Ec-LPS アレイを利用した溶血性尿毒症症候群患者の大腸菌 O 血清群診断

(1)

Ec-LPS アレイを利用した溶血性尿毒症症候群患者の大腸菌 O 血清群診断

1）

秋田大学バイオサイエンス教育・研究センター，

^2）

秋田県健康環境センター保健衛生部

天野憲一

^１）^２）

八柳潤

^２）

齊藤志保子

^２）

（平成 18 年 4 月 24 日受付）

（平成 18 年 8 月 28 日受理）

Key words : Escherichia. coli, LPS, O-serogroup, diarrhea, Ec-LPS array

要旨

下痢原性大腸菌のうち日本で患者から分離報告のある大腸菌の O 血清群菌を中心に 58 株より LPS を抽出精製し，溶血性尿毒症症候群（HUS）患者血清及び市販抗大腸菌 O 血清群抗血清との反応性を Ec-LPS アレイを用いて検討した．Ec-LPS アレイは PVDF メンブレンに 58 種の LPS をドットブロットして，メンブレン上で抗原抗体反応を行い，視覚的に診断する方法である．市販抗血清を用いると，ほとんどの場合同一の LPS とのみ反応することから，これらの LPS は抗原として使用できることが確認された．腸管出血性大腸菌（EHEC）が分離されなかった HUS 患者 6 名の血清と Ec-LPS アレイとの反応性を検討すると，急性期での血清中の IgM および IgA 抗体測定ではどの LPS とも反応しなかったが，回復期血清中の両抗体測定では全て O157-LPS に対して反応性を示した．この結果から，6 名の患者は全て EHEC O157 による感染であることが示唆された．同時に行った ELISA や WB からも同様の結果が得られた．一方患者血清中の IgG 抗体測定においては多くの O 群 LPS との反応性が見られ，診断には用いられないことを示した．以上のことから Ec-LPS アレイは ELISA やウェスタンブロットよりも時間やコスト，および手間から見て簡便な方法であるといえる．

〔感染症誌 81：26〜32，2007〕

序文

下痢原性大腸菌は主として毒素原性大腸菌，腸管侵入性大腸菌，腸管病原性大腸菌及び腸管出血性大腸菌

（EHEC）を含み，その他に腸管付着性大腸菌や腸管凝集性大腸菌が存在している．EHEC は志賀毒素の存在によって分類され，この産生遺伝子を検出することによって同定されることも多い．またそれ以外の下痢原性大腸菌の分類はそれぞれ特有な病原因子遺伝子の検出や毒素の産生試験によって決定される

^１）

．これまで多くの EHEC 感染症は大腸菌 O157 によって引き起こされたことが報告されてきたが，最近血清型 O 157 以外の大腸菌によって引き起こされる事例が増えてきている

^２）

．一方，それ以外の下痢原性大腸菌も様々な O 血清群を示しており，それぞれの下痢原性大腸菌と O 血清群にははっきりとした相関性はない．し

かしながら，原因食材の調査や，感染経路の追跡，あるいは集団食中毒内での患者同士の関連性の検討などからみて，O 血清型別診断は必要なことと思われる．

今回我々は我が国での EHEC などの下痢原性大腸菌感染症患者から分離された大腸菌 O 血清群を中心に 58 種の大腸菌

^３）

からフェノール・水抽出法で抽出し，

超遠心で精製した LPS を抗原とした Ec-LPS アレイを作成し，溶血性尿毒症症候群（HUS）患者血清を用いて反応させ，その有効性を検討したので報告する．

材料と方法

1．供試大腸菌株

大腸菌 O103，O111，O121 株は国際大腸菌クレブシェラセンター（コペンハーゲン，デンマーク），O26 はフランス国立獣医学研究所（パリ，フランス）より分与された．O91，0114，0123，0145，0153，0157，

0165 は秋田県衛生科学研究所にて分離同定した株，残りの O 血清群 47 株（O1，O3，O6，O8，O11，O15，

O18，O20，O25，O27，O28ac，O29，O32，O44，

原著

別刷請求先：（〒010―8543）秋田市本道 1―1―1

秋田大学バイオサイエンス教育・研究センター天野憲一

(2)

Fig. 1 Reactivity ofcommercialanti-E.coliO-serogroup antisera versusE.coliLPS measured by Ec-LPS array.1：O-serotype LPS,and asfirstantibodies；2：anti-O26 antisera；3：anti-O55 antisera；4：anti-O86 antisera；5：anti-O111 antisera；6：anti-O119 antisera；7：anti-O126 antisera；8：anti-O142 antisera；9： anti-O157 antisera.

O55，O63，O77，O78，O86a，O112ac， O 113 ， O115，O117，O119，O124，O125，O126，O127a，

O128，O131，O136，O142，O143，O144，O146，

O148，O149，O150，O151，O152，O158，O159，

O 164 ， O 166 ， O 167 ， O 168 ， O 169 ）は American

Type Culture Collection（ロックビル，USA）より購入した．

2．大腸菌の培養

大腸菌は Gmeiner 培地にて 37℃，overnight で培

養し

^４）

，0.5％ホルマリン殺菌後遠心にて集菌した．蒸

(3)

Table 1 Diagnosticdata ofpatientsused forserodiagnoses. Daysafter diarrhea onset Serum

Symptoms No Patient Age

No.

16 1-1

Diarrhea,HUS 11

1

5 2-1

Diarrhea,HUS 3

2

―^b）

3-1 None

15 3^a）

― 3-2

5 4-1

Diarrhea,HUS 13

4

9 4-2

5 5-1

Diarrhea,HUS 9

5

8 5-2

14 6-1

Diarrhea,HUS 4

6

a）BrotherofpatientNo.4.

b）Exactdata wasnotobtained.

留水で 2 回洗浄後，凍結乾燥した．

3．LPS の抽出と精製

LPS は乾燥菌体を用いてフェノール・水抽出法

^５）

で抽出し，蒸留水で 3 日間毎日透析用の水を交換して透析した．その後凍結乾燥した．LPS の精製は超遠心

（100,000xg，3 時間）にて行い，その後 2 回洗浄して凍結乾燥した．得られた精製 LPS（LPS と略す）は SDS-PAGE 後銀染色

^４）

にて染色したて，泳動パターンを確認した．

4．Ec-LPS アレイの作製

得られた LPS を 0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液にて 10 µ g ! mL に希釈した．一方 PVDF メンブレン（日本ミリポア社製）は 8cm×8cm に切断し，メタノール中で 10 分間振とうした後メタノールを捨ててブロッティング緩衝液で 30 分間振とうした．その後メンブレンをドットブロット装置（AE−6190 型，ATTO 社製）にセットし，希釈した LPS を 50µL ずつ分注し，アスピレータで吸引する．5％ Tween X20-PBS で 5 分間洗浄してそれを 2 回繰り返した．タッパーウェアにパラフィルムを敷き，その上にメンブレンを載せ，3％スキムミルク-PBS を 3mL マウントし常温で 30 分間静置した．その後 5％ Tween-PBS で 5 分間 2 回振とう洗浄し，洗浄後のメンブレンを濾紙で挟んで水分を取った後，得られたメンブレンを Ec-LPS アレイとして，使用するまで 4℃ で保存した．

5．Ec-LPS アレイを用いた診断法

保存した Ec-LPS アレイを 5％ Tween-PBS で 5 分間洗浄し，タッパーウェアにパラフィルムを敷いて，

その上に載せた．一次抗体として患者血清を 3％スキムミルク-PBS で 1 ! 100〜1 ! 500 倍希釈し，3mL をアレイにマウントした．常温で 30 分間静置後，Tween- PBS で 5 分間振とう洗浄した．次に二次抗体として，

ペルオキシダーゼ標識の抗ヒト IgG，抗ヒト IgM，抗ヒト IgA 抗体（Dako 社，デンマーク）をそれぞれ 3％

スキムミルク-PBS で 1! 250〜1! 500 希釈し，3mL を

マウントした．一次抗体に市販抗体（病原大腸菌免疫 O 血清：デンカ生研）を用いた場合は，二次抗体に抗ウサギ IgG 抗体（Dako 社）を 1! 500 希釈して用いた．

二次抗体を添加後 30 分間静置して，Tween-PBS で 10 分間 4 回振とう洗浄した．洗浄した Ec-LPS アレイをジアミノベンジジン発色液に浸し，発色するまで振とうした．発色後蒸留水で洗浄して，濾紙に挟んで乾燥させ，発色したドットを判定した．

6．ウェスタンブロットと ELISA

ウェスタンブロット（WB）と ELISA は Amano ら

^６）

の方法に準じて行った．

7．HUS 患者血清と抗大腸菌 O 血清

患者血清は秋田県衛生科学研究所で収集した HUS 患者血清を用いた．これらの患者の便からは EHEC は分離されなかった．大腸菌の O 群抗血清はデンカ生研（東京）より購入した．抗 O103 抗体は国際大腸菌・クレブシェラセンターより分与された．

結果

1．大腸菌 LPS と市販抗血清との反応性

58 種の大腸菌 O 血清群株より LPS の抽出精製を行った結果，乾燥菌体からの回収率は株によって多少異なるが，フェノール・水抽出の段階では 5〜10％，

超遠心後は 1〜3％の範囲内であった．得られた LPS を水に溶解して 2mg ! mL の濃度に調製した．SDS- PAGE で泳動し，銀染色で染色したところ，ほとんどの LPS は階段状のバンドを示しており，O 抗原多糖部分を有することが確認できた（データ省略）．これらの LPS と市販の大腸菌 O 血清との反応の特異性を ELISA 及び WB にて確認した（データ省略）．LPS はその同一の O 血清群に対する抗血清と高い反応性を示した．いくつかの抗血清は同一の血清群以外にも弱い反応性が見られたが，WB で検討した結果，他の O 血清群の LPS に対する反応性は見られなかった．例外的に抗 O121 と抗 O125 血清は互いに相手方の LPS の低分子領域の分子と反応しており，コアオリゴ糖部分に共通抗原性の可能性があるが，多糖部分には交差反応が見られなかった（データ省略）．これらの結果より O 血清群株より抽出した LPS 58 種は O 抗原多糖部分において他の O 血清型とは交差性が見られなかったことより，Ec-LPS アレイの抗原として用いることとした．

次に Ec-LPS アレイと市販抗血清との反応性を検討

した．Fig. 1に一部の結果を示す．市販抗血清は同一

の O 血清型 LPS に反応しており，他の血清型 LPS と

はほとんど反応性が見られなかった．上記 3 種類の測

定法はどれをとっても非常に特異性の高い方法である

ことが示された．

(4)

Table 2 Reactivity of IgM antibody in patient sera versus E.coli LPS measured by ELISA.

IgM titers ofpatients sera^a）b）

LPS 1-1 2-1 3-1 3-2 4-1 4-2 5-1 5-2 6-1

－

＋

－

＋

－ O26

－

－ O55

－

－ O86

＋

－

＋

＋ O103

－

＋

－

＋

－ O111

－

－ O119

－

－ O121

－

－ O125

－

－ O126

－

－ O127

－

＋

－ O128

－

－ O142

＋+＋

－

＋+＋

－

＋+＋

－

＋+＋

＋＋

O157

a）Dilution of patinet sera was 1/100 and anti-IgM anitibody 1/500.

b）－ ,OD492nm＜ 0.1；＋,0.1-0.4；＋＋,0.4-0.8；＋＋＋,＞0.8.

Fig. 2 Reactivity of IgM antibody in patient sera versusE.coli LPS measured by western blotting. As second antibody:antihuman IgM antibody.Dilution ofpatientsera was1/100 and antihuman IgM antibody 1/500.

2．大腸菌 LPS と腸管出血性大腸菌感染症患者血清との反応性

秋田県で発症した HUS 患者 6 名（Table 1）の急性期と回復期の血清を用いて ELISA を行った（Table 2）．これらの患者は 15 歳以下の小児であり，便から

は EHEC が分離されなかった．患者 No.3 は患者 No.4

の兄であり，発症はしていないが，妹の発症時期に伴

い，同一時期に採血を行った．可能性の高い O 血清

群 LPS との反応性を検討すると，抗ヒト IgM 抗体を

二次抗体として用いた場合，急性期血清である血清

(5)

Fig. 3 Reactivity ofIgG,IgM,and IgA antibodiesin patientsera versusE.coliLPS measured by Ec-LPS array.Assecond antibodies:antihuman IgG,antihuman IgM orantihuman IgA antibodies.Dilution ofpatientsera was1/100 and three antihuman antibodies1/500.

3-1，4-1，5-1 はどの LPS とも反応していないが，回復期血清である 1-1，3-2，4-2，5-2，6-1 は O157-LPS と強く反応していた．血清 2-1 は急性期でありながら強い反応性が見られたが，これは潜伏期が長かった可能性がある．二次抗体に抗 IgG 抗体を用いると，様々な O 血清型 LPS と反応してしまい，診断がつかなかった（データ省略）．この ELISA を基に二次抗体に抗 IgM 抗体を用いた WB を行うと，Fig. 2に示すように ELISA で陽性の血清は O157-LPS と強く反応した．

ついでこれらの患者血清のうち陽性と出た血清に対して今回開発した Ec-LPS アレイでの反応性を検討したところ，二次抗体に抗ヒト IgM 抗体または抗ヒト IgA 抗体を用いた場合には ELISA や WB の結果と同様に 1-1，2-1，3-2，4-2，5-2，6-1 に O157-LPS との反応性が見られた（Fig. 3）．一方，抗ヒト IgG 抗体を用いた場合はスポットした LPS のほとんどが反応し

ており，ELISA と同様に診断がつきにくかった．

考察

1996 年堺市を中心とした大規模な集団食中毒事件が発生し，その原因が大腸菌 O157 による EHEC 感染症であった

^７）

．これを契機に従来の伝染病予防法の大幅改定となり，「感染症新法」が成立した．わが国ではその後も毎年多くの EHEC 感染症が報告され，医療機関や地方衛生研究所などが対応に追われている．

当初 EHEC はそのほとんどが大腸菌 O157 によるものと思われていたのに対し，わが国においても最近 O 157 だけでなく多くの O 血清群株が EHEC 感染症を起こすことが報告されている

^２）^８）

．すなわち様々な O 血清群株が志賀毒素を産生することから，その結果，

EHEC の O 血清群を明らかにする必要が生じてきて

いる．原則として O 血清群は EHEC 患者糞便から分

離された大腸菌の O 血清型別で診断されるが，抗生

物質の投与によっての EHEC が分離できない場合や

(6)

発症時の菌分離が行われなかった場合などでは原因となった EHEC の O 血清群が不明になることがある．

そこで我々は患者血清中の抗体価を測定することによる診断法の開発を試みた．大腸菌 LPS に対する血中抗体価の測定は Chart ら

^９）

による WB と ELISA での方法が報告されており，その後 Greatorex &

Thorne

^１０）

は HUS 患者の O157-LPS に対する抗体の産生を明らかにしている．その他 Blocking ELISA

^１１）

，ラテックス凝集法

^１２）

などの測定法での大腸菌 LPS に対する抗体価測定を行っているが，臨床診断のための方法としては浸透していない．また菅原ら

^１３）

は大腸菌 O 157-LPS を抗原として患者血清中の IgM 抗体の測定をすることによる大腸菌 O157 感染の診断を ELISA 法で開発した．最近になり，Tsutsumi ら

^１４）

は腸管出血性大腸菌症患者血清と 3 種類の大腸菌 LPS との反応性を ELISA や WB で行い，IgM や IgA 抗体の測定によって診断可能であることを報告している．また Thirumalapura ら

^１５）

は我々と同じようにメンブレンを用いたマイクロアレイを作成してグラム陰性細菌の同定に用いることを検討している．我々は日本で腸管出血性大腸菌感染症の原因として報告されている O 血清型を含んだ 58 種の O 血清型大腸菌からそれぞれ LPS を抽出し，それを抗原として ELISA，WB，Ec- LPS アレイで患者血清との反応を試み，患者の感染した大腸菌の O 血清群に対する抗体（IgG，IgM，

IgA）を検出した．ELISA はアレイと長所は似ているが，血清や二次抗体のウェルへのスポットに手間がかかることや，判定の際，ELISA リーダーが必要となる点などが欠点である．WB は抗体がどの成分と反応しているかは視覚的で判断できるが，SDS-PAGE とメンブレンへの転写を行わなければならないこと，

抗原のサンプル数が限られていることから，手間，費用，時間がかかることが欠点である．それに比較してドットブロットを基本とした Ec-LPS アレイは他の方法よりも操作法が簡単であり，判定が視覚でおこなえることおよび経済性や時間短縮などが大きな長所である．以上のことを考慮すると，このアレイは非常に有用な手段であることが分かる．但しこの方法における IgG 抗体の測定では O 血清群の診断はできず，IgM または IgA 抗体の測定によって診断が可能であるが，

感染初期には陽性とはならず，患者によって異なるが，

診断のためには発症後 5 日以上必要と思われる．今回は HUS 患者血清に対する診断を行ったが，このアレイによる診断は下痢原性大腸菌感染症全般に応用することが可能である．

この実験遂行に当たり実験補助をしていただいた澤田石千佳子氏に深謝いたします．

文献

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Development of O-serogroup Serodiagnosis for Patients with Hemolytic Uremic Syndrome by Ec-LPS Array Ken-ichi AMANO

^１）^２）

, Jun YATSUYANAGI

^２）

& Shioko SAITO

^２）

1)

Bioscience Education Research Center, Akita University,

²⁾

Ec-LPS アレイを利用した溶血性尿毒症症候群患者の 大腸菌 O 血清群診断