反応で1 ウイルスしか検出できず，マルチプレックス

博 士 （ 農 学 ） 杉 山 俊 平

学 位 論 文 題 名

マクロアレイ技術を利用した植物病原体検出法の研究開発 学位論文内容の要旨

  ジ ャ ガ イ モ と 食 用 ユ り は 共 に 北 海 道 に お い て 重 要 な 作 物 で あ る ． ジ ャ ガ イ モ は 北 海 道 の 基 幹 作 物 で あ り ， 食 用 ユ り は 国 内 生 産 量 の95％ が 道 内 で 生 産 さ れ て い る ． こ れ ら の 栽 培 に お い て ， シ ス ト セ ン チ ュ ウ や ウ イ ル ス に よ る 病 害 が 特 に 問 題 と な っ て お り ， 効 果 的 な 防 除 に は 早 期 発 見 が 重 要 で あ る こ と か ら ， 正 確 で 簡 便 な 病 原 体 の 検 出 法 が 求 め ら れ て い る ． 本 研 究 で は ，cDNAマ ク ロ ア レ イ を 用 い て ， ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ の 検 出 と 重 複 感 染 ユ り か ら の 高 感 度 ウ イ ル ス 検 出 法 を 研 究 ・ 開 発 し た ． 以 下 に 主 要 な 研 究 成 果 に つ い て 要 約 す る ．

1） 作 物 健 康 セ ン サ ー を 用 い た ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ の 検 出   有 害 な 植 物 寄 生 性 線 虫 の 中 で も ， ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ （Gl obodera rostochゴenざ1S，Potato cyst nematode， 以 下PCN)は ， 世 界 的 に 極 め て 重 要 な 農 害 虫 の ー っ で あ り ， 国 内 で も ，1972年 に 初 め て 北 海 道 で 発 見 さ れ て 以 来 ， そ の 発 生 地 は 徐 々 に 拡 大 し ， ジ ャ ガ イ モ や ト マ ト な ど ナ ス 科 作 物 の 根 に 寄 生 し て 甚 大 な 被 害 を 及 ば し て い る ， 本 線 虫 は ， 卵 を 保 護 す る シ ス ト （ 包 嚢 ） と い う 形 で ， 寄 主 作 物 を 栽 培 し な く て も10年 以 上 生 存 す る た め ， 一 度 圃 場 に 侵 入 ・ 繁 殖 し て し ま う と 根 絶 が 非 常 に 困 難 で あ り ， 早 期 発 見 す る こ と が 重 要 で あ る ． 従 来 の 線 虫 検 診 法 に は 植 え 付 け 前 の 「 土 壌 検 診 」 と 栽 培 中 の

「 植 物 検 診 」 が あ る ． 土 壌 検 診 は 土 壌 中 か ら シ ス ト を 分 離 し て 顕 微 鏡 下 で 形 態 に よ り 同 定 す る 検 診 法 で あ り ， 植 物 検 診 は 圃 場 か ら 抜 き 取 っ た 作 物 の 根 を 肉 眼 で 観 察 し て シ ス ト の 有 無 を 調 べ る 方 法 で あ る ， し か し ， 土 壌 検 診 は 熟 練 技 術 と 専 門 知 識 を 要 す る 方 法 で あ り ， 植 物 検 診 は こ の 方 法 で 検 出 さ れ た 時 点 で は 既 に 圃 場 全 体 に 蔓 延 し て い る こ と が 多 い ． こ れ ら の 理 由 に よ り 農 業 現 場 で は 検 診 実 施 率 は か な り 低 い の が 実 状 で あ る ．   病 原 体 の 出 現 な ど 環 境 が 悪 化 し て も 移 動 で き な い 植 物 は 環 境 変 化 に 対 し て 鋭 敏 で な け れ ば な ら ず ， わ ず か な 環 境 変 化 を も 感 知 す る 能 カ を 特 に 発 達 さ せ て き た ． 本 研 究 で は ， こ の よ う な 植 物 の 環 境 を 感 知 す る 能 カ を 利 用 し た 土 壌 環 境 診 断 シ ス テ ム ， 作 物 健 康 セ ン サ ー （Plant Health Sensor， 以 下PHS） を 開 発 し た ． 本 診 断 法 で は ， ま ず ， 検 査 土 壌 に

「 韜 と り 植 物 」 を 植 え ， 一 週 間 後cDNAマ ク ロ ア レ イ を 用 い て そ の 植 物 の 遺 伝 子 発 現 を 解 析 し ， 得 ら れ た 植 物 遺 伝 子 の 発 現 デ ー タ に 基 づ い て 土 壌 中 に 存 在 す る 病 原 体 や 養 分 な ど を 診 断 す る ．

  PCNを 診 断 す るPHSを 開 発 す る た め ， ま ず ，2期 幼 虫 を 接 種 し た 罹 病 性 ト マ ト （ 強 力 米 寿 ） の 根 に っ い てDNAマ イ ク ロ ア レ イ 法 とSAGE法 に よ る 網 羅 的 な 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 い ， 線 虫 感 染 に よ り 発 現 誘 導 さ れ る ト マ ト 遺 伝 子 を 選 抜 し た ．PHSに 利 用 す る 遺 伝 子 を 決 定 す る た め ， ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 や 半 定 量RT―PCRに よ り 選 抜 遺 伝 子 のPCN感 染 応 答 性 を 詳 細 に 検 討 し た ． さ ら に ， 卵 密 度 が 段 階 的 に 異 な るPCN卵 液 を 接 種 し た 強 力 米 寿 に つ い て

選 抜 遺 伝 子 の 発 現 解 析 を 行 い ， 発 現 が 卵 密 度 と 相 関 を 示 し た 遺 伝 子 をcDNAマ ク ロ ア レ イ に 搭 載 し た ，

  次 に ， 様 々 な 提 供 元 か ら 収 集 し た 一 般 圃 場112サ ン プ ル の 土 壌 で 栽 培 し た 強 力 米 寿 苗 に つ い て ，PHSと し て 作 製 し たcDNAマ ク ロ ア レ イ を 用 い て 遺 伝 子 発 現 を 解 析 し た ， そ れ ら 遺 伝 子 の 発 現 比 と 従 来 の 土 壌 診 断 （ ふ る い 分 け シ ス ト 流 し 法 ） の 結 果 を 総 合 評 価 し て，

各 遺 伝 子 の 発 現 比 に 対 し て 閾 値 を 設 定 し ，PCN検 診 の た め の 診 断 基 準 を 作 成 し た ， そ の 結 果 ， 実 際 の 圃 場 土 の 診 断 結 果 は 従 来 の 卵 密 度 検 査 の 結 果 と よ く 一 致 し た ． 一 部 の ダ イ ズ シ ス ト セ ン チ ュ ウ 汚 染 土 壌 でPCN用 搭 載 遺 伝 子 の 発 現 が 観 察 さ れ た が ， そ の 後PCNに 特 異 的 に 反 応 す る 遺 伝 子 を 同 定 す る こ と が で き ， シ ス ト セ ン チ ュ ウ 種 の 判 別 が 可 能 と な っ た ． さ ら に ，PCNを 接 種 し た 抵 抗 性 ト マ ト 品 種 （ ド ク タ ーK） が 強 力 米 寿 と は 異 な る 遺 伝 子 発 現 パ タ ー ン を 示 し た た め ， こ れ を 利 用 し てPCN診 断 を ダ ブ ル チ ェ ッ ク す る こ と が 可 能 と な っ た ，

  本 研 究 で 開 発 し た 作 物 健 康 セ ン サ ー は ， 病 原 体 の 種 類 に 応 じ た 特 殊 な 設 備 や 熟 練 技 術 や 専 門 知 識 な ど を 必 要 と し な い 新 し い 土 壌 診 断 シ ス テ ム で あ る ． ま た ， 病 原 体 感 染 を 植 物 が 感 知 し て 初 め て 検 出 す る た め ， 土 壌 微 生 物 の 病 原 性 を 反 映 し た 診 断 が 可 能 で あ り ， 病 原 体 の 死 骸 な ど を 誤 っ て 検 出 し な い こ と も 本 診 断 法 の 特 長 で あ る ．

2）cDNAマ ク ロ ア レ イ と マ イ ク ロ チ ュ ー ブ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 用 い た 重 複 感 染 ウ イ ルスの簡易高 感度検出法

    食 用 ユ り の 栽 培 に お い て ， 最 も 被 害 の 大 き い 病 害 は ウ イ ル ス 病 で あ り ， 減 収 や 品 質 低 下 を も た ら す ， 一 般 に ， ウ イ ル ス は 薬 剤 に よ る 防 除 が 不 可 能 で あ る た め ， 茎 頂 培 養 に よ る ウ イ ル ス フ リ ー 球 根 の 増 殖 が 重 要 で あ る ． ウ イ ル ス フ リ ー 球 根 の 安 定 し た 生 産 と 供 給 を 実 現 す る た め に は ， 正 確 で 簡 便 な ウ イ ル ス 診 断 法 が 求 め ら れ て い る ，   北 海 道 の 食 用 ユ り で こ れ ま で 報 告 さ れ て い る ウ イ ル ス は ，CMV（Cucumber mosaic virus) とLSV（Lil．ysymp tomless  virus)，LMoV（工ゴJヅmotと1e virus)，PIAMV（Plan tago asゴatica mosalcvirus)の4種 の ウ イ ル ス で あ る ． こ れ ら の ウ イ ル ス が 単 独 あ る い は 重 複 感 染 し ， 感 染 し た ウ イ ル ス 種 が 多 い ほ ど 葉 の モ ザ イ ク や え そ ， 奇 形 な ど の 症 状 は 重 篤 化 す る ，   本 研 究 で は ，4種 類 の ユ リ ウ イ ル ス を 同 時 に 高 感 度 で 検 出 す る た め に ，cDNAマ ク ロ ア レ イ を 利 用 し た 簡 便 た ウ イ ル ス 検 出 法 を 開 発 し た ， 本 検 出 法 で は ， ま ず ，in vitro transcriptionを 利 用 し た シ ス テ ム に よ り ， ユ リ 組 織 か ら 抽 出 し た 全RNAか ら ビ オ チ ン 標 識cRNAプ ロ ー ブ を 合 成 す る た め に ユ リ ウ イ ル スRNAを 増 幅 す る ． 次 に ， そ れ を 各 ウ イ ル ス のcDNAを 固 定 し た マ ク ロ ア レ イ と ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン し て ， 酵 素 基 質 を 加 え 発 色 反 応 に よ り 検 出 す る ． 増 幅 さ れ たcRNAが 非 特 異 的 に ハ イ ブ リ ダ イ ズ し な い よ う に ， プ ラ イ マ ー は ア レ イ 上 の ウ イ ル ス 配 列 と 一 致 し な い よ う に 特 別 に 設 計 さ れ て い る ． ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で は ， 安 価 な ア ル ミ ブ ロ ッ ク の み を 用 い て 簡 便 な 操 作 で 行 え る よ う に 考 案 し た マ イ ク ロ チ ュ ー ブ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 （ 以 下MTH)を 開 発 し た ． こ の ウ イ ル ス 検 出 法 に よ り ， ユ り の 葉 と 球 根 の 根 か ら4種 類 の ユ リ ウ イ ル ス を 効 率 よ く 検 出 す る こ と が で き た ． RTーPCRと 検 出 感 度 を 比 較 し た 場 合 に は25〜125倍 検 出 感 度 が 低 か っ た も の の ，DAS―ELISA法 と 比 較 す る と ，ELISAと 同 程 度 ， ウ イ ル ス に よ っ て はELISA以 上 の 検 出 感度を示した ，

  従 来 の ウ イ ル ス 検 出 法 と し て ，RT−PCRは 高 感 度 で あ る が 非 特 異 バ ン ド が 問 題 と な る こ と が 多 い ． ま た ，ELISAの 感 度 と 特 異 性 は 抗 体 の 質 に 依 る 部 分 が 大 き く ， 非 特 異 反 応 （ 交 差 反 応 ） が 問 題 と な る こ と が 少 な く な ぃ ． ま た ， ウ イ ル ス の 同 時 検 出 に 関 し て は ，ELISA

ー 1241 ‑

は

反応で1 ウイルスしか検出できず，マルチプレックス

―PCR は非特異バンド出現の 可能性が増える，これらの従来法と比較して，本研究で開発したウイルス検出法は複数 ウイルスを同時検出する簡便な方法とし．て，十分な検出感度と高い特異性をもち，ウイ ル ス の 重 複 感 染 が 問 題 と な る 植 物 で は 特 に 有 効 な ウ イ ル ス 検 出 法 で あ る ．

‑ 1242―

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

マクロアレイ技術を利用した植物病原体検出法の研究開発

  cDNAマ ク ロ ア レ イ は 数 十 〜 数 百 の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 同 時 に 解 析 す る 安 価 な 方 法 と し て 利 用 さ れ て い る ． 本 研 究 で は ，cDNAマ ク 口 ア レ イ を 用 い て ， ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ の 検 出 法 と ユ り か ら の 高 感 度 ウ イ ル ス 検 出 法 を 研 究 ・ 開 発 し た ， 以 下 に 主 要 な 研 究 成 果 に つ い て 要 約 す る ．

1） 作 物 健 康 セ ン サ ー を 用 い た ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ の 検 出   ジ ャ ガ イ モ シ ス ト セ ン チ ュ ウ （Globoぬra rostoピ ヵノensis，Potato CYst nematode， 以 下PCN） は ，1972年 に 国 内 で 初 め て 北 海 道 に お い て 発 見 さ れ て 以 来 ， そ の 発 生 地 は 徐 々 に 拡 大 し ， ナ ス 科 作 物 の 根 に 寄 生 し て 甚 大 な 被 害 を 及 ぽ し て い る ． シ ス ト と い う 殻 で 保 護 さ れ た 卵 は 長 期 生 存 す る た め 根 絶 が 困 難 で あ り ， 早 期 に 発 見 す る こ と が 重 要 で あ る ， 従 来 の 土 壌 検 診 で は 土 壌 中 か ら シ ス ト を 分 離 し て 顕 微 鏡 下 で 形 態 に よ り 同 定 す る が ， 熟 練 と 専 門 知 識 を 要 す た め ， 農 業 現 場 で の 実 施 率 は 低 い の が 実 状 で あ る ．   本 研 究 で は ， 植 物 の 優 れ た 環 境 感 知 能 カ を 利 用 し た 土 壌 環 境 診 断 シ ス テ ム ， 作 物 健 康 セ ン サ ー （Plant｀Health Sensor， 以 下PHS） を 開 発 し た ． ま ず ， 検 査 土 壌 に 「 お と り 植 物 」 を 植 え ， 一 週 間 後cDNAマ ク 口 ア レ イ を 用 い て 植 物 の 遺 伝 子 発 現 を 解 析 し ， そ の 発 現 デ ー タ に 基 づ い て 土 壌 中 の 病 原 体 や 養 分 な ど を 診 断 す る ，

  線 虫 感 染 に 反 応 す る 遺 伝 子 を 選 抜 す る た め ，2期 幼 虫 を 接 種 し た 罹 病 性 ト マ ト （ 強 力 米 寿 ） の 根 に つ い て 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析(DNAマ イ ク ロ ア レ イ 法 とSAGE法 ） を 行 い ， ノ ー ザ ン ブ 口 ッ ト 解 析 や 半 定 量RT―PCRに よ り 選 抜 遺 伝 子 の 感 染 応 答 性 を 詳 細 に 検 討 し た ， さ ら に ， 段 階 的 に 異 な る 卵 数 を 接 種 し た 強 力 米 寿 に つ い て 選 抜 遺 伝 子 の 発 現 を 解 析 し ， 線 虫 感 染 に 最 も 鋭 敏 に 反 応 し た 遺 伝 子 を マ ク ロ ア レ イ に 搭 載 し た ．   次 に ， 一 般 圃 場 土112サ ン プ ル をPHSに よ り 解 析 し ， 各 遺 伝 子 の 発 現 比 と 従 来 の 土 壌

ー1243―

税 郎

章 剛

一

田 田

澤 飼

増 上

金 犬

授 授

授 教

教

教 教

准 助

査 査

査 査

主 副

副 副

検 診 結 果 を 総 合 評 価 し て ，PCN検 診 の た め の 診 断 基 準 を 作 成 し た ． 設 定 し た 診 断 基 準 に よ る 診 断 結 果 は 従 来 の 土 壌 検 診 結 果 と よ く 一 致 し た ．

  本 研 究 で 開 発 し た 作 物 健 康 セ ン サ ー は ； 病 原 体 の 種 類 に 応 じ た 設 備 や 熟 練 技 術 や 専 門 知 識 を 必 要 と し な い 新 し い 土 壌 診 断 シ ス テ ム で あ る ． ま た ， 病 原 体 感 染 を 植 物 が 感 知 し て 初 め て 検 出 す る た め ， 土 壌 微 生 物 の 病 原 性 を 反 映 し た 診 断 が 可 能 で あ り ， 病 原 体 の 死 骸 な ど を 誤 っ て 検 出 し な い こ と も 本 診 断 法 の 特 長 で あ る ．

2）cDNAマ ク ロ ア レ イ と マ イ ク ロ チ ュ ー ブ ハ イ プ1」 ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 用 い た 重 複 感 染 ウ イ ルスの簡易高感度検出法

    食 用 ユ1」 栽 培 に お い て 最 も 被 害 の 大 き い 病 害 は ウ イ ル ス 病 で あ り ， 減 収や 品質 低下 を も た ら す ， ウ イ ル ス フ リ ー 球 根 の 安 定 し た 生 産 の た め に ， 正 確 で 簡 便 な ウ イ ル ス 診 断 法 が求められている．．

  本 研 究 で は ， 北 海 道 の 食 用 ユ り で こ れ ま で 報 告 さ れ て い る4種 の ウ イ ル ス （Cucumber mosaノピvirusとLiノヅsymptomlessレノrus，Liノヅmottleゲノrus，Plantago asiatノピ占mosaノピ virus)を 同 時 に 検 出 す る た めcDNAマ ク ロ ア レ イ を 利 用 し た 簡 便 な ウ イ ル ス 検 出 法 を 開 発 し た ， ま ず ，in vitro transcriptionを 利 用 し た シ ス テ ム に よ り ， ユ リ 組 織 か ら 抽 出 し た 全RNAか ら ユ リ ウ イ ル スRNAの ピ オ チ ン 標 識cRNAプ ロ ー プ を 増 幅 す る ， 次 に ， そ れ を 各 ウ イ ル ス のcDNAを 固 定 し た マ ク ロ ア レ イ と ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン し て ， 酵 素 基 質 を 加 え 発 色 反 応 に よ り 検 出 す ， る ． 増 幅 さ れ たcRNAが 非 特 異 的 に ハ イ プ リ ダ イ ズ し な い よ う に ， プ ラ イ マ ー は ア レ イ 上 の ウ イ ル ス 配 列 と 一 致 し な い よ う に 特 別 に 設 計 さ れ て し ゝ る ， ま た ， 安 価 な ア ル ミ ブ ロ ッ ク の み を 用 い て 簡 便 な 操 作 で 行 え る よ う に 考 案 し た マ イ ク ロ チ ュ ー プ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 を 開 発 し た ． こ の ウ イ ル ス 検 出 法 に よ り ， ユ り の 葉 と 球 根 の 根 か ら4種 類 の ユ リ ウ イ ル ス を 効 率 よ く 検 出 す る こ と が で き た ． 検 出 感 度 は RT―PCRよ り25〜125倍 感 度 が 低 か っ た も の の ，ELISA法 と 同 程 度 ， ウ イ ル ス に よ っ て は それ以上の感度を示した，

  従 来 の ウ イ ル ス 検 出 法 と し て ，RT―PCRは 高 感 度 で あ る が 非 特 異 バ ン ド が 問 題 と な る こ と が 多 く ，ELISAも 交 差 反 応 が 問 題 と な る こ と が 少 な く な い ， さ ら に ， ウ イ ル ス の 同 時 検 出 に 関 し て は ，ELISAは1反 応 で1ウ イ ル ス し か 検 出 で き ず ， マ ル チ プ レ ッ ク スRTーPCR は 非 特 異 バ ン ド 出 現 の 可 能 性 が 増 え る ． こ れ ら の 従 来 法 と 比 較 し て ， 本 研 究 で 開 発 し た ウ イ ル ス 検 出 法 は 複 数 ウ イ ル ス を 同 時 検 出 す る 簡 便 な 方 法 と し て ， 十 分 な 検 出 感 度 と 高 い 特 異 性 を も ち ， ウ イ ル ス の 重 複 感 染 が 問 題 と な る 植 物 で は 特 に 有 効 な ウ イ ル ス 検 出 法 である．

  よ っ て ， 審 査 員 一 同 は ， 杉 山 俊 平 氏 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有するものと認めた，

    ―1244一