岡 山 医 誌 (1994) 106, 811∼823
ラ ッ ト虚 血性 急 性 腎不 全 に お け る
腎 内 メ タ ロ チ オ ネ イ ンの 誘 導
岡山大 学 医学部 麻酔 ・蘇 生 学教 室(指 導:平 川方 久教 授)
原
田
圭
子
(平成6年3月22日 受 稿)Key words:虚 血 性 急 性 腎 不 全,メ タ ロ チ オ ネ イ ン, in situ hybridization, 免 疫 組 織 化 学 染 色 緒 言 メ タ ロ チ オ ネ イ ン(metallothionein: MT) は,低 分 子 量(分 子 量 約6,500)蛋 白質 で そ の 構 成 ア ミノ 酸 の3分 の1を シ ス テ イ ン が 占め る1). ま た,亜 鉛,銅,カ ド ミウ ム な ど の 重 金 属 と シ ス テ イ ン の チ オ ー ル 基 を介 し て 結 合 す る細 胞 内 金 属 結 合 性 蛋 白で あ り,亜 鉛 チ オ ネ イ ン と し て は 通 常1分 子 中7個 の亜 鉛 原 子 を含 む1). MTは,上 述 の 重 金 属 に よ っ て 誘 導 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る が1),そ れ 以 外 に 寒 冷2),運 動 負 荷2),放 射 線 照 射3),感 染(エ ン ド トキ シ ン 等)4,5), 創 傷2)な ど の ス ト レ ス に よ っ て 主 に 肝,腎 に 誘 導 合 成 さ れ る.さ ら に,グ ル コ コ ル チ コ イ ド6,7), グ ル カ ゴ ン1),サ イ ト カ イ ン8,9)等 の 体 液 性 因 子 に よ っ て もMTは,肝 に 誘 導 さ れ る. MTの 生 理 的 役 割 は い ま だ 定 説 は な い が,重 金 属 に よ っ て 誘 導 さ れ る こ とか ら従 来 よ り カ ド ミウ ム な ど の 重 金 属 の 解 毒,ま た,亜 鉛,銅 な ど必 須 微 量 元 素 の 代 謝 に 関 わ っ て い る と され て きた1).しか し,近 年, MTは 活 性 酸 素 の 除 去10,11), 細 胞 の 増 殖 ・分 化 等 に 関 与 して い る と い う報 告 が な さ れ12-15),細 胞 傷 害 に 対 して 何 らか の 防 御 的 役 割 を 果 た して い る可 能 性 が 考 え られ て い る. 水 川 は,ラ ッ トを 用 い て 腎 血 流 を60分 間 遮 断 した 後 再 灌 流 を行 う と腎 内 にMTが 誘 導 合 成 さ れ る こ と を示 し,虚 血 性 急 性 腎 不 全(ischemic acute renal failure: IARF)に 対 す る 生 体 防 御
反 応 にMTが 何 らか の 役 割 を果 た して い る こ と を示 唆 し た16). 本 研 究 は, IARFに お け るMTの 役 割 を明 ら か に す る 目 的 で,ラ ッ トIARFモ デ ル を作 成 し, 腎 内MT遺 伝 子 の 発 現 とそ の 部 位 な ら び にMT の 局 在 部 位 を検 索 し,腎 の 傷 害 部 位 とMTの 発 現 部 位 の 関 連 を 明 らか に し て, IARFに お け る 腎MT誘 導 の 意 義 に つ い て 検 討 した. 材 料 と 方 法 1.材 料 実 験 は,体 重200-300gのSprague-Dawley 系 雄 性 ラ ッ ト(Char1es-River社)を 用 い た.水 道 水 お よ び 飼 料(MF,オ リエ ン タ ル 酵 母,東 京) を 自 由 飲 食 させ て1週 間 飼 育 した 後 実 験 に 供 し た,雄 性 白 色 家 兎 は 須 藤 生 物 材 料 セ ン タ ー(静 岡)よ り購 入 した.腎 動 脈 の 遮 断 に 用 い た ク リ ップ は(TKS-1, 40g,協 和 時 計 工 業,市 川) よ り購 入 し た. マ ウ スMT-IIcDNA(105bpコ ー ド領 域)は, R. D. Palmiter博 士(Washington大 学, Seat
tle)よ り 提 供 を 受 け た17), Guanidine isoth iocyanate(GIT), cesium chloride(CsCl), sodium dodesyl sulfate(SDS), bovine serum albumin(BSA), formamideお よ びdithioth
reitol(DTT)は, Bethesda Research Labora tories(Rockvill, MD)よ り購 入 し た. Formalde hyde(37%),酵 母t-RNA(type X), ribonu clease A(RNase A),サ ケ 精 子DNA, poly-L-lysineは, Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)よ り購 入 し た. Nsi Iお よ びEco RIは,
宝 酒 造(京 都)よ り購 入 し た. pGEM 7 Zf(+)は,
Promega Corp. (Madison, WI)よ り, dextrane sulfateは, Pharmacia Corp. (Uppsala, Sweden)よ り, paraformaldehydeは, Merck Corp. (Darmstadt, Germany)よ り購 入 し た. T7お よ びSR 6 RNA polymerase, [α-32P]
UTP(800Ci/nmol), [α-35S]UTP(400Ci/ nmol)は, Amersham Lab. (Buckinghamshire, England)よ り 購 入 し た.そ の 他 の 試 薬 類 は,す
べ て 試 薬 特 級 を 使 用 し た. RNA調 製 用 溶 液 は, す べ て フ ィ ル ター(Millex-GV, 0.22μm, Millipore Corp., Bedford, MA)で 濾 過 す る か,オ ー ト
ク レ ー ブ(121℃, 20分)し た 後 用 い た. Intensifying screenは, E. I. Du Pont De Nemours & Co. (Wilmington, DE)よ り, X
線 フ ィ ル ムX-Omat AR,写 真 用 乳 剤NTB-2, 現 像 液D-19は, Eastman Kodak Co. (Roches ter, NY)よ り 購 入 し た. Northern blot用 ナ
イ ロ ン メ ン ブ レ ン は, GENE SCREEN PLUS (New England Nuclear, Boston, MA)を 使 用 し た.超 遠 心 分 離 器 は 日 立 工 機(株)のSCP-70 Hを,ロ ー タ ー は, RPS-40Tを 使 用 し た. RNA 抽 出 の た め の 細 胞 破 砕 は, Polytron(PCU-1, Kinematica GmbH, Luzern, Switzerland)を
用 い た.
MTの 分 取 に 用 い たSephadex G-50お よ び DEAE-Sephadex A-25は, Pharmacia(Upp sala, Sweden)製 を 使 用 し た. Western blot用 tranferメ ン ブ レ ン は, PVDFを 用 い,第1化 学 薬 品(東 京)よ り 購 入 し た. Block Aceは 大 日 本 製 薬(大 阪)製 を, Tween20は,東 京 化 成 (東 京)製 を 使 用 し た. 抗MT抗 体 の 調 製 に 用 い た 完 全 フ ロ イ ン トア ジ ュ バ ン トお よ び 不 完 全 フ ロ イ ン ト ア ジ ュ バ ン
トは, Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) よ り購 入 し た. 免 疫 組 織 化 学 染 色 は,ヒ ス トフ ァ イ ンSAB-PO(R)キ ッ ト を用 い,ニ チ レ イ(東 京)よ り購 入 し た. 15%中 性 緩 衝 ホ ル マ リン 液(pH 7.4) は,和 光 純 薬(大 阪)よ り購 入 し た. 2.方 法 1)動 物 の 処 置 実 験 は ラ ッ ト腎 を虚 血 状 態 に し た 虚 血 群 と擬 手 術(sham op)を し た対 照 群 に 分 け て行 っ た. 腎 虚 血 の 作 成 は,ペ ン トバ ル ビ ター ル60mg/kg体 重 当 り(B. W.)筋 注 麻 酔 下 に,ラ ッ ト背 部 を 切 開 し,腎 周 囲 の 結 合 組 織 を剥 離 し た の ち,両 側 の 腎 を 腎 門 部 で 腎 動 静 脈 と 尿 管 を一 括 し て ク リ ッ プ で 遮 断 し た.腎 は,肉 眼 的 に 虚 血 に 陥 っ た の を 確 認 し て か ら後 腹 膜 腔 に も ど し温 虚 血 状 態 に し, 60分 後 ク リ ップ を取 り除 き 血 流 を再 開 さ せ た.対 照 のsham opは,腎 の 虚 血 操 作 以 外 は,虚 血 ラ ッ トと全 て 同 じ操 作 を行 っ た.虚 血 群 は,操 作 終 了 後3, 6, 9, 12, 24時 間 目 お よ び 1, 2, 3, 4, 7日 目に 犠 死 せ しめ 腎 を 摘 出 し, Northern blot法 に よ りMTmRNAを 測 定 し
た.ま た 組 織 学 的 検 討 の た め に 虚 血 操 作 終 了 後 1日 目に ラ ッ トを犠 死 せ しめ 腎 を摘 出 し, in situ hybridization法(ISH法)に よ りMTmRNA の 発 現 部 位 を,免 疫 組 織 化 学 染 色 法 に よ りMT の 局 在 部 位 を検 索 した.対 照 群 は, sham op操 作 終 了 後 虚 血 群 と 同 様 の 処 理 を 行 っ た.な お
Northern blot法 に よ るMTmRNA誘 導 の 検 索 に お い て は 無 処 置 の ラ ッ ト も対 照 と して 用 い た.虚 血 群 お よび対 照 群 は,血 中 尿 素 窒 素(BUN) お よび 血 清 ク レア チ ニ ン(Cre)値 の 測 定 の た め に, 1, 2, 3, 4, 7日 目 に 血 液 を 採 取 し た(図 1). 2)血 中 尿 素 窒 素(BUN)お よ び 血 清 ク レ ア チ ニ ン(Cre)値 の 測 定 採 取 し た 血 液 か ら血 清 を分 離 し, BUN値 をウ レ ア ー ゼ ・イ ン ドフ ェ ノー ル 法 でCre値 をJaffe 法 を用 い て 測 定 した.な お,正 常 値 は,処 置 前 の 値 を 用 い た. 3) MTmRNA誘 導 お よ びMTmRNA発 現 部 位 の 検 討 (1) RNA probeの 作 製
Northern blot用antisense RNA probeは, pGEM 7 Zf(+)にsubclosingし た マ ウ
スMT-IIcDNAを, Nsi Iでlinear templateと し て 合 成 し た. Template DNAに, [α-32P]UTP, T 7 RNA polymeraseを 加 え 反 応 さ せ, 32Pで 標
識 し たantisense RNA probeを 得 た. ISH用probeは, [α-32P]UTPの か わ り に [α-35S]UTPを 用 い て 同 様 に 合 成 し た.別 に sense RNA probeは, Eco RIでlinear tem
虚 血 性 急 性 腎 不 全 に お け る 腎 内 メ タ ロ チ オ ネ イ ン 813
図1 腎組 織 お よび 血液 採 取 時 間
↑ は 腎組 織 採 取 時 間, 〓 は 血 液採 取 時 間 を示 す.
合 成 し た.
(2) Northern blot法 に よ るMTmRNAの 分 析
全RNAの 調 製 は, Chirgwinら の 方 法 に 準 じて 行 っ た18).経 時 的 に 摘 出 した 腎 は, 9倍 容(V/ W)のGIT緩 衝 液(4M guanidine isoth iocyanate, 25mM sodium acetate, 120mM M2-mercaptoethanol)(pH 6.0)を 加 え 破 砕 し
た 後,こ の 破 砕 溶 液 をCsCl緩 衝 液(5.7M cesium chloride, 25mM sodium acetate)(pH 6.0)に 重 層 し, 174,000×gで20時 間(20℃) の 超 遠 心 分 離 を 行 い 全RNAを 沈 澱 さ せ 採 取 し た.採 取 し た 全RNA量 は, 260nmの 吸 光 度 に よ り 定 量 し た. こ の 全RNA(20μg)は,変 性 ア ガ ロ ー ス ゲ ル (1.2% agaroseformaldehyde)で 電 気 泳 動 を 行 い,泳 動 分 離 後,ゲ ル か らNorthern blot用 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ンGENE SCREEN PLUSに transferを 行 っ た. Transferは, 10×SSC(1.5 M sodium chloride, 150mM sodium citrate)
(pH 7.0)を 用 い て,毛 細 管 法 に よ り行 い, trasfer 終 了 後 こ の メ ン ブ レ ン は, 80℃ で2時 間 処 理 し た. Hybridizationは,メ ンブ レ ンにhybridization 溶 液(50% formamide, 6×SSC溶 液,変 性 酵 母t-RNA 50μg/ml, 1% SDS, 1×106dpm/ mlのRNA probe)を 加 え42℃ で18時 間 行 っ た. メ ン ブ レ ン の 洗 浄 は, 68℃ に て2×SSC溶 液(1 % SDSを 含 む)か ら徐 々 に 塩 濃 度 を下 げ,漸 次1×SSC溶 液(1% SDSを 含 む)で 洗 浄 し た.こ の 操 作 の 後,室 温 で2×SSC溶 液 に よ り 2回 洗 浄 し, 1μg/mlのRNase Aで5分 か ら15 分 間 処 理 し た.処 理 の 時 間 は, GM管 で500cpm を 目安 と し た. 洗 浄 後 の メ ン ブ レ ン は, intensifying screenを 使 用 し て-70℃ で48時 間X線 フ ィ ル ム に 感 光 さ せ,オ ー ト ラ ジ オ グ ラ ム を 作 製 し た. (3) in situ hybridization法(ISH法)に よ るMT発 現 部 位 の 検 索 ISH法 は, Nojiら の 方 法 に 準 じた19).腎 虚 血 群 と対 照 群 は,操 作 終 了 後1日 目に ペ ン トバ ル ビ タ ー ル 筋 注 麻 酔 下 に 左 室 よ り カ ニ ュ レ ー シ ョ ン を行 い,リ ン 酸 緩 衝 液(pH 7.4)(PBS)で 還 流 脱 血 し た 後, 4% paraformaldehydeを 含 む PBSで 還 流 し組 織 の 固 定 を行 っ た.腎 は,還 流 後 直 ち に 摘 出 し, ISH法 用 の 試 料 と し た. ISH用 の 試 料 は,常 法 に 従 っ て, ethanol系 列 お よ びtolueneに て 脱 水 し,パ ラ フ ィ ン 包 埋 を行 っ た 後5μmの 厚 さ で 連 続 切 片 を作 製 し,あ ら か じめpoly-L-lysineを 塗 布 し た ス ラ イ ドグ ラ ス に 展 開 し た.こ の 連 続 切 片 は, xylene, eth anol系 列 に よ り脱 パ ラ フ ィ ン,加 水 後, PBS溶 液 で 洗 浄 した. 洗 浄 切 片 は, hybridization溶 液(50% for mamide, 2×SSC, 10% dextran sulfate, 0.25
% BSA, tRNA 1mg/ml,変 性 サ ケ 精 子DNA 1mg/ml, 100mM DTT,約5×104dpm RNA probe)に よ り50℃ で16時 間 反 応 さ せ た.反 応 後, 洗 浄 溶 液(2×SSC, 50% formamide, 10mM DTT)に よ り50℃ で20分 間 の 洗 浄 を3回 行 い, RNase A 20μg/mlで30分 間 処 理 した.次 に, 0.1× SSCで10分 間 の 洗 浄 を3回 行 い, ethanol系 列 で 脱 水 後 風 乾 し た. 風 乾 し た 切 片 は,写 真 用 乳 剤(Kodak NTB
-2)に 浸 し,乾 燥 後 暗 室 内 で 露 光 した.露 光 後 現 像 し,定 着,水 洗 後hematoxyline-eosin (H-E)染 色 を 施 し た.ま た,連 続 切 片 を 用 い て 作 成 した試 料 の 一 部 は, ISH処 理 を行 わず にH-E 染 色 を施 し た. 4)免 疫 組 織 化 学 染 色 法 に よ るMT局 在 部 位 の 検 索 (1) MTの 分 離,精 製 と 抗MT抗 体 の 調 製 免 疫 組 織 化 学 染 色 に 用 い る 抗MT抗 体 作 成 の た め に,ま ずMTの 分 離,精 製 を 行 っ た.亜 鉛(15mg/kg)(B. W.)を ラ ッ トに投 与 し, 18時 間 後 ペ ン トバ ル ビ ター ル 筋 注 麻 酔 下 に肝 を 摘 出 し た.摘 出 し た 肝 は,湿 重 量 の2倍 容(V/W) の10mM Tris-HCl(pH 7.4)を 加 え,氷 冷 下 にPotter-Elvejhem型 ホ モ ジナ イザ ー に て 細 胞 を破 砕 し,遠 心 分 離 後 細 胞 質 可 溶 性 画 分 を得 た. こ の 肝 の 細 胞 質 可 溶 性 画 分 か ら, Sephadex G -50に よ る ゲ ル 濾 過 とDEAE-Sephadex A-25 に よ る イ オ ン交 換 ク ロマ トグ ラ ム を用 い てMT -I, MT-IIを 分 離,精 製 し た,精 製 したMT-IIは, 15% SDSポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 に てsingle bandで あ る こ と を確 認 し た. 次 に,ラ ッ トMTに 対 す る 抗 血 清 を得 る た め に,精 製 したMT-IIを 抗 原 と し て 完 全 フ ロ イ ン トア ジ ュ バ ン ト と と もに 皮 下 注 射 し,白 色 家 兎 を初 回 免 疫 した. 4週 間 後 に 不 完 全 フ ロ イ ン トア ジ ュ バ ン トと と も にMT-IIで 追 加 免 疫 し た.以 降2週 間 毎 に 計3回 繰 り返 し充 分 な抗 体 価 が 得 ら れ る まで 追 加 免 疫 し た.抗MT抗 体 価 の 測 定 は, MT-IIを 固 相 化 抗 原 と し,第 二 抗 体 と し て ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ヤ ギ抗 ウ サ ギIgG ポ リ ク ロー ナ ル 抗 体 を 用 い たELISA法 で行 っ た.充 分 な 抗 体 価 が 得 ら れ た こ と を確 認 し,ウ サ ギ の 耳 の 中 心 動 脈 か ら採 血,血 清 分 離 し,ウ サ ギ抗 ラ ッ トMT抗 血 清 を得 た.こ の 抗 血 清 に 含 ま れ るMTポ リ ク ロー ナ ル 抗 体 のMTに 対 す る特 異 性 は, Western blot法 を 用 い て 確 認 し た. (2) Western blot法 MTの 抗 体 に 対 す る特 異 性 を確 認 す る た め の Western blot用 の 試 料 を得 る ため に 以 下 の 操 作 を 行 っ た. MTの 分 離,精 製 時 と同 様 に 亜 鉛(15 mg/kg)(B. W.)を ラ ッ トに 投 与 し, 18時 間 後 腎 を摘 出 し た.腎 は,前 述 の ご と く処 理 し,細 胞 質 可 溶 性 画 分 を さ ら に 遠 心 分 離 し て 得 られ た 上 清 をWestern blot用 の 試 料 と し た. 試 料 お よ び 精 製 し たMT-IIは, 15% SDSポ リア ク ル ア ミ ドゲ ル に て 電 気 泳 動 を行 い,泳 動 分 離 後,ゲ ル か らWestern blot用 メ ン ブ レ ン (PVDF)に 蛋 白 のtranferを 行 っ た. Tranfer し た メ ン ブ レ ン は,以 下 の 方 法 で 免 疫 染 色 を行 っ た.メ ン ブ レ ン は,非 特 異 的 結 合 を 防 ぐた め Block Ace原 液 に てBlockingを 行 っ た.次 に 調 製 した ウ サ ギ 抗 ラ ッ トMTポ リ ク ロー ナ ル 抗 血 清(1000倍 希 釈)を 第 一 抗 体 と して 反 応 させ た 後, 0.1% Tween 20を 含 むPBSに て 洗 浄 し た.続 い て メ ン ブ レ ン は,第 二 抗 体 と してperox idase標 識 した ヤ ギ 抗 ウ サ ギIgGポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と 反 応 させ た 後 再 び 洗 浄 し,直 前 に 調 製 したDAB溶 液(5mg 3, 3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 100mg NiCl2, 5μl-30%過 酸 化 水 素 水/10ml 50mM Tris-HCl)(pH 7.6) に よ り発 色 させ た.以 上 の 結 果 は,メ ン ブ レ ン 上 で 腎 の 細 胞 質 可 溶 性 画 分 か ら得 た 試 料 を 添 加 し たlaneに はsingle bandが 認 め ら れ,そ の 泳 動 部 位 は,精 製 し たMT-II bandの 位 置 と 同 一 で あ る こ と を確 認 し た . (3)Streptavidin-Biotin法(SAB法)に よ るMT局 在 部 位 の 検 索 腎 虚 血 群 と対 照 群 は,操 作 終 了 後 第1日 目 に ペ ン トバ ル ビ タ-ル 麻 酔 下 に 開 腹 し,腹 部 大 動 脈 に カ テ ー テ ル を挿 入 し, PBS溶 液 に て 還 流 脱 血 した.次 に ラ ッ トは,下 大 静 脈 よ り, 15%中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン液 に て 還 流 固 定 し た.還 流 固 定 後 直 ち に 腎 臓 を摘 出 し免 疫 組 織 化 学 染 色 用 の 試 料 と し た. 試 料 は 常 法 に 従 っ て,水 洗 後, ethanol系 列, tolueneに て 脱 水 し,パ ラ フ ィ ン 包 埋 を行 っ た 後 5μmの 厚 さで 連 続 切 片 を作 製 し,あ らか じめpoly-L-lysineを 塗 布 し た ス ラ イ ドグ ラ ス に 展 開 した. こ の 切 片 は, xyleneお よ びethanol系 列 で 脱 パ ラ フ ィ ン,加 水 後, PBS溶 液 で10分 間 洗 浄 し, 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 し た. 免 疫 組 織 化 学 染 色 は, SAB法 に よ る酵 素 抗 体 法 を施 行 し た.薄 切 切 片 は, 3%過 酸 化 水 素 水 に 浸 し 内 因 性peroxidase活 性 を不 活 化 し,次
虚 血性 急性 腎不全 に おけ る腎 内 メ タロチ オネ イ ン
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に10%ヤ ギ正 常 血 清 と 反 応 させ 組 織 の 非 特 異 結 合 を 除 い た. PBSで 洗 浄 後 切 片 は,第 一 抗 体 と し て ウサ ギ抗 ラ ッ トMTポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (PBSで400倍 希 釈)と4℃ の 湿 箱 中 で1晩 反 応 さ せ た.切 片 の 一 部 は,対 照 抗 体 と し て正 常 ウ サ ギ 血 清 を使 用 し た.洗 浄 後,第 二 抗 体 と し て ビオ チ ン標 識 ヤ ギ抗 ウサ ギIgGに て10分 間37℃ で 反 応 させ た 後,さ らに,酵 素 試 薬 で あ るperox idase標 識streptavidinと 反 応 さ せ た.発 色 は,DAB溶 液(5mg 3, 3´-diaminobenzidine tetra hydrochloride/10ml 0.61 M Tris-HCl)(pH 7.4)に 使 用 直 前3%過 酸 化 水 素 水 を加 え 室 温 に て 施 行 し た.精 製 水 で 水 洗 後,核 染 色 と して メ チ ル グ リー ン染 色 を行 っ た.切 片 は,水 洗,脱 水, xyleneに よ る 透 徹 後,非 水 溶 性 封 入 剤 (ENTELLAN〓 neu)に て 封 入 し た. 5)統 計 学 的 検 索 BUNお よ びCre値 に つ い て,対 照 群 と 腎虚 図2 血 清 ク レ ア チ ニ ン(Creatinine)お よ び 血 中 尿 素 窒 素(BUN)値 の 変 動 各 点 は そ れ ぞ れ,腎 虚 血 群(○,各n=7),対 照 群(sham op)(□,各n=7),無 処 置 群(■,各n= 7)の 平 均 値 ± 標 準 誤 差 を 示 す. *; P<0.05, **; P<0.01
図3 腎虚 血後 再 灌 流1日 目のH-E染 色像 ▲ は硝 子 様 物 質, ↑ は 出血 部位 を示 す.左 ×45,右 ×89 血 群 の 間 に つ い てStudent'st-testを 用 い て 比 較 し, p<0.05を 有 意 と し た.
結
果
1. BUN, Cre値 の 経 時 的 変 化 お よ び 虚 血 腎 のH・E染 色 に よ る 組 織 学 的 所 見 虚 血 に よ る腎 機 能 障 害 を評 価 す るために, BUN お よ びCre値 を 経 時 的 に 測 定 し た. BUNお よ びCre値 は, 60分 間 腎 虚 血 の 後 再 還 流 し た1日 目か ら3日 目 ま で 著 し い 高 値 を示 し た. 4日 目 以 降BUNお よ びCre値 と も低 下 し は じめ, 7日 目に は ほ ぼ 対 照 値(Sham op群 の7日 目) に 復 し た(図2).ま たH・E染 色 に よ る組 織 所 見 で は 虚 血 後1日 目に 腎 髄 質 外 層 か ら 皮 質 に か け て の 尿 細 管 細 胞 の 壊 死,断 裂,円 柱 形 成 な ど虚 血 性 腎 傷 害 に 特 徴 的 な 所 見 が 認 め ら れ る と と もに,間 質 部 に は 多 量 の 出 血 が み られ た(図 3).以 上 の 結 果 よ りIARFが 発 生 し た こ と を 確 認 し た. 2. Northern blot法 に よ る60分 間 腎 虚 血 後 の 腎MTmRNA誘 導 の 経 時 的 変 化 Hybridizationは, 32Pで ラ ベ ル したMT-II antisense RNAをprobeと し て 用 い た.対 照 (A-lane 1, B-lane 1)は,無 処 理 の ラ ッ ト腎 を 用 い た. MTmRNA誘 導 は,虚 血 腎 で 再 灌 流 3時 間 目 か ら 認 め ら れ, 6, 9, 12, 24時 間 目 ま で徐 々 に 増 加 し,再 灌 流2日 目 に 最 大 とな っ た. さ ら に3日 目 ま で, MTmRNAの 強 い 誘 導 が, 認 め られ た が, 4日 目以 降 は 次 第 に 低 下 し, 7 日 目 に は 対 照 レベ ル に な っ た(図4).一 方, sham opラ ッ トに も処 置 後24時 間 にMTmRNA誘 導図4 Northern blot法 に よ る 腎MTmRNA誘 導 の経 時的 変 化
(A) lane 1無 処 置; lane 2虚 血 後 再 灌 流3時 間 目; lane 3同6時 間 目: lane 4同9時 間 目; lane 5同12時 間 目; lane 6同24時 間 目 (B) lane 1無 処 置; lane 2虚 血 後 再 灌 流1日 目; lane 3同2日 目; lane 4同3日 目; lane 5同4日 目; lane 6同7日 目 左 側 上 下 の 矢 印 は,そ れ ぞ れ, 28Sお よ び18S のrRNAの 位 置 を,右 側 の 矢 印 は, MTmRNAの 位 置 を 示 す. は,認 め られ た が 虚 血 群 に 比 べ て 誘 導 レベ ル は 低 か っ た. 3. ISH法 に よ る60分 間 腎 虚 血 後 の 腎 MTmRNA発 現 部 位 図5-A, B, Cは, 35Sで ラベ ル し た , MT-II
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図5 腎 に お け るMT遺 伝 子 の 発 現(in situ hybridization法)
(A)対 照(sham op), (B)虚 血 後 再 灌 流1日 目, (C)(B)に 示 し た 枠 線 内 の 強 拡 大 像 で は 尿 細 間 細 胞 上 に 強 い シ グ ナ ル が 認 め ら れ た, (D)虚 血 後 再 灌 流1日 目sense probe. A×18, B×18, C×89, D×18
antisense RNAをprobeと して 用 い て 行 っ た ISH法 に よ るMTmRNAの 発 現 部 位 を示 す. 対 照 群 の 組 織 の 明 視 野 に よ る観 察 で は,腎 の 組 織 傷 害 は 認 め ら れ ず,暗 視 野 に よ る 観 察 で は MTmRNAの 局 在 を示 す 感 光 銀 粒 子(シ グナ ル) の 分 布 は,び 慢 性 で 輝 度 も低 く, MT遺 伝 子 の 発 現 が 弱 い こ とが 示 さ れ た(図5-A).腎 虚 血 後 1日 目の ラ ッ ト組 織 の 明 視 野 に よ る観 察 で は, 髄 質 外 層 か ら皮 質 に か け て の 尿 細 管 細 胞 の 著 し い 傷 害 が 認 め られ た.同 じ組 織 の 暗 視 野 に よ る 観 察 で はMTmRNAの 存 在 を 示 す 強 い シ グナ ル が,ネ フ ロ ン構 造 の う ち 髄 質 外 層 か ら一 部 皮 質 に か け て の 尿 細 管 細 胞 上 に 特 異 的 に 認 め ら れ た.し か し,糸 球 体,血 液 内 皮 な ど尿 細 管 細 胞 以 外 の 部 位 に は,特 異 的 な シ グ ナ ル は認 め られ な か っ た(図5-B).尿 細 管 細 胞 の 強 拡 大 像 で は, MTmRNAの 局 在 を示 す シ グ ナ ル が,髄 質 外 層 の 尿 細 管 細 胞 上 に 高 密 度 に 集 積 し て い るの を確 認 し た(図5-C).
MTmRNAに 対 す るantisense probeの 特 異 性 を 調 べ る た め にMT-II sense RNA probeを 用 い たISH法 で は虚 血 腎 組 織 上 に 有 意 な シ グ ナ ル は 認 め られ な か っ た(図5-D).
3.免 疫 組 織化 学染 色法(SAB法)に
よ る60
分 間 腎虚 血後 の 腎MT局
在部 位
図6は,ウ
サ ギ抗 ラ ッ トMTポ
リクロー ナ ル
抗体 を用 いて行 った免疫 組織 化 学染 色法 に よる
MTの
局 在部 位 を示 す.対 照群 組 織の観 察 で は,
MTの
存 在 を示す 免疫 染 色反 応 は,組 織 全体 に
弱 く, MTの
特 異 的局 在 は,認 め られ なか っ た
(図6-B).虚
血 腎組織 の観 察 では, MTの
存
在 を示す 強 陽性 の免 疫染 色 反 応が,髄 質 外 層か
ら一部 皮 質 にか け ての 尿細 管 細胞 の細 胞 質 に特
異的 に認 め られた.し か し,糸 球体,血 管 内皮
な ど尿 細 管細 胞 以外 の部 位 に は,特 異 的 な染 色
反応 は認 め られ なか った(図6-A).
抗 ラ ッ トMT抗
体 の特 異 性 を調べ るため に対
照 抗体 として正常 ウサ ギ血 清 に よ る免 疫組 織 化
学 染 色 を施 した虚 血 腎組 織 上 には染 色 反応 を認
め なか った.
考 察 生 体 に 外 傷2),手 術20)な どの 浸 襲 を加 え た り, 運 動2),高 温 環 境2)な ど の ス トレ ス を与 え る と体 内 亜 鉛 分 布 の 変 動 に加 え て 肝 にMTが,誘 導 さ れ る こ とが 知 ら れ て い る.さ ら に,エ ン ド トキ シ ン投 与4,5),放射 線 照 射3)な どの 全 身 的 ス トレス は,腎 に もMTを 誘 導 す る. 水 川 は 腎 の60分 間 虚 血-再 灌 流 に よ るIARF ラ ッ トを 作 製 し,蛋 白 レベ ル で のMT誘 導 を検 討 して い る.そ の 結 果,虚 血 群 で は,虚 血 後1 日 目 よ り腎 に お い て もMTの 有 意 な 増 加 が み ら れ, 3日 目 に最 大 とな る が,対 照 群 のMT誘 導 は 虚 血 群 に 比 べ て 著 し く低 い こ と を報 告 して い る16). 本 研 究 で は 腎 内MTmRNAの 誘 導 は,虚 血 後3時 間 目 と い う早 期 よ りみ られ,続 く24時 間 目か ら3日 目 ま で 強 い誘 導 が 持 続 し て 認 め ら れ た(図3).し か し,別 に 行 っ た 対 照 群 の 腎 に も 虚 血 群 の 腎 よ りは 低 い がMTmRNAの 誘 導 を 図6 腎に お け るMTの 局 在(免 疫 組 織化 学染 色 法)(A)虚血 後再 灌 流1日 目で は尿 細 管 細 胞 上 に 強 陽性 の免 疫 染 色 反 応 が 認 め られ た, (B)対照(sham op). A× 89, B×89
虚 血 性 急 性 腎不 全 に お け る 腎 内 メ タ ロ チ オ ネ イ ン 819 図7 LARF時 の 腎尿 細 管 細 胞 の 反応 お よびMTの 機 能 認 め た.こ れ ら の 事 実 は, IARFラ ッ トに お け る 腎 内MT誘 導 に は,全 身 的 ス トレ ス の み な ら ず 虚 血 再 灌 流 と い う 腎 へ の 直 接 的 ス トレス が 腎 MT遺 伝 子 の 活 性 化 に 関 わ っ て い る こ と を示 唆 し て い る. 体 液 性 因 子 の 一 つ で あ る グ ル コ コ ル チ コ イ ド は, MTの 直 接 誘 導 物 質 で あ る の で6,7), IARF に 陥 っ た ラ ッ トで は,全 身 性 ス ト レ ス に よ り副 腎 皮 質 か ら遊 離 し た グ ル コ コ ル チ コ イ ドが 腎 内 MT誘 導 に 関 与 す る こ とが 考 え られ る.ま た, 炎 症 細 胞 よ り放 出 され る イ ン タ ー ロ イ キ ン1(IL -1),イ ン タ ー ロ イ キ ン6(IL-6)な ど の サ イ ト カ イ ン が, MTの 誘 導 を調 節 す る こ とが 報 告 さ れ て い る8,9). IARFで は サ イ トカ イ ン産 生 細 胞 の ひ とつ で あ る 好 中球 が 腎 傷 害 発 生 の 一 翼 を 担 っ て い る と い わ れ て い る21).し た が っ で, IARF に お け る 腎 内MT誘 導 に は サ イ トカ イ ンが 関 わ っ て い る可 能 性 が あ る.し か し, IL-1は 腎 にMT を 誘 導 し な い と い うCousinsら の 報 告22)や, IL -6, TNFは,肝 に の みMTを 誘 導 す る とい う Andrewsら の 報 告23)が示 す よ うに 腎 内MT誘 導 に お け る サ イ トカ イ ン の 関 与 を 否 定 す る 見 解 も あ る(図7). 60分 間 虚 血 後 再 灌 流1日 目 の 腎 組 織 所 見 で は29), MTmRNAとMTは,い ず れ も 主 に 髄 質 外 層 の 尿 細 管 細 胞 に 認 め ち れ た(図5-B,図 6-A).一 方,対 照 群 で は, MTmRNAとMT の 有 意 な 局 在 は 認 め られ な か っ た(図5-A,図 6-B).こ の よ うにMT遺 伝 子 発 現 パ ター ン お よ びMT局 在 様 式 が 虚 血 腎 と対 照 腎 で 著 し く異 な る こ とは,虚 血 再 灌 流 に よ る腎 の 直 接 的 ス ト レ スが 腎 内MT誘 導 に 関 わ っ て い る こ とを 示 唆 して い る.さ らに, MTmRNAとMTが 同 じ 髄 質 外 層 尿 細 管 細 胞 に 観 察 さ れ た こ と は,虚 血 再 灌 流 に よ っ て 尿 細 管 細 胞 内 に 誘 導 さ れ た MTmRNAが 同 じ部 位 でMTへ 翻 訳 され た こ と を示 唆 して い る. そ れ で は,尿 細 管 細 胞 に誘 導 さ れ たMTは, IARFに お い て い か な る役 割 を 果 た し て い る の で あ ろ うか.虚 血 後 再 灌 流 す る こ とに よ る 細 胞 障 害 の 一 因 と して キサ ンチ ン-オ キ シダ ーゼ 系25,26), あ る い は 好 中 球 か ら発 生 す る21)free radicalが あ げ ら れ る. MTは, in vitroでfree radical scavenger作 用 を有 す る こ とが 報 告 され て い る11). ま た, in vivoで も亜 鉛 の 前 投 与 に よ っ て 組 織 内 にMTを 誘 導 し て お く と,四 塩 化 炭 素 の 脂 質 過
酸 化 反 応 に よ る 肝 毒 性 が 軽 減 さ れ る と 言 わ れ て い る27).本 研 究 でMTmRNAは,虚 血 後 再 灌 流 早 期 よ り著 し い誘 導 が み られ,か つ 虚 血 に よ り傷 害 を うけ や す い 髄 質 外 層 か ら皮 質 に か け て の 尿 細 管 細 胞 に み られ た こ とか らMTは,尿 細 管 細 胞 をfree radicalに よ る さ ら な る傷 害 か ら 防御 して い る の か も しれ な い(図7). IARFは,可 逆 性 病 態 で あ り28,29)井川 ら は ラ ッ トの60分 間虚 血 後 再 灌 流 す る こ とに よるIARF の 回 復 期 にDNA合 成 が 皮 質 に 比 べ て 髄 質 外 層 で著 しい こ と を報 告 し て い る30).また, Schacdies ら も ラ ッ ト35分 間 虚 血 後 再 灌 流 す る と細 胞 増 殖 が 髄 質 外 層 で 最 も著 しい こ とを示 し て い る31).さ ら に,腎 の 再 生 因 子 の ひ とつ で あ る 上 皮 成 長 因 子 も髄 質 外 層 に 局 在 す る こ とが 明 らか と な っ て い る32).こ れ らの 報 告 が 示 す よ うに,近 年 虚 血 後 の 腎 再 生 に お い て 髄 質 外 層 の 尿 細 管 細 胞 が 大 き な役 割 を 果 た し て い る こ とが 報 告 さ れ て い る. 一 方,亜 鉛 はRNAポ リメ ラー ゼ やDNAポ リ メ ラー ゼ な ど の核 酸 合 成 に 関 係 す る 酵 素 や 蛋 白 合 成 に 関 与 す る 酵 素 の 重 要 な 構 成 要 素 で あ る33). In vitroでMTに 結 合 し た亜 鉛 は,ア ル ドラ ー ゼ,ア ル カ リフ ォ ス フ ァ ター ゼ な どの 亜 鉛 酵 素 を 活 性 化 させ る34).ま た, in vivoで は ラ ッ ト肝 部 分 切 除 後 の 再 生 肝 で のMT増 加 が 報 告 さ れ12), Ohtakeら は,肝 切 除 後 に 肝 内 で 増 加 し て い るZn-MTが, DNA合 成 の 調 節 に 必 要 な 酵 素 の 合 成 や 活 性 の 調 節 に 重 要 な役 割 を果 た し て い る と して い る15).した が っ て 髄 質 外 層 の 尿 細 管 細 胞 に 誘 導 され たMTは,組 織 の 再 生 に 必 要 な亜 鉛 酵 素 に 亜 鉛 を供 給 す る こ と に よ っ て 細 胞 の修 復 や 再 生 に 役 立 っ て い る もの と考 え られ る (図7). 結 論 1.本 研 究 は,ラ ッ ト腎 の60分 間 虚 血 後 再 灌 流 す る こ と に よ り急 性 腎 不 全 を作 成 し,腎 内 に 誘 導 さ れ るMTmRNAをNorthern blot法 で, MT遺 伝 子 発 現 部 位 をin situ hybridization法
で,さ らにMTの 局 在 部 位 を免 疫 組 織 化 学 染 色 法 に よ り検 索 しIARFに お け る 腎MT誘 導 の 意 義 に つ い て 検 討 した. 2.腎MTmRNAは, 60分 間 虚 血 後 再 灌 流 3時 間 目 よ り誘 導 が 認 め ら れ,続 く24時 間 目 ま で 誘 導 は 徐 々 に 増 加 し3日 目 ま で 強 く認 め られ た が, 4日 目以 降 漸 減 し, 7日 目 に は 対 照 レ ベ ル とな っ た. 3. 60分 間 虚 血 後 再 灌 流1日 目の 腎 組 織 所 見 で は, MTmRNAとMTは,い ず れ も主 に 髄 質 外 層 の 尿 細 管 細 胞 に 認 め ら れ た.
4.亜
鉛結 合 性 蛋 白で あ るMTは,活
性酵 素
除去 作用 や亜 鉛 酵素 へ の亜 鉛 の供 給 に よ り虚 血
性 腎傷害 に対す る細胞 の保 護,修 復 お よび再 生
に 関わ っ てい るこ とが 示 唆 され た.
稿 を終 え るに 臨 み,終 始 懇 切 な る ご指 導,御 校 閲 を賜 りま した岡 山大 学 医 学部 麻 酔.蘇 生 学 教 室 平 川 方 久教 授 に深 謝 致 し ます.ま た,終 始 直接 の 御 指 導 と御 鞭 達 を い た だい た岡 山大 学 歯 学部 口腔 生 化 学敬 室 谷 口茂 彦 教 授 な らび に徳 島大 学工 学 部 野地 澄 晴教 授 に 謝 意 を表 します.さ らに 本研 究 の遂 行 に 当 り, 貴 重 な御 助 言 と御 協 力 をい た だ い た岡 山大 学 医 学 部 麻 酔 ・蘇 生 学教 室 山 田輝 夫 博 士,板 野義 太郎 博 士, 高 橋 徹博 士,多 賀 直 行博 士,日 高 秀 邦 先 生 な らびに 岡 山大 学 歯 学部 第二 保 存 学 教 室 明 貝文 夫先 生 に 心 よ り御 礼 申 し上 げ ます.文
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