Ettan Spot Picker
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．イントロダクション
Ettan Spot Pickerは自動的に二次元電気泳動ゲルからタンパク質を含んでいるポリアクリ ルアミドゲルプラグを切り出して、マイクロタイタープレートにプラグを移すように設計 されています。ゲルプラグは MALDI - TOF 質量分析解析前のプロセシング、処理に適し ています。Spot Picker はクーマシー(Coomassie)、銀あるいは SYPRO 色素による染色、 標識したタンパク質の二次元電気泳動ゲルに適応しています。ゲルはプラスチックに支持 されているもの、あるいはガラスの上に固定されているものを使用します。興味を持つス ポットは ImageMaster 2D Elite ゲルイメージ解析ソフトウェアを使って解析し、選択しま す。ゲル中には 1 対のリファレンスマーカーを設定し、そしてイメージ解析でそれを検出 します。これらのリファレンスマーカーはそれぞれのスポットのイメージ（ピクセル）X-Y,座標を Spot Picker で使用する mm（ミリメートル）ポジションに変えるために使われま す。ゲルから切り出されたプラグは 96 ウェルのマイクロタイタープレートの中に、溶液と ともに分配されます。Ettan Spot Picker は 8-18%のゲルから最高 9600 個のプラグを選ぶ ことができます。
1.1 Ettan Spot Pickerシステム
Ettan Spot Picker (Ettan Spot Picker)システムは次の物を含みます： ・ Ettan Spot Picker instrument.
・ Ettan Spot Picker Instrument Control Software, running under Windows NT operating system on a PC.
・ PC with frame grabber card for video display9.
1.2 実験の流れ
Ettan Spot Pickerで、ゲルプラグを選択するためには以下のステップを行います。 1．リファレンスマーカーを付けた裏打ちのあるゲルを準備する。または、プレキャストゲ ルを使って、スキャンする前にリファレンスマーカーを付ける。. 2．二次元電気泳動を行う。 3．電気泳動後のゲルを固定、染色する。 4．リファレンスマーカーを含めてゲルをスキャンする。 5．ゲルイメージの解析で選ぶべきタンパク質スポットを選択して、ピックリストファイル を作成する。
6． Ettan Spot Picker (Ettan Spot Picker) にゲルを載せ、そしてマイクロプレートに 選択されたゲルプラグを分配する。
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．ゲルの準備
2.1 はじめに
Ettan Spot Picker でのスポットピッキングでは支持付きのプレキャストゲル（たとえば Ettan DALT II precast gel 12.5）あるいはゲルキャスティングにおいてガラス支持の上 に固定されてゲルを使用します。GelBond PAG フィルムあるいは Bind – Silane 処理を行 ったガラスプレートの 2 つの異なったタイプの支持方法が使えます。 メモ： 蛍光性標識タンパク質のゲルをスキャンする場合、 GelBond はゲル支持として 使用できません。理由は GelBond が プラスチック材であり、すべてのプラスチックはス キャニングに使われる波長において強い蛍光を持っているためです。 2.2 ガラスプレートの処理 このガラスプレートの処理のプロトコルはアマシャムバイオサイエンスから発売されてい るバインドシラン用に最適化されています。 メモ： ガラスプレートは常にきれいなものを使用してください。ガラスプレートを再利 用する前に、5% Decon TM 90溶液でオーバーナイト浸してください。Decon はアルカリ性 質を持つのでプレートを長時間Decon溶液に浸けつづけると侵食されるおそれがあります。 1．処理するプレートを洗浄、乾燥します。前回のゲルの残りかすがプレートに付いていな いようにします。 2．バインドシラン溶液を用意します。 Reagent Quantity Ethanol 8 ml
Glacial Acetic acid 200 μl
Bind-Silane 10 μl Double distilled H 2 O 1.8 ml ＃遮光保存 3．2-4mL のバインドシラン溶液をガラスプレートに垂らし、毛羽たたないティッシュで 均一に展ばします。 4．ほこりがつかないようにして 1−1.5 時間風乾します。その後少量の蒸留水あるいはエ タノールで湿らせたティッシュでプレートを磨きます。
2.3 リファレンスマーカーの位置決め 2.3.1．ゲルキャスティング前にマーカーを付ける場合 1．スペーサーがマーカーにかぶらないようにするために、 ガラスプレート／GelBond の縁の上にスペーサーを置きま す。 2．スペーサーの縁に沿って中央にマーカーを置きます。こ の時タンパク質スポットパターンを妨害しないようにしま す。 3．もう一方の縁も同様に行います。 2.3.2ゲルスキャンの前の位置決め 支持が付いているゲルであれば、スキャン前にリファレンスマーカーを付けることも可能 です。 メモ：リファレンスマーカーを付加する時、支持ガラス（フィルム）の表面はマーカーが 接着できるように完全に乾いた状態にします。 2.4 二次元目 SDS-PAGE 通常の方法で行いますが、支持体が付いていますので、ゲル自身に表、裏があります。 Immobiline DryStripを載せる方向（たとえば左側に低い pH）に気を付けてください。
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．検出
3.1 ゲル染色 固定、染色のプロトコル例は巻末に付記します。 3.2 ゲルスキャン ゲルの撮影はできるだけ大きい解像度（100μm または 300dpi 以上）でスキャンします。4
．スポット選択とピックリストの作成
4.1 ImageMaster 2D EliteEttan Spot Pickerでピックするスポットを決定するピックリストを作成します。このセク ションでは、ImageMaster 2D Elite v3.00 を使って、ピックリストを作る方法を説明しま す。
4.1.1ピッカーヘッドサイズのシミュレート
Spot Detectionモードでカーソルを Draw Spots pen tool にします。300dpi でスキャンされたゲルイメー ジは、ペンサイズ 17 がピッカーヘッドの直径 1.4 ミ リに相当します。同様に、ペンサイズ 24 は 2.0 ミリ のピッカーヘッドに相当します。 4.1.2 マーカーの検出と編集 ゲルに付いている 2 つのリファレンスマーカーもス ポットとして検出します。正確なピッキングのためにマーカーの中心を正確に検出します。 良い例 悪い例
案 Grow Peaks tool を使った検出。
1．リファレンスマーカーの大きさよりわずかに小さいペンサイズを選択します。 2．リファレンスマーカーの上に中央にそれを置いて、スポットを描きます。
4.1.4 リファレンスマーカーの設定
リファレンスマーカーの ImageMaster のコメントフィールドに入力します。 1．メニューバーEdit: Edit Spot Field を選
択します。メインイメージウインドウを表 示します。
2．矢印ボタンでカーソルを矢にして、左側 のリファレンスマーカーをクリックします。
3．Edit Spot Field の Field の Comment を選びます。 4．「IR1」を入力し、Set を押します。 5．カーソルを矢にして、右側のリファレン スマーカーをクリックします。 6．「IR2」を入力し、Set を押します。 7．Done を押します。 8．「 IR1」と「IR2 」が Measurements Windowの Comment 欄にあることを確認します。 4.1.5 ピックリストを作る Measurements Windowからピックリストを作ります。 Measurements Windowのフォーマット。 1 メニューバーTools: Options を選択します。 Displayタブを選択します。Unit の Co-ordinate フィールドを Pixels にします。OK をクリックし ます。
2．Measurements Window をアクティブにしま す。
3．Select Fields ボタンで「Spot」,「Scaled Coords (Pixels)」、「Comment」フィールドだけを表示し ます。
4．図と同じ順番に表示していなかったら、「Move Up」、「Move Down」ボタンを使って並 べ直します。
4.1.6 ピックリストファイルの保存
1．Measurements Window をアクティブにして、メニューバーEdit: Copy To File を選び ます。.
3．ピックリストはテキスト（＊.txt）ファイルとしてセーブされます。 4.2 他の解析ソフトウェアからピックリストファイルを作る 必要とされるデータをマイクロソフト・エクセル(Microsoft Excel)に書き出されることがで きるなら、Ettan Spot のスポットピッキングのためにデータに使用できます。 1．マイクロソフト・エクセル(Microsoft Excel)に次のデータを書き出します。 スポット番号。 スポット中心の,座標（（ピクセル）。X、Y 座標は別のコラムにな っている必要があります。 2．正しい,フォーマットで表を作るためにエクセル(Excel)でデータを編集します。表は 4 つだけのコラムでなくてはいけません。コラムのタイトルは「id」,「X」,「Y」,「comment」 にします。「comment」コラムのリファレンスマーカーには IR1 と IR2 を付けてください。 3．Tab delimited Text(タブ区切りテキスト)型式(.txt)でファイルをセーブします。
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．スポットピッカーの準備
5.1 ピッカーヘッドの選択
ピッカーヘッドを変える場合はEttan Spot Picker Instrument Handbookを参照ください。
5.2 マイクロタイタープレートの設置
1．マイクロタイタープレートラックをスポットピッカーに置きます。
2．マイクロタイタープレートのポジション A1 を手前にプレートトレーに載せます。
5.3 ゲルの設置
1．ゲルトレーを Ettan Spot Picker (Ettan Spot Picker)に置きます。本体のガイドにト レーの足をフィットさせます。 2．ゲルトレーに水溶液（たとえば固定液、保存液あるいは超純水）を入れ、ゲルを置きま す。ゲル表面から約 2mm（ピッキング時間が長ければもっと）の高さまで溶液を満たしま す。 3．リファレンスマーカーがゲルトレー中心の平行線の中にくるように、ゲルを置きます（図 参照）。 4．トレーの中でゲルホルダーを組み立てます。
ゲルトレーにおけるゲルとリファレンスマーカーの正しいポジション。
5.4 Ettan Spot Pickerコントロールソフトウェア
1コントロールソフトウェアを起動します。
2．Homing of instrument というダイアログが現れます。 OKを押すとアームがホームポジションに戻ります。 警告！ピッカーヘッドとカメラは急に急速に動きます。
5.5システムセットアップ
メニューバーSystem: System Set up を選択します。
システムセットアップウインドウでは支持ガラス付きゲルの高さとマイクロタイタープレ ートの位置と高さを設定します。
新しいシステムセットアップパラメータが設定し終えたら Save & Exit ボタンを押します。 スクリーン右手の上に見える青い矢印は種々のポジションにピッカーヘッドを X／Y／Z 方 向に移動するために使われます。
5.5.1 ピッカーヘッド対ゲル Z ポジション 1ゲルのスポットが無い位置へピッカーヘッドを青い矢印で移動します。 2慎重にピッカーヘッドを下げます。 3ピッカーヘッドの先端部が支持ガラスに触れたら、ホルダーとピッカーヘッドピストンの 間の隙間を 1-2mm 程度にします。 A：ピッカーヘッドが高すぎる。 Ｂ：ピッカーヘッドはちょうどいい高さ。 C:ピッカーヘッドが低すぎる。
4ピッカーヘッドの Z ポジションが設定できたら、Set Gel-Z Coordinate ボタンを押します。
5.5.2 マイクロタイタープレートポジション
1．1 枚目のプレートの A-1 ポジションへピッカーヘッドを青い矢印で移動します。 2．慎重にピッカーヘッドを下げ、ピッカーヘッドの先端部がプレートの縁から 5 mm の高 さにします。
3．ピッカーヘッドの X/Y/Z ポジションが設定できたら、Set1(2,3,4)、Set Plate Z ボタンを 押します。
5.6 ピッキングパラメータ
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．ゲルのピッキング。
6.1 ピックリストのロード
1．Load Pick List ウインドウで、使用し ているリファレンスマーカー（黒色／白 色）のタイプを選択します。Load Pick Listボタンを押します。 2．ピックリストが表示されます。 3．ピックリストを選択します。Open を クリックします。 4．ピックリストデータはスクリーンに表示されま す。このリスト中の X と Y coordinate はリファレ ンスマーカーが見つかっていないので空です。 5．Next を押します。 6．必要なマイクロタイタープレ ートの枚数が表示されます。 7．Next を押します。
6.2 リファレンスマーカーの検出
1．Find First Marker (IR1.)ウインドウで、Move to First Markerボタンを押します。 2．ゲルの最初のリファレンスマーカー（IR1）ポジ ションに青い矢印でカメラを動かします。 3．リファレンスマーカーの全体がマーカー検出用 ウインドウで示される時、ウインドウの周囲は赤から緑色に変化します。 4．マーカー検出用ウインドウの下の Adjust ボタンを押します。そうするとリファレンス マーカーは Marker 検出用ウインドウで真 中に置かれます。 5．Next を押します。.
6．Find First Marker (IR1.)ウインドウで、 Move to First Markerボタンを押します。
7．2 つ目のリファレンスマーカー（IR2）のポジションに青い矢印でカメラを動かします。 8．3−5 を繰り返します。ソフトウェアはスポットがピック出来るように X／Y ポジション を計算します。
6.3 ゲルのピッキング
1Pick Spotsウインドウで Pick ボタンを押します。
2．Result File Location ウインドウでをピッキング結果の保存位置を選択します。 3．output directory name と user name を入力します。
4．Create Directory & Start Picking をクリックします。
6.4 マイクロタイタープレートを変える
ピッキングを 384 個以上行う場合ソフトウェアはユーザーにプレートを変えるよう指示し ます。
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．ピックリスト無しのピッキング
可視染色のゲルをマニュアルでクリックアンドピックします。白いプレートをゲルの下に 敷きます。 1．Initialize Instrument ボ タンと Go to Home ボタン を押します。 2． メ ニ ュ ー バ ー Tools: Click’n Pickを選択します。 3．ピッカーヘッドの大きさ を選択します。 4．最初のゲルプラグはマイ クロタイタープレートウェ ル A1 に落ちるように設定されます。しかしながら、これは任意に設定できます。 5．カメラのコントラスト、ブライトネスを調整して見やすくします。 6．右上のウインドウの四角をマウスポインタで、スポットのポジションに動かします。 7．マウスポインタを動かすことによってカメラの観点は移動します。興味あるゲルスポッ トとピッカーヘッドをあらわす円が重なったら Pick を押します。9 Staining protocols
9.1 Gel fixing
When the gel run is complete, the gel must be placed into a suitable fixing solution as soon as possible. This will minimize protein spot diffusion. As the gel is attached to a backing, a fix solution that dehydrates the gel too quickly will cause the gel to crack and peel away from the backing.
It is recommended that a solution of 30% ethanol and 7.5% acetic (ethanoic) acid is used to fix gels. The gels must be left in this fix solution for at least two hours. Leaving gels in this fix for longer periods of time appears to have no detrimental effects on the gel.
9.2 SYPRO ruby
1 Fix the gel in 10% methanol and 7% acetic acid for at least 2 hours.
2 Place the gel directly into a polypropylene, polycarbonate or polyvinyl chloride tray.
3 Cover the gel with the SYPRO ruby stain.
4 Incubate the gel for five hours - overnight with gentle shaking, protected from the light.
5 Pour off the SYPRO ruby.
6 Wash the gel in 10% methanol, 6% acetic acid for 1-2 hours.
9.3 SYPRO orange
1 Place the gel directly into a polypropylene, polycarbonate or polyvinyl chloride tray.
2 Prepare 250 ml of a 1:5000 dilution of SYPRO orange in 7.5% acetic acid.
3 Stain the gel for three hours - overnight with gentle shaking, protected from the light.
9.4 Silver staining compatible with MS analysis
9.4.1 Using the Modified PlusOne™ method
Allow at least 250 ml of each solution per gel.
All steps are carried out at room temperature with gentle shaking. Make all solutions freshly when needed. Make sure to use only double distilled (18.2 MΩ) water. All solutions should appear clear and colourless before they are poured onto the gel.
Table 9-1. Sensitizing solution.
Table 9-2. Silver nitrate solution (0.25%).
Table 9-3. Developing solution.
Reagent Quantity Ethanol 75 ml 5% Sodium thiosulphate solution 10 ml Sodium acetate 17 g ddH20 To a final volume of 250 ml Reagent Quantity Silver nitrate 625 mg ddH20 To a final volume of 250 ml Reagent Quantity Sodium carbonate 6.25 g Formaldehyde 100 µl ddH20 To a final volume of 250 ml
Table 9-4. Stop solution.
1 Sensitize the gel in Sensitizing solution for 30 min.
2 Rinse the gel three times in ddH2O, for five minutes each rinse. 3 Incubate in a 0.25% silver nitrate solution for 20 minutes. 4 Rinse the gel twice in ddH2O, for five minutes each rinse.
5 Incubate the gel in Developing solution for up to 10 minutes. If the staining is intense enough before the end of 10 minutes, move directly to the stop solution.
6 Pour the developing solution off and add the Stop solution, incubate for 10 minutes.
7 Rinse the gel three times in ddH2O, for five minutes each rinse. 8 Store the gel in ddH2O.
9.4.2 Using the Hoefer automatic gel stainer
The following method was developed for 1 mm thick 12% acrylamide gels. Other thickness and percentage acrylamide gels may require further optimization. The wash steps which follow the sensitizing and silver stages are crucial for a low background to the gel.
Make all solutions freshly when needed. Make sure to use only double distilled (18.2 MΩ) water. All solutions should appear clear and colourless before they are poured onto the gel.
Table 9-5. Sodium thiosulphate solution (0.2%). Reagent Quantity EDTA 3.65 g ddH20 To a final volume of 250 ml Reagent Quantity Sodium thiosulphate 500 mg ddH20 To a final volume of 250 ml
Table 9-6. Stop solution.
1 Fix the gel for 2 hours minimum in 30% ethanol, 7.5% acetic acid. 2 Wash the gel four times in 50% methanol, for eight minutes each
rinse.
3 Sensitize for 30 minutes in 0.2% sodium thiosulphate. 4 Wash the gel five times in ddH2O, for 20 minutes each rinse.
5 Incubate in 0.25% silver nitrate solution (Table 9-2 ) for 30 minutes.
6 Wash the gel twice in ddH2O, for four minutes each rinse. 7 Incubate in developing solution (Table 9-3 ) for 2-5 minutes. 8 Incubate in Stop solution (Table 9-6 ) for 60 minutes. 9 Store the gel in ddH2O.
9.5 Coomassie staining
1 Fix the gel for 60 minutes in 30% ethanol and 7.5% acetic acid. 2 Stain the gel for 60 minutes minimum in 0.1% Coomassie R-250 in
40% ethanol and 10% acetic acid. Use a Stock solution of 1 w/ vol.% Coomassie R-250 in 96% ethanol.
3 Destain the gel in 20% ethanol and 5% acetic acid. 4 Store the gel in ddH2O.
Reagent Quantity Glacial acetic (ethanoic) acid 12.5 ml
安全上のご注意
必ずお守りください
誤った取扱いをした場合に生じる危険や損害の程度を、 次の区分で説明しています。警告
誤った取扱いをした場合に、死亡や重傷を負う可 能性があるもの。注意
誤った取扱いをした場合 に、傷害または物的損害 が発生する可能性がある もの。 図記号の意味は次の通りです。禁 止
禁 止 は、してはいけない「禁止」を示 します。 は、必ず実行していただく 「強制」を示します。警告
禁 止
電源プラグの抜き差しにより、 運転を停止しない 火災・感電の原因になります。禁 止
電源コード・電源プラグを 傷つけない ●加工しない ●束ねない ●ねじらない ●折らない ●物をのせない ●加熱しない ●無理に曲げない 破損して火災・感電の原因になります。 根元まで 差込む 電源プラグのほこりを取り除き、 刃の根元まで確実に差込む 接続が不十分だと、隙間にほこりが付着 して火災・感電の原因になります。禁 止
本体を水に つけたり、 水をかけたり しない ショート・感電の原因になります。禁 止
使用時や使用直後（運転停止後約60
分間）は、操作に関係のない部 位には触れない 高温部に触れ、やけどの原因になります。禁 止
電源コードを途中で接続しない、 タコ足配線をしない 火災・感電・故障の原因になります。禁 止
修理・分解・改造はしない 火災・感電の原因になります。 指定の規格 取扱説明書に指定された規格の コンセントを使用する 指定された規格以外で使用すると 火災・感電の原因になります。禁 止
電源コードや電源プラグが傷んだ り、コンセントの差し込みがゆる いときは使わない 感電・ショート・発火の原因になります。 プラグを抜く 異常時は、運転を停止して電源プ ラグを抜く 異常のまま運転を続けると火災・感電の 原因になります。 このしおりには、弊社機器に関する一般的な注意事項を記載しています。取扱い の詳細は必ず製品添付の使用説明書をご覧ください。注意
禁 止
設置時は、次のような場所には 置かない ●不安定な場所 ●湿気やほこりの多い場所 ●油煙や湯気が当たる場所 ●直射日光の当たる場所 ●風雨のあたる場所 ●熱器具の近く ●高温になる場所 ●吸・排気口をふさぐような場所 このような場所に置くと、ショートや発 熱、電源コードの被膜が溶けるなどして、 火災や感電、故障、変形の原因になること があります。 水平 水平で丈夫な場所に設置する低温室で使用する場合の注意
電源を 入れない 装置を低温室から常温の場所に移 動させる場合、常温に設置後、装 置内の結露が無くなるまでシステ ム電源を入れない（状況により異 なるが、通常半日から一昼夜） 感電・漏電火災の原因になります。 電源を 入れておく 装置を低温環境下でご使用になる 場合、システム電源は常時入れて おく 低温環境下で長時間システムの電源を落 とした状態で放置すると、結露などによ り故障の原因になります。 ランプなどの消耗品はOFFにしておくと、 劣化を防ぐことができます。弊社製品についてのお問合せ （バイオダイレクトライン）
TEL : 03-5331-9336
受付時間
9
:
00
∼
17
:
30
土・日・祝日、弊社指定休業日、年末年始を除く
禁 止
ぬれた手で電源プラグを抜き差し しない 感電の原因になります。 プラグを持つ 電源プラグを持ってまっすぐ引き 抜く ななめに引き抜いたり、コードを持って 抜 く と、 プ ラ グ の 刃 や 芯 線 が 破 損 し て ショート・感電・発火の原因になります。www.gelifesciences.co.jp
■製品技術情報に関して
■機器アフターサービス
■納期／在庫お問合せ
注） お問合せに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させて いただく場合があります。 注） アナログ回線等で番号選択ができない場合はそのままお待ちください。オペレーターにつながります。弊社 Web サイト ▲サポート ▲FAQ （製品 Q&A）
または、
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▲▲lifesciences-ac.com
