度に特定し，確度の高い病原細菌の動態および虫媒伝 染モデルを構築することで，科学的裏付けを伴った効率 的・効果的な保毒虫防除技術の開発を目指している。 引 用 文 献 1）BOVÉ, J. M.（2006）: J. Plant Pathol. 88 : 7 ∼ 37.

2）CAPOOR, S. P. et al.（1974）: Proc. 6th Conf. Int. Org. Citrus Virol. :

43 ∼ 49.

3）GERMAN, T. L. et al.（1992）: Annu. Rev. Phytopathol. 30 : 315 ∼

348.

4）INOUE, H. et al.（2009）: Ann. Appl. Biol. 155 :（in press）.

5）JAGOUEIX, S. et al.（1994）: Int. J. Syst. Bacteriol. 44 : 379 ∼ 386. 6）NAULT, L. R. and E. D. AMMAR（1989）: Annu. Rev. Entomol. 34 :

503 ∼ 529.

7）OKUDA, M. et al.（2005）: Plant Dis. 89 : 705 ∼ 711.

8）SYLVESTER, E. S.（1980）: Annu. Rev. Entomol. 25 : 257 ∼ 286. 9）THAO, M. L. et al.（2000）: Appl. Environ. Microbiol. 66 : 2898 ∼

2905.

10）XU, C. F. et al.（1988）: Proc. 10th Conf. Int. Org. Citrus Virol. :

243 ∼ 248. 壁を突破することを想定したが，幼虫獲得条件でもすべ ての個体が高濃度に保毒して媒介するわけではないとい うこれまでの試験結果に鑑みても，この動態モデルが例 外なく適用できるわけではない。図― 3 のような病原細 菌の動態モデルに沿った虫媒伝染が高い確率で起こると 考えて，これを病害発生地での保毒虫発生調査と防除対 策に取り入れるならば，①成虫が感染樹上に 24 時間程 度の短時間滞在・吸汁して保毒した場合は，たとえ PCR 陽性であっても媒介性保毒虫となる可能性は低い が，②幼虫期に感染樹上で発育・獲得吸汁した場合は，羽 化成虫が媒介リスクの高い保毒虫になると考えられるた め，③虫媒伝染による病害の分布拡大を効率的・効果的 に防ぐためには，感染樹上の幼虫の防除が肝要であろう。 お わ り に 高精度な分子生物学的手法を取り入れた，本病の虫媒 伝染に関する本格的な研究はまだ始まったばかりであ る。しかし，これまで「ブラックボックス」同然であっ た虫媒伝染現象の，特にミカンキジラミ体内での病原細 菌の動態に関して，全容解明にはまだほど遠いものの， 植 物 防 疫  第 63 巻 第 8 号 （2009 年） 502 ―― 34 ―― （ A ） 幼虫期に獲得吸汁 （ B ） 成虫期に獲得吸汁 ① ④ ⑤ ② ③ 病原細菌 消化管 消化管 唾液腺 図 −3 ミカンキジラミ体内でのカンキツグリーニング病原細菌の動態（仮説） （ A ）幼虫期に獲得吸汁した場合．①消化管内に保毒し，病原細菌が体内 （血体腔）に侵入する．②羽化を挟んで，病原細菌が血体腔から唾液腺へ移 行し，消化管内の病原細菌は排出される．③病原細菌が唾液腺で増殖し， 唾液とともに植物内に吐き出されて伝染する．（ B ）成虫期に獲得吸汁した 場合．④消化管内に保毒する．⑤消化管内の病原細菌の多くは排出され， 体内（血体腔・唾液腺）に移行せず，媒介しない．