差釜待司雨 i 論

(1)

活性化

‑微生物と生体防御系との関わり−

ＭｌＦ

qb唾ＰＱ団ｐ

￨ＦＮ−Ｙ

カタラー￨之陰２H２０＋Ｏ

2Ｈ2０２

ロ■■０旬．

Ｑ

微生物の除去

イン産生サイトカ

生体防御系の発達

Ｔ

佐々木巧

ＡＰＣ

し丑 I 今 I

亀

(2)

(3)

２１

１５２３５５５６６７７１１１１１１１１１

2２

２４

要旨

第Ｉ章緒言

第Ⅱ章酵母および枯草菌におけるカタラーゼ合成誘導機構の解析

第 Ⅱ 章 − １序論第 Ⅱ 章 ‑ ２材料と方法

Ⅱ−２−１．酵母の培養及び集菌

Ⅱ‑2‑2．酵母の好気的インキュベーション

Ⅱ−２−３．枯草菌の培養及び集菌

Ⅱ−２−４．Ｈ２Ｏ２の存在下でのインキユベーシヨン

Ⅱ‑2‑5．酵母及び枯草菌の細胞抽出液の調製

Ⅱ−２−６カタラーゼ活性の測定第 Ⅱ 章 − ３結果

Ⅱ−３−１酵母のカタラーゼ合成に及ぼす培地中のグルコースの影響

Ⅱ−３−２好気的インキュペーションによる酵母のカタラーゼ合成誘導

Ⅱ−３−３酵母のカタラーゼ合成誘導に及ぼすタンパク質合成阻害剤の影響

Ⅱ−３−４酵母のカタラーゼ合成誘導における酸素の役割

Ⅱ−３−５枯草菌におけるカタラーゼ合成に及ぼすグルコースの影響

Ⅱ−３−６枯草菌における外部からのＨ２Ｏ２添加によるカタラーゼ合成誘導

Ⅱ−３−７枯草菌におけるカタラーゼ合成誘導に及ぼすタンパク質合成阻害剤及びＲＮＡ合成阻害剤の影響

第 Ⅲ 章 − １序論

１８

及びその生物活性の解析

１８

１９

２０２０

３０３１

Ⅱ−４−１酵母におけるカタラーゼ合成誘導機構の解析

Ⅱ−４２枯草菌におけるカタラーゼ合成誘導機構の解析

第Ⅲ章モルモットT細胞活性化マクロフアージ因子（TAM）の精製

第 Ⅱ 章 ‑ 4 ．考察６７８２２２

(4)

第 Ⅲ 章 − ３結果

Ⅲ−３−１ＴＡＭの精製

Ⅲ−３−２ＴＡＭの生物活性及びIL戸1との異同第 Ⅲ 章 − ４．考察

第Ⅲ章−２材料と方法３３

Ⅲ−２−１実験動物

Ⅲ‑２−２試薬及び培地

Ⅲ−２−３ＭＤＰ刺激マクロファージ培養上清の調製

Ⅲ−２−４培養上清のゲル漁過

Ⅲ−２−５プロキオンレッドアガロースによる分画

Ⅲ−２−６血清成分の免疫吸着

Ⅲ−２−７陰イオン交換クロマトグラフィー

Ⅲ−２−８疎水クロマトグラフィー

Ⅲ−２−９胸腺細胞アッセイ

Ⅲ‑2‑10リンパ節細胞の調製

Ⅲ‑2‑11ＴＡＭの生物活性の測定

Ⅲ‑2‑12ポリアクリルアミドケル電気泳動及びEAMのゲルからの抽出

3３

３３４３３３

３５

３６

3７

3８

９００４６３４４４４

２２３３３５５５５５

Ⅳ−２−１細菌性スーパー抗原

Ⅳ‑2‑2動物及びコラーゲン誘導関節炎の発症

Ⅳ−２−３SEBの投与

Ⅳ−２−４Ｔ細胞増殖応答の測定

４９

Ⅲ−４−１ＴＡＭの精製及びIし1との異同

Ⅲ−４−２ＴＡＭの生体防御機構における意義

４６

４７

第Ⅳ章スーパー抗原と免疫応答第 Ⅳ 章 − １序論

第Ⅳ章−２材料と方法

5０

(5)

7９

５５６６５５５５

5７

第 Ⅲ 章 − ３結果 6０

8１８３

Ⅳ−３−１ＤＢＡ/1マウスにおけるSEBによるトレランスの誘導

Ⅳ−３−２ＳＥB投与後のトレランスの機序の解析

Ⅳ−３−３ＳＥB投与マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制

Ⅳ−３−４SEBの経口投与によるトレランスの誘導

Ⅳ−３−５SEBの経口投与によるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制と症状軽減及びその機序の解析

６０６２

6５６８

7２

第 Ⅲ 章 − ４考察

Ⅳ‑4‑1DBA/1マウスにおけるSEBによるトレランスの誘導及びその機序の解析

Ⅳ−４２ＳＥB投与マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制及び機序の解析

Ⅳ−４−３SEBの経口投与によるトレランスの誘導

Ⅳ‑4‑4SEBの経口投与によるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制と症状軽減及びその機序の解析

第Ｖ章総括

Ⅳ−２−５F1owcytometryによる解析

Ⅳ−２−６抗ＣⅡ‑IgG抗体の測定

Ⅳ−２−７サイトカイン産生の測定

Ⅳ−２−８ＲＮＡの抽出

Ⅳ‑2‑9．ポリメラーゼチェーン反応（polymerasechain reaction）によるサイトカインＤＮＡの増幅

9８７９

8４８９

第 Ⅵ 章引用文献第 Ⅶ 章参考図謝辞

１１０

１１４

(6)

要

１

E三コ

目；

(7)

要 ^一^日

脊椎動物は自己の恒常性を保つために、微生物の侵入に対してさまざまな生体防御系を張り巡らせている。一方、微生物も宿主の防御反応に対抗して生き延びるための生体防御系を有している。本研究では、微生物と宿主の防御反応の攻防に焦点を当てて、両者の生体防御系がどのように関わっていくかについて考察を試みた。

［第Ⅱ章］宿主生物はマクロファージによる過酸化水素等の殺菌物質を放出して、侵入した微生物に対する非特異的な防御反応を行う。これに対抗して微生物はそれを分解する防御反応を有すると考えられている。そこで、著者は酵母と枯草菌におけるカタラーゼ合成の誘導に着目し、その役割について解析した。その結果、酵母においては酸素呼吸の高揚によってカタラーゼ合成が誘導されること、枯草菌では外部からの5〜500,Ｍの過酸化水素の添加によりカタラーゼ合成が誘導されることを明らかにした。この機構が、侵入微生物を貧食したマクロファージからの過酸化水素などの殺菌物質の放出に対する微生物の防御機構の一つであると考えられる。

［第Ⅲ章］微生物のこのような防御機構に対抗するために、宿主は特異的な生体防御系である免疫応答を惹起させる。そのきっかけをつくるのは、マクロファージ等の抗原提示細胞による抗原の提示である。細胞表面に提示されたこの抗原は抗原特異的な受容体を持っているT細胞に認識される。これと同時にこのT細胞の活性化に重要な役割を果たすのがT細胞活性化因子(サイトカイン)である。例えば、ヒトやマウスではマクロファージからT細胞活性化に必要

２

(8)

なサイトカインとしてインターロイキン−１(interleukin‑1、し1と略す)が産生される。本章では、これまでIE1が見い出されていなかったモルモットから T細胞活性化マクロファージ因子(rceuactivatingmonokine，ＴＡＭと略す)を単離精製し、その働きを解析しようと試みた。そして、著者はモルモットの TAMをヒトやマウスのIE1より大きい分子量を持つ分子として単離し、この分子がT細胞に作用して免疫反応を高めるマクロファージ遊走阻止因子の産生を刺激することを明らかにした。このことは、モルモットではTAMがヒトやマウスのIE1の代わりとして初期の免疫応答を誘発する際に重要な役割を果たして

いることを示している。

［第Ⅳ章］ある種の細菌が産生する毒素は、この免疫応答惹起過程とは無関係にＴ細胞に認識され、Ｔ細胞を活性化したのち免疫学的寛容(トレランス)を誘導して、特異的免疫応答を抑えることが知られている。これらの毒素は細菌性スーパー抗原と呼ばれている。細菌性スーパー抗原は、マクロファージ表面の主要組織適合遺伝子複合体産物クラスⅡ分子と特定のＴ細胞抗原受容体のβ鎖

に結合することを特徴とする。

この細菌性スーパー抗原と免疫系との関わりについて解析するために、黄色ブドウ球菌の腸管内毒素Ｂ(staphylococcalenterotoxinB、ＳＥＢと略す)を使用して、ヒトの慢性関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎を発症するDBA/1マウスにおけるトレランス誘導の機構、疾患との関わりについて検討を行った。このマウスではSEBを静脈内投与することにより、ＳＥB応答性の

Vl38TCR‑T細胞の部分的なクローンの除去と応答性の低下(アナジー)に起因す

るトレランスが誘導された。トレランスが誘導されたマウスでは、コラーケン誘導関節炎の発症がSEB非投与マウスに比べて約80％抑制された。これにとも

３

(9)

ない、自己抗原であるⅡ型コラーゲンに対するＴ細胞の増殖応答はSEB投与マウスでは約60％低下しており、自己抗体である抗Ⅱ型コラーゲンーIgG抗体の産生は20〜30％程度低下していることが判明した。

次に、SEBが食中毒を起こすことに着目して、ＳＥＢに対する同様の免疫応答がSEBを経口投与した場合にも認められるかどうか検討した。その結果、ＳＥＢを２週間以上連続して経口投与した場合、トレランスが成立すること、トレランスの成立したマウスではコラーゲン誘導関節炎の発症が約70％抑制され、さらに発症初期にSEBを約90日間連続して経口投与した場合、症状が軽減されることが判明した。このトレランス誘導には、部分的なSEB応答性のVl38TCR‑

T細胞クローンの除去と応答性の低下に加えて、低域経口トレランスの機序の一つであるＴＨ１型サイトカイン産生プロフィールからＴＨ２型サイトカイン産生プロフィールへの移行による積極的抑制も関与していることが示された。また一方では、同じ系統のマウスでSEBの大量投与によるコラーゲン誘導関節炎の発症が報告されている。

以上の事実から、宿主である脊椎動物は細菌性スーパー抗原に対して、まず急激なT細胞の活性化によって病的な状態に陥るという宿主にとってマイナスの免疫応答を示すが、やがてT細胞にトレランスを誘導し、病的状態から回復するというプラスの免疫応答へと転じるものと考えられる。このことは脊椎動物が免疫応答を逃れた細菌の産生する毒素に対して、巧妙に免疫応答を調節す

ることによって、生体を維持するシステムを獲得したことを示唆している。

４

(10)

一一口

５

第１章緒

(11)

一一一口

生体はその恒常性を保つ機構の一つとして生体防御系を有している。脊椎動物において生体防御系に関わる細胞群は白血球である。白血球は細胞内に多様な形態の核と穎粒を持ち非特異的な生体防御反応を担う多形核白血球(あるいは穎粒球)、そして単一の球状の核を持ち、非特異的な防御反応及び特異的な生体防御反応に関与する単核球から構成されている(1)。

多形核白血球による防御反応は、侵入してきた異種生物の種類に関わりなく非特異的に作用するので、微生物感染の初期に機能する生体防御機構である。

単核球は非特異的な生体防御反応を行う単球と、特異的な生体防御機構である免疫系の主役を果たすリンパ球からなる。まず単球は、血管内を流れているときは不活性な状態であるが、出血などによって血管外に出るとマクロファージとなり大食作用によって生体に侵入した微生物を殺そうとする(２，３)。

リンパ球は骨髄由来で胸腺(thymus)で分化するＴリンパ球(T細胞)と鳥類ではファブリキウス嚢(bursaofFabricius)、ほ乳類では骨髄(bonemarrow)由来で、胎児の肝臓へ移行してそこで分化するＢリンパ球(B細胞)に大別される(参考図l)。

ところで、細菌を取り込み消化したマクロファージ等の抗原提示細胞はその構成タンパク質を分解し、９〜10数個のアミノ酸からなるペプチドにしてその細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体(majorhistocompatibilitycomplex、

ＭＨＣと略す)産物のクラスＩ分子及びⅡ分子に結合した形で、その細胞表面に抗原特異的な受容体(Tcellantigenreceptor、TCRと略す)を持つT細胞に向けて提示する(4)。マクロファージ表面上に提示されたペプチドを抗原ペプチド

６

緒

(12)

といい、この現象を抗原提示という。ＭＨＣ分子は移植抗原とも呼ばれ、各個体間で分子内の特定の領域でアミノ酸配列が微妙に異なり多様性を作り出していて(4)、自己と非自己を区別する重要な抗原である。ＭＨＣ分子にはほとんど全ての細胞に発現されているクラスＩ抗原(俗に移植抗原という)、マクロファージのような抗原を提示する細胞に発現されているクラスⅡ抗原、補体の構成タンパク質であるクラスⅢ抗原が存在している(参考図2)。

Ｔ細胞は多方面に渡って免疫応答を制御している。その表面上のTCRには、

αβ型とγ６型が存在し、それぞれα鎖とβ鎖、γ鎖と６鎖がヘテロダイマーを形成している(５，６)。これらはそれぞれ可変(variable，Ｖと略す)領域、定常 (constant，Ｃと略す)領域及びこれらの間にある多様性(diversity、Ｄと略す)領域と接合(joint，Ｊと略す)領域からなるドメイン構造をしている。またＶ、Ｄ、Ｊ領域をコードする遺伝子群にはいくつかのエクソンが存在し、各T細胞クローンはその中からただ一つのエクソンのみ選んで使用している(6)。Ｖ領域で抗原を認識するので、Ｖ領域に使用されたエクソンが異なるとそのT細胞の抗原に対する特異性も異なることになる(参考図3)。

ところで、抗原提示を受けた抗原特異的なT細胞は活性化され、特異的免疫応答が惹起される。その際にマクロファージは可溶性のシグナル伝達物質、インターロイキンーｌ(IE1)を産生(7)し、抗原提示を受けたT細胞を活性化する。

そして抗原提示とIE1の刺激を受けたT細胞はT細胞増殖因子であるインターロイキンー２(interleukin‑2、IE2と略す)を産生し、Ｔ細胞を活性化し分裂増殖を促す(８，９)。こうして抗原特異的なT細胞はそのクローンを拡大し、抗原除去へ向けて準備段階に入る。その準備段階でT細胞はインターロイキンー４(inter‑

leukin‑4、ＩＥ４と略す)やインターロイキンー５，６，１０，１３(interleukin‑5、

７

(13)

６，１０，１３、それぞれ'し５，６，１０，１３と略す)を産生して抗体産生を促進したり(10,11)、インターロイキンー12,15(interleukin‑12、１５、それぞれ11‑戸１２，１５と略す)、インターフェロン‑Y(interferon‑Y、IFN‑Yと略す)あるいは腫傷壊死因子−β(tumornecrosisfactor‑β、ＴＮＦβと略す)を産生して、マクロフアージやナチュラルキラー細胞(naturalkiUer，ＮＫと略す)あるいは細胞障害性T細胞を活性化し、細胞仲介性免疫応答を惹起したりする(９，１１)。

これらの過程の存在は、例えばIE4の受容体をコードする遺伝子が、リンパ球の細胞接着に関与している細胞質タンパク質lymphocytefunction‑

associatedantigen‑1をコードする遺伝子と連鎖しており、その発現が密接に関連し合っている事実(12,13)やIE4がリンパ球の容積を拡大し生存率を増大するという事実(１４，１５)などからも示唆される。ところでサイトカインによって活性化された細胞をエフェクター細胞といい、抗体をエフェクター分子という。エフェクター細胞やエフェクター分子は存在している抗原を除去し、

それ以上免疫応答が拡大し、生体に過剰な炎症を誘発するのを避けている。したがって、抗原が体内から除去されると免疫応答は終息する。生体には108個以上にも及ぶT細胞クローンが存在し、それぞれが多種多様な抗原に対応しており、それぞれの抗原ペプチドに対して上述のような免疫応答が起こるように免疫ネットワークが準備されている。

しかしながら、このような万全かと思われる免疫ネットワークの網にとらえられないような抗原が存在する、これらの抗原はスーパー抗原(superantigen）

と呼ばれている(16,17)。スーパー抗原には黄色ブドウ球菌の腸管内毒素のような細菌性スーパー抗原と、マウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスの遺伝子の３１末端側に存在しているlongterminalrepeat(ⅢR)領域にコード

８

(14)

される遺伝子産物で、Ｂ細胞表面に発現されているウイルス性スーパー抗原 (18)がある(参考図4)･

本研究では、今まで述べてきた背景をもとに、生体が微生物の侵入からいかにして自らを防御しようとするか、またその防御反応に対して微生物がいかに対応して生き延びていくかについて検討した｡まず免疫担当細胞の一つであるマクロファージと侵入微生物との攻防を侵入微生物側から解析した。続いて宿主側の次なる生体防御機構、特にマクロファージからのサイトカインの放出とそれに対するＴ細胞の応答及び特異的な免疫応答への移行について明らかにした。さらに特異的な免疫応答を回避して微生物側が宿主の体内で生き延びていく機構、それに対する宿主の防御反応との相互作用、最後に自己免疫疾患の発症と治癒との関わりについて検討した。これらの結果に基づき、微生物と宿主

との攻防に関して得られた知見を総括する。

［第Ⅱ章］では、酵母や枯草菌が細胞内で発生したＨ２Ｏ２や外部から加えられたＨ２○2に応答してカタラーゼを合成する機構を明らかにして、酸素毒性に対する防御機構がそのままマクロファージの攻撃に対する防御反応として機能

していることを論述する(19,20)。

このようにしてマクロファージの攻撃を逃れた微生物に対してT細胞による特異的な免疫応答が惹起される。その免疫応答はマクロファージから放出され

るサイトカインであるIL‑1によって開始される。その後T細胞は活性化され次々に反応を拡大し、侵入微生物を除去する遅延型過敏反応を起こしたり、Ｂ細胞と相互作用してＢ細胞を抗体産生細胞へと分化させ、産生された抗体によ

って侵入微生物は除去される。Ｌ'はマウスやヒトでは、分子量が約'7,000であるが、モルモットでは,し,そのものの存在は確認されていなかった。

９

(15)

［第Ⅲ章］では、モルモットにおけるIL1様因子であるT細胞活性化マクロファージ因子(Tcell‑activatingmonokine、ＴＡＭと略す)に着目し、マウスやヒトのIL‑1との異同について解析を進めた。まず、これまで確認されていなかったモルモットのTAMを単離精製した。そしてTAMがマウスやヒトのIE1

と異なる分子量を持ち、Ｔ細胞が抗原特異的に応答する際に必須のサイトカインであることを示した(21)。さらにT細胞を刺激してマクロファージを活性化するサイトカインであるマクロファージ遊走阻止因子の産生を促し、エフェクター細胞の分化に関与することを明らかにして、活性は同様でも分子量が異なるIE1が存在することを論述する。

［第Ⅳ章］では、免疫ネットワークを回避して作用するスーパー抗原と宿主の免疫応答との関わりについて明らかにするために、我々の周りに古来から存在してきた黄色ブドウ球菌、Staphyjococcusaul研eusが産生する細菌性スーパー抗原、staphylococcalenterotoxinB(SEB)を用いて免疫応答との関係について検討を行った。これまで細菌性スーパー抗原については特定のT細胞を活性化するだけでなく、抗原に遭遇したT細胞にトレランスを誘導することが知られており、これは２回目以降の同じ細菌性スーパー抗原の刺激に対して、宿主が過剰に応答して繰り返し病的状態に陥るのを防ぐ宿主側の防御機構であると考えられていた(17,18)。しかしながら、その詳細についてはあまり明らかにされていなかった。

本章では、細菌性スーパー抗原として黄色ブドウ球菌の腸管内毒素SEBを用いて、まずマウスにおけるトレランス誘導の機構について明らかにする。次にあらかじめトレランスを誘導しておくことで、コラーゲン誘導関節炎の発症が抑制されることを示す(22,23)。一方、SEBが腸管を通じて生体に病原性を発

１０

(16)

現することから、SEBをマウスに経口投与したときの生体の応答について検討した。その中で、病気を引き起こさない用量を経口投与した場合、ＳＥBに対するトレランスが誘導されること、そのトレランスにはSEBに対する応答性の低下が関与していること、さらに静脈内投与の場合と異なり、Ｔ細胞の作用を抑えるようなサイトカインが産生される積極的抑制も関与していることを明らかにする(24,25)。また、ＳＥＢに対するトレランスが誘導されたマウスではコラーゲン誘導関節炎の発症が抑制されること、一旦疾患を発症したマウスにSEB

を経口投与し続けることにより症状が軽減されることを示す。さらに、Ｓ・

aureusが食中毒だけでなく慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患の発症や症状軽減にも深く関わってきたことを論述し(25,26)、最後に、自己免疫疾患の誘発の機序(27)、腸管を介した疾患の治癒についてサイトカイン産生のレベルまで掘り下げ考察する。

１１

(17)

第Ⅱ章酵母および枯草菌における力タラーゼ合成誘導機構の解析

1２

(18)

第Ⅱ章−１．序論

マクロファージによる微生物や異物の貧食作用は、動物の持つ生体防御機構の中でも比較的原始的な機構で、生まれながらにして備わっている。実際には、血管内を流れる単球が出血などによって血管外に出るとマクロファージとなり大食作用によって細菌、真菌等の微生物あるいはその他の異物を食胞内に取り込み、活性酸素(02̲)、過酸化水素(H202)、酸化窒素化合物(NOXs)あるいは消化酵素などの殺菌物質を放出して細菌を殺そうとする(１，２，３)。この貧食作用により侵入した微生物の多くはその種類を問わず除去される。しかしながら、一部の微生物はマクロファージの攻撃から逃れるために殺菌物質を分解する酵素を合成してこれに対抗している(28,29)。例えば、活性酸素(○2‑)を分解する反応を触媒するスーパーオキシドジスムターゼや過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)を分解する反応を触媒するカタラーゼは、自分自身の代謝の結果生じたこれらの過酸化化合物を分解して生体を守っているだけでなく、微生物がマクロファージから放出される過酸化化合物の攻撃から身を守るためにも重要な役割を果たしていると考えられる。しかしながら、微生物において実際にカタラーゼ合成が誘導される機構についてはあまり明らかになっていない。

［第Ⅱ章］では、宿主の微生物に対する初期の防御反応に対する微生物側の防御反応ついて検討した。特に微生物として、動物の周辺に常在する真核生物の酵母と原核生物の枯草菌を取り上げ、生体が遺伝的に持っている機構としてのカタラーゼ合成の誘導について検討する。その中で特に酵母における酸素呼吸の冗進によるカタラーゼ合成の誘導、枯草菌における外部から加えたＨ２Ｏ２に対するカタラーゼ合成の誘導について明らかにする。また培地中に含まれる

１３

(19)

炭素源としてのグルコースの役割、タンパク質合成阻害剤の効果について明らかにして、カタラーゼ合成の誘導機構が、そのままマクロファージからのＨ２Ｏ２の放出という殺菌作用に対する防御機構の一つとして機能している可能性について考察する。

１４

(20)

第 Ⅱ 章 − ２．材料と方法

Ⅱ‑2‑1．酵母の培養及び葉菌

酵母、SaccharomyCescerwisjaeは広島大学理学部の日野教授より供与された。培地には１％酵母エキス、１％ポリペプトン、２％グルコースの水溶液 (ｐＨ6.0)を使用した。特に示した場合はグルコース濃度を変化させた。この培地に1％のアガーを加え高圧蒸気滅菌によりアガーを融解し、内径1.2ｃｍの試験管にその10ｍlを入れ傾けたまま固めた斜面培地にコロニーを播種したものを出発材料とした。斜面のコロニーから白金耳で菌体を三角フラスコに入った 10ｍlの培地に移植し、３０℃で一晩往復振握培養したものを前培養とした。前培養から菌液一滴を500,1用坂口フラスコに入れた100ｍlの培地に移植し、往復振鐙器中で30℃、振幅4ｃｍ，120回/分で18時間振鐙培養することによって酵母を培養した。細胞は10,000rpm，４℃で、５分間遠心して集め、２０，Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)で２回洗浄し、２％酵母エキスを含む同じ緩衝液に再浮遊させた。また、培養上清中のグルコースの濃度はNelson法によって測定した。

Ⅱ‑2‑2．酵母の好気的インキュベーション

酵母の浮遊液は30℃、往復振鐙器中で120回／分で好気的にインキュベートした。必要に応じてインキュベーション液中に窒素ガスを吹き込み嫌気的状態を作り出した。インキュベーション中の細胞の増殖は無視出来る程度であった。またタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(101』Ｍ)及びクロラムフェニコール(60鴫/ｍｌ)を必要に応じて加えた。

1５

(21)

Ⅱ‑2‑3．枯草菌の培養及び葉菌

枯草菌はBaciIlussubtiIislFO3025を使用した。まず、１％酵母エキス、１

％ポリペプトンに1％アガーを加えた培地で斜面培養を行い、これを原株として全ての枯草菌の培養に使用した。

培養は以下のように行った。斜面よりコロニーの一部を10ｍlの培地の入った三角フラスコに移植し、３０℃、一晩振握培養したものを前培養とした。前培養から500,1用坂口フラスコに入れた100ｍlの培地に菌液一滴を移植し、往復振糧器中で、３０℃、振幅4ｃｍ，120回／分で18時間培養した。培地には状況に応じて100,Ｍグルコースを加えた。培養後、細胞は酵母の場合と同様に遠心分離し、２０，Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)に浮遊させた。適当に希釈した浮遊液の 660nｍの吸光度を測定して細胞密度の指標とした。なお、○D660nmの1uint は枯草菌浮遊液の2.7xlO8細胞／ｍｌの細胞密度に相当した。

Ⅱ‑2‑4．Ｈ２０２の存在下でのインキユベーシヨン

100ｍlの三角フラスコに枯草菌細胞を2％の酵母エキスを含む10ｍlの20,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)に浮遊して、細胞密度が４ｘｌＯ９細胞/ｍｌになるように調整し、浮遊液は、往復振鐙器で30℃、振鐙速度120回／分で好気的にインキュベー卜した。Ｈ２Ｏ２の連続的な添加は、インキユベーシヨン中にＨ２０２をペリスタポンプ(アトー株式会社製、Ｓ､J,1220型)で、0.6ｍl/hずつ連続的に添加することで行った。また、インユベーションの間の細胞増殖は無視出来る程度であった。

1６

(22)

Ⅱ‑2‑5．酵母及び粘草菌の綱胞抽出綾の調製

培養後あるいはインキュベート後、菌液を4℃で10,000ｘ９，１０分間遠心して細胞を収穫した。得られた細胞のペレットを20,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)で洗浄した後、１０ｍlの同じ緩衝液に再浮遊した。酵素活性を測定するために、超音波細胞破壊装置(BransonSonifierW200P、米国)を用いて細胞浮遊液を氷中で2分間超音波処理することで破壊し、４℃で10,000ｘ９，１０分間遠心後上清を回収して細胞抽出液とした。

Ⅱ‑2‑6．カタラーゼ活性の測定

細胞抽出液中のカタラーゼ活性はBergmeyer(30)の方法にしたがって分光学的にＨ２Ｏ２の分解を240nｍの吸光度の減少をみることで測定し、ｍgタンパク質あたりの比活性で表した。この場合、カタラーゼの1unitは25℃、１分間で lIAmolのＨ２○2を分解するのに必要な酵素の量である。酵母の抽出液中のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準としたBiuret法で行った。また枯草菌の抽出液中のタンパク質濃度はLowryらの方法(31)により測定した。

1７

(23)

培地中に残存するグルコース量(％）

Ⅱ‑3‑1．酵母のカタラーゼ合成に及ぼす培地中のグルコースの影響酵母は培地中にグルコースが存在した場合よく生育する。そこで、まず異なる濃度のグルコースを含む培地で好気的に培養したときの細胞収量とそのときのカタラーゼ活性について検討した。その結果を表1に示す。

表１．酵母の生育とカタラーゼ合成に及ぼすグルコースの影響

細胞は表に示す濃度のグルコースを加えた１％酵母エキス、１％ポリペプトンを含む培地中で30℃、１８時間好気的に培養した。材料と方法で示したようにして培地に残存するグルコースの濃度を測定した。カタラーゼ活性、グルコース濃度は平均値±標準誤差で表した。

４１．０±１．０３６．７±１．７１５．９±０．６９．３±１．２

雪鶏蛎グﾙｺ￨(u謡脇;雛I） ^{細胞収量}^(OD660）

第 Ⅱ 章 − ３．結果

００００５０００●●●●

０１２３３３５６ _申●●● ５６１８３７６３＋一士十一十一００００ ●●●● ５７２１１１１２

０．０２１±０．００９０．０３６±０．００４０．１０７±０．０１２０．１２４±０．０１０

細胞収量は培地に加えたグルコースの濃度にしたがって増加した。培地中に加えたグルコースは大部分(95％以上)が消費されたが、残存するグルコースの量は2％のグルコースが加えられたときに0.1％を示しほぼ最大に達した。一方、培養後の細胞のカタラーゼ活性は培地中のグルコース濃度とは逆に低下し、３％グルコースで生育した酵母のカタラーゼ活性は0.5％のグルコースで生育した酵母の1/4であり、グルコースの濃度と逆の相関を示した。

1８

(24)

周囲にグルコースの存在しない条件下で好気的呼吸を行うことでカダラ ^ロ成が誘導されることを示している。

8０

Ⅱ ‑ 3 ‑ 2 ．好気的インキュベーションによる酵母のカタラーゼ合成誘導次に細胞内に蓄積されたグルコースが消費された場合、つまりグルコースが存在しない条件下で、カタラーゼ合成が誘導されるかどうか検討した。その結果、２％グルコースを含む培地で生育した酵母を増殖が殆ど起こらない条件下で好気的にインキュベー卜した場合、カタラーゼの活性は増加し３時間のインキュベーション後はインキュベーション前の４倍に増加した(図1)。このことは周囲にグルコースの存在しない条件下で好気的呼吸を行うことでカタラーゼ合

ＯＯ０６４２

︵瓢︑﹄へ八輪冒這壱．︶蓮胆寧ｌ爪硲兵

０２４６

インキュペーション時間(時間）

酵母のカタラーゼ合成の経時的誘導図１．

グルコースの存在下で生育した酵母を２％酵母エキスを含む 20,Ｍリン酸緩衝液に浮遊し30℃で好気的にインキュベートし、図に示した時間で細胞を集めカタラーゼ活性を測定した。それぞれの測定点は平均値±標準誤差で表した。

1９

(25)

Ⅱ‑3‑3．酵母のカタラーゼ合成誘導に及ぼすタンパク質合成阻害剤の影響

次にこのカタラーゼ合成の誘導に酵素タンパク質合成が関与しているかどうかについて調べるために、培地に真核生物のタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドを加えカタラーゼの誘導が抑制されるかどうかについて検討した。表２に示すようにシクロヘキシミドを加えてインキュベー卜した場合、カタラーゼ活性の増加は殆ど認められなかったが、原核生物のタンパク質合成阻害剤クロラムフェニコールを加えた場合には何も加えない場合と同様にカタラーゼ活性の増加が認められた。この事実は、好気的インキュベーションによりカタラゼタンパク質の合成が起こっていることを示している。

ー

表 2 ．酵母のカタラーゼ合成誘導に及ぼすシクロヘキシミドとクロラムフェニコールの影響

培養後集めた細胞を２％酵母エキスを含む20,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)に浮遊させ、シクロヘキシミド(101ﾙＭ)あるいはクロラムフェニコール(601Ag/ｍｌ)を加えて、

30℃で３時間好気的に誘導した。カタラーゼ活性は平均値±標準誤差で表した。

3‑4．酵母のカタラーゼ合成誘導における酸素の役割

さらにこのカタラーゼ合成の誘導が酸素呼吸の結果起こったかどうかについて検討するために、インキュベーションを酸素の存在しない条件下、即ち窒素

2０

(26)

ガス(Ｎ２)を吹き込みながら行い、カタラーゼ活性の増加を調べた。その結果表３に示すように、窒素ガスの存在下でインキュベートした場合、インキュベーション前と比べて殆どカタラーゼ活性は増加しなかった。したがって、このカタラーゼの誘導には酸素が必要であることが示された。

表3．酵母のカタラーゼ合成誘導に及ぼす窒素ガスの影響

細胞は２％酵母エキスを含む20,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)に浮遊させ、窒素ガスを吹き込みながら３０℃３時間インキュベートした。カタラーゼ活性は平均値±標準誤差で測定した。

インキュベーション条件

インキュベーション前

Ｎ２ガスでインキユベーシヨン

エアレーション下でのインキュベーション

カタラーゼ活性 (unit/mｇタンパク質）

１５．８±０．４１６．５±０．２６４．５±０．２

Ⅱ‑3‑5．枯草菌におけるカタラーゼ合成に及ぼすグルコースの影響一方、枯草菌は好気性菌であるためもともと培養後のカタラーゼ活性は酵母より高い。そこでまず培地にグルコースが存在した場合、カタラーゼ活性がどのように変化するかについて調べた。表4に示したように、培地にグルコースを加えて培養した場合、加えないで培養した場合に比べて培養後のカタラーゼ活'性は約2.5倍に増加した。

2１

(27)

表４枯草菌生育状態でのカタラーゼ合成に及ぼすグルコースの影響

細胞をグルコースを含む培地あるいは含まない培地で好気的に30℃、１８時間培養した後、細胞抽出液を作製し、材料と方法で示したようにしてカタラーゼ活性

を測定した。結果は平均値±標準誤差で表した。

無Ｗ窓 Ⅵ Ⅱ

Ｆ１ノヲ

【)７−２

ｒ１Ｌ

」

細胞収婦

〕ｌ〕６６『

４．０ ± ［

このような高いカタラーゼ活性がある場合、たとえ枯草菌がマクロファージに取り込まれて食胞内でＨ２○2放出の攻撃を受けても、自らカタラーゼ合成を誘導してその攻撃に耐える可能性が考えられた。このことを確かめるために一定濃度のＨ２０２が存在する条件下で枯草菌をインキユベートすることにより、

カタラーゼ合成が誘導されるかどうかについて検討した。

Ⅱ−３−６．枯草菌における外部からのＨ２Ｏ２の添加によるカタラーゼ合成

誘導

グルコースを含む培地で培養した枯草菌に100ｍＭＨ２０２を材料と方法で述べたようにして、ペリスタポンプで0.6ｍl/hで連続的に加えながらインキュベートし、経時的にカタラーゼ活性を測定した。その結果、図２に示したように H2○2を連続的に加えた場合、加えていない場合に比べて、カタラーゼ活性はインキュベーション時間とともに増加し6時間後に、約6倍にまで増加しピーク

に達した。

2２

(28)

3０００

００００００２１

︵甑︑シヘハ毎回Ｅ毒一厘コ︶鎚胆型ｌいい侭

０２４６８１０インキュベーション時間(時間）

図２Ｈ２０２の添加によるカタラーゼ合成の経時的誘導

１００，Ｍグルコースを含む培地で生育した枯草菌を２％酵母エキスを含む20,Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)10ｍlに浮遊し、１００，ＭのＨ２Ｏ２を添加しながら３０℃で好気的にインキユベートした(＋Ｈ202)。同じ密度の枯草菌浮遊液をＨ２０２を添加せずに30℃で好気的にインキユベートしたものを対照とした(‑Ｈ202)。それぞれのポイントは、カタラーゼ活性の平均値士標準誤差を表している。

また添加するＨ２Ｏ２の至適濃度を求めるために、インキユベーシヨン時間を６時間に固定して添加するＨ２Ｏ２の濃度を変化させ、各濃度でインキユベートした枯草菌のカタラーゼ活性を測定した。その結果、図３に示したようにほぼ 200,ＭのＨ２Ｏ２を加えたときにカタラーゼ活性はピークに達し、そのレベルは 500,Ｍまで維持された。５００，ＭのＨ２Ｏ２を加えたときにも高いレベルのカタラーゼ合成の誘導が見られたことは、枯草菌はインキュベーションに用いたような細胞密度で存在するときには高濃度のＨ２Ｏ２にも耐えられる可能性を示唆

している。

2３

(29)

ＯＯＯＯＯ０２１

︵甑︑シへ八輪ロＥ喜一屋．︶超胆寧ｌいい侭

ハ境

〆

︻岩ＬＯ

Ⅱ−３−７．枯草菌におけるＨ２Ｏ２によるカタラーゼ合成誘導に及ぼすタンパク質合成阻害剤及びRNA合成阻害剤の影響

次にこのカタラーゼ合成の誘導にタンパク質合成が関与しているかどうか、

あるいはRNA合成(転写)が関与しているかどうかについて検討した。インキュベーション培地に原核生物のタンパク質合成阻害剤クロラムフェニコールと RNA合成阻害剤リファンピシンを加えて６時間インキュベートし、カタラーゼ活性を比較した。その結果表5に示すように、カタラーゼ活性の増加はこれら２つの薬剤の存在下でほぼ完全に抑制され、インキュベートしていない場合とほぼ同様のカラーゼ活性を示した。したがってＨ２○2の連続添加によって起こ

Ｈ202濃度(ｍＭ）

図３．カタラーゼ合成誘導に及ぼすＨ２０２の濃度の検討

グルコース100,Ｍを含む培地で生育した細胞を２％酵母エキスを含む20,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.0)10ｍlに浮遊し、３０℃で６時間インキュペートした。インキユベートの際に、図に示す濃度のＨ２０２を一定速度(0.6ｍl／ｈ)で添加した。

それぞれのポイントは、カタラーゼ活性の平均値±標準誤差を表している。

ｒ１Ｌ』

2４

(30)

るカタラーゼ合成の誘導には新規のタンパク質合成やRNA合成が関与していることが示された。つまり外部からのＨ２Ｏ２の添加に対して枯草菌はカダラ合成を誘導することにより、生存する能力を有することが示唆された。

表5．Ｈ２０２によるカタラーゼ合成誘導に及ぼすクロラムフエニコール及びリファンピシンの影響

１００，Ｍグルコースを含む培地で培養した細胞を、２％酵母エキスを含む２０，Ｍリン酸緩衝液(ＰＨ７．０)に浮遊させ、クロラムフェニコール (60ug/ｍｌ)、リファンピシン(１０１４Ｍ)を加えた。さらに浮遊液に一定量 (0.6ｍl/ｈ)の１００ｍＭＨ２０２を添加しながら３０℃、６時間好気的にインキュベー卜した。カタラーゼ活性は平均値±標準誤差で表した。

インキュベーション液への添加

無添加

クロラムフェニコールリファンピシンインキュベートせず

2５

カタラーゼ活性 (unit／ｍｇタンパク質）

１７７８．８±２０．０３５８．０±１５．７３３９．７±２３．０３６０．０土１３．４

− ゼ

(31)

第 Ⅱ 章 ‑ 4 ．考察

本研究ではまずマクロフアージに取り込まれた微生物がＨ２Ｏ２の攻撃に対してどのように生き延びるかについて、H202を分解する反応を触媒する酵素カタラーゼ合成の誘導という観点から実験を行った。

微生物が侵入した際に、生体の免疫機構の中で最初に機能する細胞が貧食作用を持つ白血球、即ち好中球やマクロファージである。特にマクロファージは単球由来でリンパ球と同じ単核球に属し、貧食作用のみならず抗原提示や炎症性のサイトカイン産生のような特異的免疫応答の惹起に関与するという重要な機能を持っている。末梢の組織に侵入した微生物は、組織に浸潤してきたマクロフアージに貧食され、食胞に取り込まれる。マクロフアージは食胞内に○2‐

、H202、ＮＯＸｓやタンパク質分解酵素等を放出し取込んだ微生物を殺そうとする(2)。一方、マクロファージが放出するこれらの殺菌物質に対して抵抗性を示す微生物もいる。好気性細菌や通性好気性細菌または一部の真菌がそうで、これらの細菌は○2‑を分解する反応を触媒するスーパーオキシドジスムターゼやＨ２Ｏ２を分解する反応を触媒するカタラーゼを産生することで生存する(28, 29)と考えられていた。産生される酵素の量が多ければ生存するであろうし、

不足した場合は死滅するであろう。しかしながらどのような状況でこれらの酵素が誘導されるかについてはあまり知られていなかった○本研究ではカタラーゼに着目して、微生物がどのような状況下でカタラーゼ合成を誘導するか検討

した。微生物として真核生物の酵母と細菌の枯草菌を選択した。

2６

(32)

Ⅱ−４−１．酵母におけるカタラーゼ合成誘導機構の解析

酵母は炭素源としてグルコースを消費しアルコール発酵の過程でこれを取込み分解し、わずかなエネルギーを産出する。解糖や発酵には酸素を必要としないためＨ２Ｏ２の発生する過程はないが、次のTCA回路への出発物質であるピルビン酸が作られる。このピルビン酸を用いて酸素を必要とするTCA回路が動きエネルギーが産出される。TCA回路ではエネルギーはＮＡＤＨの形で蓄えられ、

これが電子伝達系で酸化される過程でATPの形で産み出される。電子伝達系での酸化の間にＮＡＤＨに由来する4Ｈは０２に渡され酸化される。もし2ＨがＯ２に渡され酸化されるとＨ２０２となる。このＨ２０２の酸化がさらに進んだ場合、02‑

が産生される(32,33)。今回行った実験では、グルコースを含む培地で培養した酵母は殆どカタラーゼを合成していなかった。これは培養終了時に培地中にグルコースが残存していたことから、たとえ好気的に培養した酵母でも培地にグルコースが存在した場合、グルコースの分解がTCA回路を動かすよりも優先してしまうためであると考えられる。一方、グルコースのない条件下で好気的にインキュベートした場合、カタラーゼ活性の増加が認められ、さらにこの酵素活性の増加はタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドの添加によって阻害されることが明らかになった。これは次のように考えられる。酵母が生育する過程で培地から取り込み細胞内に蓄えたグルコースを解糖系により分解し、蓄積したピルビン酸を使用してTCA回路を動かし、それに関連してペントースリン酸経路等が動き細胞内にＨ２Ｏ２が蓄積し、これを分解するためにカタラーゼタンパク質が合成された。つまり酵母ではカタラーゼ合成は酸素呼吸が盛んになるに従って増加し、嫌気的呼吸の条件下では殆ど起こらない。またここに実験結果は示していないが、酵母の細胞浮遊液に外部からH202を加えた場合には

２７

(33)

カタラーゼ合成の誘導は起こらなかった。この事実から酵母はその細胞壁の構造によってＨ２Ｏ２が細胞内に入らないようにすることで、Ｈ２Ｏ２の毒性から逃れている可能性を示唆している。これらの結果から、酵母はマクロファージに取り込まれ食胞内でＨ２Ｏ２の放出を受けてもＨ２Ｏ２を細胞内に取り込まないようにしているか、仮に取り込まれても酸素呼吸の結果合成されたカタラーゼによって分解し無毒化しているものと考えられる。

Ⅱ−４−２．枯草菌におけるカタラーゼ合成誘導機構の解析

すでに大腸菌では細胞浮遊液に外部からＨ２０２を連続的に添加することによりカタラーゼ合成が誘導されることが報告されている(２８，２９，３４)。そこで枯草菌にも同様の機構が存在するかどうかについて検討した。まず枯草菌の生育時でのカタラーゼ合成についてグルコースの有無の影響を調べた。その結果枯草菌では大腸菌(34)や酵母(19)と異なり、グルコースの存在下で培養した方が高いカタラーゼ活性を示した。これは、枯草菌が通常の酸素呼吸のみならず豊富に存在するグルコースを利用して、グルコースオキシダーゼで直接グルコースを酸化してエネルギーを得る反応(32)を積極的に利用した結果、Ｈ２Ｏ２が産生され、これを分解するためにカタラーゼ合成が誘導されたからであると考えられる。さらに酵母に比べて総タンパク質あたりのカタラーゼ活性のレベルが高いことは、枯草菌がより酸素分圧の高いところで生育し、酸素呼吸を盛んに行っているからであろう。今回の実験で、枯草菌にＨ２Ｏ２を連続的に添加してインキュベー卜した場合、カタラーゼ活性が著しく上昇した。さらに酵素活性の増加は、原核生物のタンパク質合成阻害剤であるクロラムフェニコール及び RNA合成阻害剤であるリファンピシンの添加によりほぼ完全に阻害されたこと

２８

(34)

から、酵素活性の上昇にはタンパク質合成及び新たなRNA合成がが関与していることが示された(20)。これらの結果は、枯草菌は外部から加えられたＨ２Ｏ２に対してカタラーゼを合成することで対抗していることを示しており、仮に今回用いた細胞密度で存在した場合、高濃度｛500ｘ0.6ｍｌｘ６ｈ÷(10ｍl＋0.6ｍｌｘ６ｈ)｝ｍＭ＝１３２，ＭのＨ２Ｏ２を分解し生存する可能性を示唆している。このような外部から添加されたＨ２０２に対するカタラーゼ合成の誘導は、Bacillus cereusやBacilIusmegate血ｍでも報告されており(35)、幾つかの細菌には共通の機構であると思われる。このようにある種の細菌は、たとえマクロファージに取り込まれても完全に殺されるわけではなく、カタラーゼ合成の誘導のようなＨ２○2の分解機構によって生存し宿主侵入するもの思われる。したがって宿主にとってはマクロファージによる攻撃から逃れた細菌などの微生物を排除する別の防御機構が必要になってくる。

２９

(35)

第 Ⅲ 章Ⅲ章モルモットＴ細胞活』性化マクロファージ因子(ＴＡＭ)の精製及びその生物活性の解析

3０

(36)

第Ⅱ章−１．序論

カタラーゼ合成の誘導によってＨ２○2を無毒化しマクロフアージの攻撃から逃れた微生物に対してT細胞による特異的な免疫応答が惹起される。微生物を取り込んだマクロファージは、殺菌物質とともにタンパク質分解酵素のような消化酵素を分泌し、微生物の構成タンパク質を分解する。この過程でタンパク質は10数個のアミノ酸からなる短いペプチドに分解されて、主要組織適合遺伝子複合体(majorhistocompatibiliitycomplex，ＭＨＣと略す)産物クラスＩ分子あるいはクラスⅡ分子とともに細胞表面に提示(抗原提示)される。一方、Ｔ細胞はその細胞表面上に抗原特異性を有する抗原受容体(Tcellantigen receptor、ＴＣＲと略す)を発現し、それによってマクロファージ細胞表面上にＭＨＣとともに提示された抗原を特異的に認識し、活性化される。この認識→

活性化の際にはマクロファージから放出されるサイトカイン(モノカインともいう)であるインターロイキンー1(IL‑1)が必要である(7)。抗原刺激とIL‑1による刺激を受けたT細胞は活性化され次々に反応を拡大し、侵入微生物を除去する遅延型過敏反応を起こしたり、Ｂ細胞と相互作用してＢ細胞を抗体産生細胞へ

と分化させ、抗体産生を誘導したりする。

本章では、マクロファージの防御機構を回避した細菌に対するT細胞の抗原特異的免疫応答の惹起に関わるサイトカイン、11‑戸1の役割について検討する。

まずこれまで確認されていなかったモルモットのマクロファージ由来T細胞活性化因子(Tcell‑activatingmonokine、ＴＡＭと略す)を単離精製した。そしてそれがマウスやヒトのIE1と異なる分子量を持っているにも関わらず、Ｔ細胞を刺激してマクロファージを活性化するサイトカイン、マクロファージ遊走阻

３１

(37)

止因子の産生を促すという生物活性を持つ点で共通であること、エフェクター細胞の分化を誘導するＴ細胞が、抗原特異的に応答する際に必須のサイトカイ

ンであることを明らかする。つまりモルモットでは、ＴＡＭが抗原刺激に対する特異的な免疫応答を惹起し、抗原の除去に重要な役割を果たしていることを論述する。

3２

(38)

第 Ⅲ 章 − ２．材料と方法

Ⅲ‑2‑1.実験動物

モルモット(outbredのHartley、メス)は黒田実験動物(熊本市)より購入した。inbredのstrainl3、２及びJY‑1は日生研株式会社(東京)より購入し、いずれも体重が400‑500gであった。

Ⅲ‑2‑2．試薬及び培地

muramyldipeptide(N‑acetylmuramyl‑Ealanyl‑D‑isoglutamine，以下 MDPと略す)はタンパク研究所(大阪市)より購入した。Phytohemaggluti‑nin‑

P(タンパク質含有率の高いもの)はDifco研究所(デトロイト、米国)より、

[ｍｅthy卜3Ｈ］一チミジンはアマシヤム株式会社日本支社(東京)より購入した。

プロキオンレッドアガロースゲルはGIBCOBethesdaResearchLabolatories (GIBCO‑BRL，ロツクビル、米国メリーランド州)より購入した。RPMI1640 培地はGIBCO‑BRL社より粉末を購入し、添付のマニュアルに従って滅菌水に溶解後、ＣＯ２ガスを吹き込むことでｐＨを7.2に調整し、２，ＭのL一グルタミン、５０１ﾙＭメルカプトエタノール(２−ＭＥと略す)、及び抗生物質として 10units/ｍｌのペニシリン、0.1肌g/ｍｌのストレプトマイシン及20鴫/ｍｌのゲンタマイシンを加え0.451ﾙｍのメンブレンフィルターで無菌滴過したものを使用

した。

Ⅲ‑2‑3．MDP刺激マクロファージ培養上清の調製

腹腔惨出マクロファージは、モルモットに高圧蒸気滅菌した流動パラフィン

3３

(39)

10ｍlを腹腔内注射後７〜８日目に集めた(36)。細胞は温めたHank1sbalanced saltsolution(ＨBSS)で２回洗浄したのち、５％のウシ新生仔血清を含んだ HBSS10mlに２ｘｌＯ６細胞/ｍｌで浮遊させ、１０，１用のペトリ皿中に移して、５％

CO2、３７℃で湿度を飽和状態に保ったままインキュベートした。60‑90分後、

HBSSで残った非付着性の細胞を洗浄し除去した。この操作により約50％の細胞が回収された。残った付着性細胞をマクロファージ特異的なエステラーゼ染色を行った結果、９８％がマクロファージであった。付着性細胞が残ったペトリ皿に0.51ﾙg/ｍｌのMDPを含むRPMI1640を8ｍlを加え、５％ＣＯ２、３７℃で湿度を十分に保ったまま培養した。18‑20時間後上清を回収し、1,500rpm、１０分間遠心した。さらにこの上清を４℃、15,000rpm，３０分間遠心し、上清を‑20℃

で保存した。

Ⅲ‑2‑4．培養上清のゲル猿過

ＭＤＰ刺激マクロフアージ培養上清はＮａＮ３(0.1％)を加え、４℃でＹＭ−５膜を

使用した撹祥子付のDIAFLOCeu(Amiconlnc・米国、メリーランド州、レキシントン)で400〜600倍に濃縮した。その後、0.1％のＮａＮ３、400mMNaClを含む100,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.2)に透析し、遠心後、TSK‑G3000SWカラム (2.5ｘ６０ｃｍ、ＴＯＳＯＣｏｒｐ・東京)を装着した高速液体クロマトグラフィー装置で分画し、溶出液を3ｍlずつ分取した。溶出した画分に含まれるＴＡＭの活性は、各画分から50ulを採取し1％牛胎児血清(fetalcalfserum，FCSと略す)を含むRPMI1640培地で20倍に希釈し、FCSを含まないRPMI1640培地に一晩透析した後に0.45ｕｍのメンブレンフィルターで無菌濃過したものをサンプルと

３４

(40)

して胸腺細胞アッセイによって測定した。

Ⅲ‑2‑5．プロキオンレッドアガロースによる分画

ゲル漁過後TAM活性を含む画分をプールし、400ｍＭＮａＣｌを含む10,Ｍリン酸緩衝(ｐＨ7.2)で平衡化したプロキオンレッドアガロースゲルを充填したカラム(1.0ｘ３．９ｃｍ)に加えた。この条件で牛血清アルブミンはカラムを通過したが、活性成分は吸着した。１０倍容の同じ緩衝液で洗浄した後、1.0ＭNaClを含む10,Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ7.2)を加えて溶出し、溶出液を1ｍlずつ分取した。溶出した画分に含まれるＴＡＭの活性は、各画分から50ulを採取し1％のFCSを含むRPMI1640培地で20倍に希釈し、FCSを含まないRPMI1640培地100ｍlに一晩透析した後に0.45ｕｍのメンブレンフィルターで無菌滴過したものをサンプルとして、胸腺細胞アッセイによって測定した。

Ⅲ‑2‑6．血清成分の免疫吸着

活性成分を含む画分をプールし、抗ウサギ抗体カラムで精製した抗牛血清アルブミンウサギ抗体及び抗牛血清ウサギ抗体を固相化したSepharose‑CL4Bカラム(2.5ｘｌＯｃｍ)に加えカラム通過液を全て回収した。得られたカラム通過液に含まれるＴＡＭの活性は、画分から５０１ﾙlを採取し、１％のＦＣＳを含む RPMI1640培地で20倍に希釈し、FCSを含まないRPMI1640培地に一晩透析した後に0.451凡ｍのメンブレンフィルターで無菌浦過したものをサンプルとして、胸腺細胞アッセイによって測定した。

3５

差 釜 待 司 雨 i 論

ハ 境

〆

差釜待司雨 i 論

ハ境