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０８４２
１︵寸︲︒↑ｘＥＱｅ劇跨八踊岬トー国師
−酢Control(PBS）
一●一ＳＥＢ：５１↓ｇ
一○一一SEB:50ILg
1２
トーＬ
ＦｒＬＬ仁
次にSEBを繰り返し投与することによって誘導されたSEＢに対するトレラ
ンスが持続する期間について調べるために、ＳＥＢを５１ﾙg/マウス及び501ﾙg／
マウスで4回ずつ投与した後にT細胞のSEBに対する増殖応答を1週間間隔で 測定した。図９に示すように、Ｔ細胞の増殖応答の低下は緩やかに回復に向 かっていたが、８週間の間低下したままであった。この結果からSEＢに対す
るV68TCR‑T細胞のトレランスが最低８週間持続することが分かった。
Ⅲ
Ｏ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ
０
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
４回目のＳＥB投与から経過した週数 図９．SEBで誘導されたトレランスの持続期間の検討
ＳＥB(５ｕｇ／マウス)、ＳＥB(50149／マウス)及びPBSを４回投与後１週後 から８週まで毎週牌臓細胞を調製し、ＳＥB(１０四／ｍｌ)を含む培地で培養 し、増殖応答を測定した。増殖応答は3H‑チミジンの取込で表し、それ ぞれの測定点は３回の測定の平均値である。
6４
１V‑3‑3．ＳＥＢ投与マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制 DBA/1マウスはⅡ型コラーゲンをフロイント完全アジュバントとともに免疫 することでヒトの慢性関節リウマチ様の関節炎、コラーゲン誘導関節炎(CIA）
を引き起こす。しかも本疾患においてVI38TCR三r細胞が主として自己抗原であ
るⅡ型コラーゲンと反応し、自己免疫応答を引き起こしていることが報告され ている(６０，６１，６２)。そこでSEB投与によってあらかじめトレランスを誘導さ れたマウスにＣⅡを免疫することにより疾患の発症が抑制されるかどうかについて検討した。図10(a)に示す投与スケジュールで、SEBを50鴫/マウスで４回
投与し、その後ＣⅡ＋FCAで皮内、２１日後にＣⅡ単独で腹空内免疫してCIAを発 症させ、予めSEB投与によってトレランスが誘導されたマウスとの発症率につ いて調べた。対照として投与時期を遅らせたSEB‑postについても同様に検討した。図10(b)に示すように、SEB50ug/マウス投与群では実験の期間のいず
れの時期においても発症率は最高約20％で推移したが、対照群(PBS投与群)で は100％に達した。一方、投与を遅らせた実験群は、発症率は約20％しか低下 せず、発症抑制が不十分であった。これらの結果からSEBを繰り返し投与する ことでトレランスを誘導したマウスでは、コラーゲン誘導関節炎の発症が抑制 されるが、トレランスの誘導が不十分な場合は発症抑制の程度が不十分であることが判明した。
6５
ＳＥＢ−Ｐｒｅ
‐
−６d−２ｄ２ｄ６ｄ
8０
CＩ１１ｄｌｂｄｌ９Ｃ
SＥＢ−Ｐｏｓｔ i､.．
(b）
ＳＥＢ−ｐ〔
〔ＵｑＯ同Ｏ−０月Ｏ−Ｏ−Ｏ−Ｏ−ＯＰＥ 1００
(a）
６４２ ０００
︵訳︶爵照総ｅぐ６
ＤＢＡ/1マウスを図に示すようにしてＳＥＢ(501Ag/マウス)及びＰＢＳを４回繰り 返し投与した。投与はⅡ型コラーゲン(ＣⅡ)免疫日を０週として、それより前に ＳＥＢを投与するＳＥＢ−ｐｒｅと免疫日からブースターまでの間に投与するＳＥＢ−
ｐｏｓｔに分けて投与し、ＰＢＳはSEB‑preと同様に投与した。
(b)SEBの投与によるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制
（a)で示したプロトコールにしたがってＳＥＢを投与し、ＣⅡブースターから７ 日後から各実験群のコラーゲン誘導関節炎の発症個体数を測定した。
ＣⅡ：Ⅱ型コラーゲン、ＣＩＡ:コラーゲン誘導関節炎、ＦＣＡ:フロイント完全ア
発症率＝各実験群の発症個体数
ジ ュ パ ン ト
ｘｌＯＯ
各実験群の総個体数
２０
０ １ ０ ３ ０
ＣⅡブースターからの経過日数 図１０ＳＥＢの繰り返し投与によるＣＩＡの発症抑制 (a)Ⅱ型コラーゲン免疫とＳＥＢ投与のプロトコール
4０
6６
る可能性が示唆された。
ｂ − Ｃ
０８６４２０
１︵す︲︒↑×〃ＥＱｅ劇督ｅ八筋〃トー国︑
一方、コラーゲン誘導関節炎はT細胞が自己抗原ＣⅡと反応することに端を発 することから、ＳＥB投与によってトレランスを誘導され疾患の発症が抑制され たマウスで、Ⅱ型コラーゲンに対する免疫応答が低下しているかどうかを調べ た。図11に示すようにT細胞のⅡ型コラーゲンに対する増殖応答はSEB非投与 群のそれに比べて約60％低下し、ＳＥBに対するトレランスの誘導と相関してい
０ １ ． ２ ５ ２ ． ５ ５ １ ０ ２ ０ ４ ０ ８ ０
ＣⅡの濃度（Ｕｇ／ｍＩ）
図１１ＳＥB投与によるＣⅡに対するＴ細胞増殖応答の低下 ＳＥＢ(50149ノマウス)、ＳＥＢ(5岨ノマウス)、及びPBSを４回繰り 返し投与したマウスにＣⅡを免疫し、３週後に牌臓T細胞を分 離し、図に示す濃度のⅡ型コラーゲン(ＣⅡ）とともに材料と方 法に示すようにして培養し、３Ｈ−チミジンの取込により増殖 応 答 を 測 定 し た 。 各 実 験 群 の マ ウ ス の 測 定 ポ イ ン ト は 各 実 験 群の平均値±標準誤差で表した。
次にⅡ型コラーゲンに対するIgG抗体産生について調べるために、各実験群 のマウスから1週毎に血清を採取し、ＲＩＡを用いて抗Ⅱ型コラーゲンIgG抗体産 生応答を測定した。その結果図12に示したように、ＳＥB投与群では非投与群に 比べて約25％の抗Ⅱ型コラーゲンIgG抗体(抗ＣⅡ一IgG抗体)産生の低下が認めら
６７
節炎の発症に関連している可能性が示唆された。
︵の︲臼ｘＥ８︶起胆諌曇ｅ赴塘ｏ望Ｉ目︒塩
可PBS投与瀞 ５
ＯＳＥＢ(５０ｕＥ ４
３
れた。この結果から僅かではあるが、抗ＣⅡ一IgG抗体産生もコラーゲン誘導関
２
１
０
０ １ ２ ３ ４ ５
Ｃ Ⅱ 免 疫 か ら の 経 過 週 数
図12．ＳＥB投与によるＣＩＡ発症マウスでの抗ＣⅡ−IgG抗体 産 生 の 抑 制
ＳＥＢ(50四/マウス)、ＳＥＢ(514gノマウス)及びＰＢＳを４回繰 り返し投与したマウスからブースター後毎週１回５週まで血 清を採取し、抗Ⅱ型コラーゲンIgG抗体を1251‑抗マウスIgG 抗体を使用したRIAにより測定した。各測定ポイントは５匹 のマウスの平均の放射活性で表した。
ＣⅡ：Ⅱ型コラーゲン
SEBの経口投与によるトレランスの誘導
Ⅳ‑３−４．
ところで、SEBは自然界では経口的に動物の体内に取り込まれ、場合によっ ては食中毒を引き起こす。SEBによって起こる食中毒と同様の症状がSEBを一 定量以上静脈内投与することで引き起こされるので、SEBを経口投与した場合
Vl38TCR‑T細胞特異的なトレランスが誘導される可能性が考えられた。そこ で、ＤＢＡ/1マウスでSEBを経口投与した際にV68TCR三r細胞にトレランスが
誘導されるかどうかについて調べた。まず予備的に投与量について検討したと6８
ころ、下痢を起こさず、体重減少も起こさない投与量は1ug/マウス／日であっ
た 。 そ こ で こ の 投 与 量 で ト レ ラ ン ス を 誘 導 す る か ど う か を 検 討 し た 。 実 験 で は、SEBを2週間毎日投与し、１週、２週、４週後牌臓T細胞を調製してSEBに対 する増殖応答の低下が見られるかどうか検討した。その結果、図13に示したよ うにSEB投与終了後1週目では、ＳＥB経口投与群では増殖応答が著しく低下 し、トレランスが成立していることが示された。しかしながら、この応答性の 低下は投与終了後からの経過時間によって回復する傾向にあった。例えば、２ 週後ではSEBに対する増殖応答の低下は認められたが、程度が小さく、投与終 了後4週目では、ＳＥBに対する増殖応答の低下はほとんど認められなかった。6９
1.25
2週後 一 PBS
1０
寺︲ｇ×．Ｅ・︒．︒︶劉岳ｅ八飛岬トー国雨 ︻﹄
４３２１０
今︲︒↑×．Ｅ・︒．︒︶劇爵ｅ八飛岬トー国
二 仁 蕊 ( 仰 ９ ， ﾏ ｩ ｽ ）
SEBの濃度(四／ｍＩ） SEBの濃度(Ｕｇ／ｍＩ）
1週後
2.5
4週後
図１３．経口投与終了後のSEＢに対するトレランスの誘導
ＳＥＢを１１Ag/マウスで１日１回、２週間連続して投与し１，２，４週後に牌臓を 摘出しＴ細胞を分離した。別に調製した抗原提示細胞の存在下で、横軸に示 した濃度のＳＥＢとともに72時間、３ウェル/検体で培養した。増殖応答は 3 Ｈ − チ ミ ジ ン の 取 込 で ３ 回 測 定 し 、 結 果 は ３ つ の 実 験 の 平 均 の 放 射 活 性 (c・ｐ．ｍ．)で表した。
2０ 【 】 ２ 【 ］
次に静脈内投与の場合と同様にこの応答性の低下に、クローンの除去とクロ ーンのアナジーが関与しているかどうかについて調べた。そこでSEBの経口投
与後のVl38TCR‑T細胞の頻度の増減及び抗V68TCR‑単クローン抗体に対する
７０ SEBの濃度（四／ｍＩ）
土 瑳 ( 仰 ９ ， ﾏ ｳ ｽ ）
３２１０
︵寸︐︒↑×．Ｅ・ロ．︒︶劇跨ｅ八飛岬トー国︑
1 . 2 5 2 . 5 ５ １ ０ ２ ０
増殖応答を測定した。その結果図14(a)に示すように、ＳＥB応答性のVI38TCR‑
T細胞の比率は投与後１週目に約30％減少したがその後は緩やかに回復した。
一方、対照として調べたVI36TCR茸I細胞の比率は殆ど変化しなかった。この結 果は、SEBの経口投与により僅かではあるが、ＳＥB特異的なＶβ8TCR三r細胞の
クローンの除去が起こっていることを示している。また、図14(b)に示したように抗V68TCR‑単クローン抗体に対する増殖応答 は約50％に低下していたが、別のＶβTCR三I､細胞と反応するSEAに対する増殖 応答はほとんど低下していなかった。VI38TCR三r細胞の増殖応答の低下は、Ｔ 細胞全体に占めるＶβ8TCR三I､細胞の頻度の低下30％を考慮に入れても補うこと ができないので、Ｖβ8TCR〆I細胞の応答性が一部低下していることを示してい
る。以上のことより、SEBの経口投与によって誘導されるトレランスには少な くとも部分的なクローンの除去と部分的なクローンのアナジーが関与している ことが分かった。7１
(a）
NoneVl38
国ＳＥB経口投与 園 正 常 マ ウ ス
４３１
２０
寺︐︒↑×・・Ｅ・︒．ｅ鋪劇督ｅハハ岬トー国飼
（）内は非投与群に比べて減少した比率を示す。
単位は％である。
(b）
Ｓ Ｅ Ｂ Ｓ Ｅ Ａ
1V−３−５．ＳＥＢ経口投与によるコラーゲン誘導関節炎の発症抑制と症状 軽 減 お よ び そ の 機 序 の 解 析
次に、静脈内投与の場合と同様に予めSEBを経口投与することによってトレ ランスを誘導したDBA/1マウスで、コラーゲン誘導関節炎の発症が抑制される かどうかについて検討した。予めSEBを11』g/マウス／日で経口投与し、Ⅱ型コ ラーゲンを２回免役してコラーゲン誘導関節炎を発症させ、ＳＥB投与群とPBS 投与群とで発症率を比較した。図15に示すように、コラーゲン誘導関節炎の発
図14．経口投与終了１週後の牌臓T細胞のSEB特異的トレランスの解析
ＳＥＢを１１』g/マウスの用量で１日１回、２週間連続して投与した。その1週後に牌 臓T細胞を調製し、材料と方法で述べたようにしてフローサイトメトリーによる解 析及び抗VI38TCR‑単クローン抗体に対する増殖応答の測定を行った。
(a)フローサイトメトリーによるＶβ6TCR及びＶｌ３８ＴＣＲ−Ｔ細胞比率の増減の比較 (b)抗Vl38TCR‑単クローン抗体(Ｖβ8)に対する増殖応答
増殖応答は、３Ｈ−チミジンの取込で測定し、各群５匹ずつのマウスを使用し、
結果は平均の放射活性(c,ｐ．ｍ．)で表した。
7２
lｗ ２Ｗ ４Ｗ
V'3６
非 投 与 マ ウ ス
ＳＥＢ
1 １ ． ９ １ ０ ． ８ ９ ． ５ １ １ ． ８ １ ０ ． ９ ９ ． ８
(‑0.8）（+0.9）
Vβ８ 非 投 与 マ ウ ス SＥＢ
9 . 8 １ ０ ． ３ １ ４ ． ９ 7 . 1 ７ ． １ １ ２ ． ７ (‑27.6）（‑31.1）（14.8）