デノスマブ毒性試験の概要文目次 1. まとめ単回投与毒性試験反復投与毒性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) サルの 1 ヵ月反復投与試験サルの 6/12ヵ月反復投与試験遺伝毒性試験...10

(1)

2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ 1

1. まとめ...3 2. 単回投与毒性試験 ...4 3. 反復投与毒性試験（トキシコキネティクス評価を含む） ...4 3.1 サルの 1 ヵ月反復投与試験...5 3.2 サルの 6/12 ヵ月反復投与試験...7 4. 遺伝毒性試験...10 5. がん原性試験（トキシコキネティクス評価を含む）...10 6. 生殖発生毒性試験（用量設定試験及びトキシコキネティクス評価を含む）...10 6.1 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 ...10 6.2 胚・胎児発生に関する試験... 11 6.3 出生前及び出生後の発生に関する試験... 11 6.4 新生児を用いた試験...13 7. 局所刺激性試験...13 8. その他の毒性試験（実施している場合） ...13 8.1 抗原性試験 ...13 8.2 免疫毒性試験 ...13 8.3 毒性発現の機序に関する試験...14 8.4 依存性試験 ...14 8.5 不純物の毒性試験 ...14 8.6 その他の試験 ...16 9. 考察及び結論...17 10. 参考文献 ...18

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ

略号一覧

略号略していない表現（英）略していない表現（日）

AUC area under the

concentration-time curve

濃度－時間曲線下面積

AUC0-tau AUC over the dosing interval 投与期間の AUC

BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin

カルメットゲラン桿菌（ウシ型弱毒結核菌）

BMD bone mineral density 骨密度

Ca++ Calcium ion カルシウムイオン

CHMP Committee for Medicinal Products for Human Use

ヒト用医薬品委員会 Cmax maximum serum concentration 最高血清中濃度 ECL electrochemiluminescent 電気化学発光

FITC fluorescinated フルオレセイン化

GLP Good laboratory practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準

ICH International conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use

日米 EU 医薬品規制調和国際会議

Ig Immunoglobulin 免疫グロブリン

IV intravenous or intravenously 静脈内投与

KLH Keyhole limpet hemocyanin キーホールリンペットヘモシアニン MHLW Ministry of Health, Labour, and

Welfare (Japan) 厚生労働省（日本） mRNA messenger ribonucleic acid 伝令リボ核酸

NK natural killer ナチュラルキラー

NOEL No-observed-effect level 無影響量 NOAEL no observed adverse effect level 無毒性量

NTX N-telopeptide N-テロペプチド

OECD Organisation for Economic

Cooperation and Development 経済協力開発機構

OPG Osteoprotegerin オステオプロテゲリン

pQCT peripheral quantitative

computed tomography 末梢骨定量的コンピュータ断層撮影_法 RANKL RANK ligand. In older

literature citations, this molecule was referred to as OPG ligand or TRANCE.

RANK リガンド。古い引用文献では、この分子は OPG リガンド又は TRANCE と称された。 SC subcutaneous or subcutaneously 皮下投与 SD standard deviation 標準偏差 sp. species 菌種

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1. まとめ

デノスマブ（開発コード：AMG 162）は、高い親和性及び特異性を有して RANK リガンド（RANKL）と結合するヒト型モノクローナル抗体であり、オステオプロテゲリン（OPG）の内因性作用と同様に、RANKL と RANK の相互作用を阻害する。RANKL は、骨を吸収する細胞である破骨細胞の増殖、生存、及び活性化に必要な経路における主要メディエーターである。デノスマブは、RANKL と結合して中和し、破骨細胞性骨代謝を抑制する。毒性プロファイルを検討するため、デノスマブを用いて一連の適切な in vitro 及び in vivo 試験を実施した。デノスマブの種特異性から、臨床試験プログラムをサポートする毒性試験にはカニクイザルのみを使用した。1 ヵ月間反復投与試験で用いた静脈内投与経路を除き、 in vivo 試験においては臨床試験との関連から皮下経路を使用した。各毒性試験で使用した用量は、試験動物に相当量を曝露するよう選定した。低用量は、無影響量（NOEL）又は無毒性量（NOAEL）となるよう設定した。各試験で、適切なリスク評価を実施するために十分な薬物曝露マージンが得られた。骨代謝における RANKL/RANK/OPG 経路の役割を考慮し（モジュール2.6.2参照）、骨密度及び骨強度を評価するパラメータも毒性試験に含めた。毒性試験及びトキシコキネティクス試験は、「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準（GLP）」規則に従って実施し、経済協力開発機構（OECD）及び日本国厚生労働省（MHLW）基準に適合した。その他の薬力学及び薬物動態試験はこれらの規則には該当しない。関連する日米 EU 医薬品規制調和国際会議（ICH）及びヒト用医薬品委員会（CHMP）ガイダンスも参照した。正式な単回投与毒性試験は実施しなかったが、単回投与による心血管系の安全性薬理試験では、最大 30 mg/kg を投与したサルにおいて有害作用はみられず、慢性反復投与試験の 50 mg/kg 初回投与後にも有害作用はみられなかった。デノスマブを最長で 1 年間、50 mg/kg までの用量で投与したサルの反復投与試験において、懸念されるような毒性学的な所見は確認されなかった。毒性試験における主な所見は薬剤の薬力学的作用に関連するものであり、有害反応ではないと考えられた。適用される規制ガイドライン（「ICH S6 バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」）に従い、デノスマブの遺伝毒性試験及びがん原性試験は実施しなかった。カニクイザルを用いた雌の受胎能、胚・胎児発生、出生前及び出生後の発生に関する試験を実施した。独立した雄の受胎能試験は実施しなかったが、12 ヵ月間反復投与試験の中で雄の生殖器官を詳細に検査した（試験報告書102090）。デノスマブはカニクイザルにおいて雄、あるいは雌の受胎能に対して影響しなかった。さらに、精巣又は精子形態に対する影響はみられなかった。器官形成期から分娩までの期間、サルに皮下投与した結果、死産の増加、出生児の死亡の増加、骨の形態異常、末梢リンパ節の形成不全などの発生異常が認められた。全体として、デノスマブは臨床用量の最大 150 倍の曝露量においても、カニクイザルにおいて良好な忍容性を示した。申請資料に含まれる毒性試験の一覧を表 1-1に示す。なお、これらの試験はすべて、本邦で 2012 年 1 月に製造販売承認を取得したランマーク皮下注 120 mg （デノスマブ［遺伝子組換え］）の承認申請資料として提出し、審査済みである。

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ表 1-1 デノスマブの毒性試験プログラム毒性試験試験実施施設 Amgen 試験報告書番号（CRO 試験報告書番号）反復投与毒性試験 3 ヵ月間の回復期間を設けた、AMG162 の皮下又は静脈内投与によるカニクイザルの骨への影響を評価する 1 ヵ月試験株式会社新日本科学鹿児島、日本 101447 (SBL 39-50) カニクイザルにおける AMG 162 の 6/12 ヵ月皮下投与毒性試験（6 ヵ月後に中間屠殺、12 ヵ月投与終了後から 3 ヵ月間の回復期間） Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102090 (1052-011) 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験雌カニクイザルにおける AMG 162 の皮下投与による受胎能評価 Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102843 (1052-013) 胚・胎児発生に関する試験カニクイザルにおける AMG 162 の皮下投与による胚・胎児発生に関する試験 Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102842 (1052-014) 出生前及び出生後の発生に関する試験妊娠カニクイザルにおける拡充型出生前及び出生後の発生毒性試験

Charles River Laboratories, Preclinical Services, Nevada,

Reno, NV 112197 (FIA00588) 安全性薬理試験a カニクイザルにおける AMG 162 の単回皮下投与による心血管及び呼吸器系評価

Sierra Biomedical (SBi), A Division of Charles River Laboratories, Inc., Sparks, NV

101606 (1129-01)

その他の試験 – 組織交差反応性試験

AMG 162 のカニクイザル、ラット、及びウサギ組織との ex vivo 交差反応性

Sierra Pathology Services (SPS), Sierra Biomedical, A Division of Charles River Laboratories, Inc.,

Sparks, NV

102700 (1407-01)

AMG 162 の正常カニクイザル及びヒト組織との交差反応性

Pathology Associates, A Charles River Company, Frederick, MD

101758 (IM 760)

AMG 162 の正常ヒト組織との交差反応性 Pathology Associates, A Charles River Company, Frederick, MD

101348 (IM 693) a モジュール 2.6.2 第 4 項に記載。

2. 単回投与毒性試験

ICH S6 に準拠し、デノスマブの正式な単回投与毒性試験は実施しなかった。心血管系に関する安全性薬理試験（試験報告書101606、0 mg/kg、0.3 mg/kg、3.0 mg/kg、又は 30 mg/kg の単回投与）及び慢性反復投与毒性試験（試験報告書102090）の 50 mg/kg の初回投与後において毒性症状はみられなかった。

3. 反復投与毒性試験（トキシコキネティクス評価を含む）

カニクイザルを用いて 1 ヵ月間及び 12 ヵ月間反復投与試験を実施した。デノスマブはげっ歯類の RANKL と交差反応しないため、反復投与試験において評価を実施した動物種はサルのみであった。

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3.1 サルの 1 ヵ月反復投与試験

若齢の雌雄カニクイザル（雌雄各 6 例／群）に、デノスマブを 0 mg/kg、0.1 mg/kg、1 mg/kg、及び 10 mg/kg の用量で週 1 回、静脈内投与（高用量のみ）又は皮下投与した。デノスマブを 4 回投与後に、13 週間の回復期間を設けた（試験報告書101447）。低用量は予定臨床用量と同程度の薬物曝露が得られるように、また、高用量は安全性評価に適した曝露が得られるように選定した。中間用量は、低用量及び高用量の対数中間値を選定した。デノスマブの週 1 回投与は良好な忍容性を示した。臨床観察、摂餌量、体重変化、眼科学的検査、血液学的検査、血液 Ca++、尿検査、又は病理組織学的検査に、薬物起因性の変化はみられなかった。血液化学的パラメータにおける投与起因性の影響として、総アルカリフォスファターゼ及び血清カルシウムの減少などが認められ、デノスマブの薬理作用と一致した。アルカリフォスファターゼは 10 mg/kg 群の雄及び全投与群の雌で減少した。一方、血清カルシウムは 1 mg/kg 及び 10 mg/kg 群の雄のみで減少した。回復期間終了までに、臨床生化学的検査パラメータはベースライン値にまで回復した。デノスマブの生物学的活性はすべての用量で認められた。非常にばらつきは大きいものの、 1 mg/kg 又は 10 mg/kg を投与した雄の脛骨近位端の総骨密度及び皮質骨密度は対照群と比較し増加傾向を示した（図 3.1-1）。末梢骨定量的コンピュータ断層撮影法（pQCT）により測定された骨密度の増加は、回復期間を通じて持続した。これは他の試験で認められた持続性の薬理学的反応と一致した。さらに、1 mg/kg 皮下投与群雄の橈骨遠位端の総骨密度（BMD）は、回復期間中増加し、10 mg/kg 静脈内投与群雄の同部位の皮質骨 BMD も同様であった。骨吸収のサロゲートマーカーである血清中架橋 N-テロペプチド（NTX）濃度は、すべての用量で初回投与後 8 時間から最終採取時点にかけて減少した（最大 60～80%）（図 3.1-2）。オステオカルシン値は、3 日目から 56 日目の間、ベースライン値を 15%から 45%下回った。回復期間中、これらの両骨代謝マーカーの値は、用量依存的に正常範囲内への回復傾向を示し、高用量静脈内投与群の回復が最も緩やかであった。

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ R a d iu s T ib ia Change in Total BMD (%) 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 p l a c e b o 0 . 1 m g / k g ( S C ) 1 . 0 m g / k g ( S C ) 1 0 . 0 m g / k g ( S C ) 1 0 . 0 m g / k g ( I V ) プラセボ 0.1 mg/kg（SC） 1.0 mg/kg（SC） 10.0 mg/kg（SC） 10.0 mg/kg（IV）総 BMD の変化率（ % ）橈骨脛骨 SD = 標準偏差; BMD = 骨密度; SC = 皮下投与; IV = 静脈内投与。出典: 試験報告書 101447、表 9-1、表 9-4 のデータ図 3.1-1 デノスマブを週 1 回、計 4 回投与した雄サルにおける脛骨近位端及び橈骨遠位端の総骨密度（ベースラインからの変化率%±SD [n = 6]） -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 -1 4 9 14 19 24 Time (days ) Serum NTx (%Change) Placebo 0.1 mg/kg SC 1.0 mg/kg SC 10 mg/kg SC 10 mg/kg IV プラセボ時間（日）血清中 NTx （変化率 % ） NTX = 架橋 N-テロペプチド; SC = 皮下投与、IV = 静脈内投与。出典: 試験報告書 101447、補遺 2 の図 2 のデータ図 3.1-2 デノスマブを週 1 回投与したカニクイザルの血清中 NTX（ベースラインからの変化率%±SD [n = 12]）

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ 7 この試験のトキシコキネティクスについてはモジュール2.6.4に示す。投与 14 日目に、 0.1 mg/kg 投与群の 6 例及び 1 mg/kg 投与群の 1 例で抗薬物抗体が検出された。投与 28 日目には、すべての用量で抗薬物抗体が検出された。投与 28 日目までの抗体陽性動物の割合は、 0.1 mg/kg SC、1 mg/kg SC、10 mg/kg SC、及び 10 mg/kg IV 投与群でそれぞれ、100%、67%、 33%、及び 25%であった。抗薬物抗体反応のこのパターンは、高濃度の薬物が存在することによる測定妨害の典型である。回復期間中にも、抗体陽性動物の発生数の増加が認められた。 0.1 mg/kg SC、1 mg/kg SC、10 mg/kg SC、及び 10 mg/kg IV 投与群でそれぞれ、100%、100%、 100%、及び 67%であった。両側性卵巣嚢胞が高用量静脈内投与群の雌 1 例で認められ、投与終了時にこの群の雌で甲状腺重量の統計学的に有意な増加が認められた。肉眼的に認められた卵巣嚢胞は卵管嚢胞と判断された。これらは、発生率が背景値の正常範囲内であったことから、毒性学的な意義はないと考えられた。甲状腺に、重量増加と関連する病理組織学的所見はみられなかった。これらの所見は、12 ヵ月試験（試験報告書102090）では認められなかった。その他の病理組織学的変化は偶発性で、デノスマブ投与に関連した変化ではないと考えられた。毒性学的に重要な所見がみられなかったことから、この試験の NOAEL は、試験に用いた最高用量の 10 mg/kg と判断した。

3.2 サルの 6/12 ヵ月反復投与試験

若齢の雌雄カニクイザル（雌雄各 8 例／群）に、デノスマブを 0 mg/kg、1 mg/kg、10 mg/kg、及び 50 mg/kg の用量で月 1 回、6 又は 12 ヵ月間皮下投与した。12 ヵ月間の投与期間後に、 13 週間の回復期間を設けた（試験報告書102090）。 6 又は 12 ヵ月間デノスマブを投与したサルに、薬物に関連した臨床徴候はみられず、体重、摂餌量、眼科学的、心血管系、又は血液化学的パラメータに明らかな投与関連の影響もみられなかった。また、血液化学的パラメータにもデノスマブの薬理作用に伴う血清 ALP、リン及びカルシウムの変動以外には明らかな投与関連の影響はみられなかった。デノスマブは、精子運動性及び形態にも有害な影響を及ぼさなかった。精巣組織のフローサイトメトリー検査及び顕微鏡検査では、いかなる化合物関連の変化もみられなかったことから、デノスマブ投与が雄の生殖能に影響を及ぼす可能性は非常に低いと考えられた。免疫グロブリン値（IgG、IgM、及び IgA）及びリンパ球分画（B 細胞、T 細胞、及びナチュラルキラー［NK］細胞）には個体間のバラツキがあったが、免疫系に対して重要な影響を示唆する差異は高用量群と対照群の間には認められなかった。さらに、16 ヵ月間投与薬理試験の 25 mg/kg 及び 50 mg/kg 投与群で同様の評価項目を評価したが、いかなる懸念も確認されなかった（試験報告書103981）。 1 ヵ月間試験と一致して、デノスマブはサルにおいて高い免疫原性を示した（表 3.2-1）。結合抗体は、1 mg/kg、10 mg/kg、及び 50 mg/kg 投与群のそれぞれ 100%、50%、及び 13%の動物で測定された。中和抗体は、これらの各群のサルのそれぞれ 81%、50%、及び 47%で認められた。前述のとおり、抗薬物抗体反応のこのパターンは、高濃度の薬物の存在による測

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ定妨害の典型である。結合抗体及び中和抗体の両方を有する動物の多くでは、抗体陰性動物と比較し、薬物クリアランスの増大及び薬理活性の減少も認められた（モジュール2.6.4参照）。しかし、薬物は完全には消失せず、薬力学的反応同様、低い濃度での薬物曝露が投与期間を通じて維持されたため、特異的及び非特異的作用の評価が可能であった。表 3.2-1 デノスマブに対する結合抗体及び中和抗体を発現した動物の総発生数群用量（mg/kg）動物総数結合抗体陽性動物数中和活性陽性動物数 1 0 16 1 0 2 1 16 16 13 3 10 16 8 8 4 50 15 2 7 出典: 102090 試験、補遺 10 以前に実施した薬力学的及び毒性試験に基づき想定されるとおり、デノスマブは骨代謝の血清中及び尿中マーカーに用量依存性の有意な減少を引き起こした。高用量群のサルでは、骨吸収のすべてのマーカーについて全評価期間にわたり持続的作用が認められ、これより低い用量では、作用の持続性は低下した。薬力学的反応の持続性に対する抗薬物抗体の影響は否定できず、認められたバラツキの原因となった可能性がある。骨代謝マーカーは、3 ヵ月間の休薬期間終了時までには、抗体陰性動物でもベースライン又はその近くまで回復した。この試験及び霊長類を用いた他の試験におけるデノスマブの骨量及び骨強度への影響に関する包括的考察は、モジュール2.6.2 第 2.2 項に示す。器官重量への影響、あるいは標的器官毒性を示す解剖学的又は組織学的所見はみられなかった。脛骨、胸骨、及び大腿骨の病理組織学的検査では、骨芽細胞及び破骨細胞の減少、骨端成長板における軟骨破裂の減少（軟骨内骨化の減少と定義）、及び骨端の厚みの増加が認められた。これらの所見は 10 mg/kg 又は 50 mg/kg を 6 ヵ月間投与したサルで認められ、12 ヵ月の投与期間終了時にはより程度が増強して認められた。投与期間中に、高用量群の雄 1 例が投与 76 日目に死亡し、さらに雄 1 例を投与 289 日目に瀕死期解剖した。これらの各例の死因はデノスマブに起因するものではなかった。いずれの動物においても、死亡前の長期間にわたり、下痢及び摂餌量減少に伴う体重減少が認められた。重要な点は、同様の変化が対照群を含む他の動物でも頻繁に認められたものの、これらデノスマブを投与した 2 例でより重度であるように思われたことである。下痢の原因は明確 に特定されなかったが、Giardia sp.、Cryptosporidium sp.、又はその両方に関連する可能性が 高いとみられる。これは、糞便検査において、これらの原虫寄生が、デノスマブ投与群及び対照群の動物 64 例中 47 例で特定されたためである。これらは概ね片利共生微生物であるが、特定の環境において疾患誘発能を有する。さらに、抗薬物抗体の発現と下痢、又は摂餌量減少の発現に関連性が低かったことから、抗薬物抗体がこれらの動物の状態悪化に役割を果たした可能性は低い。投与 76 日目に死亡が認められた雄サルの死因は、得られた臨床観察、剖検所見、又は病理

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ 9 組織学的検査からは特定できなかった。病理組織学的所見として、心臓の炎症、消化管の炎症及び軽微な病変、脾臓におけるリンパ組織の萎縮、並びに副腎皮質の肥大などが認められた。心臓の炎症は、軽微な急性限局性心外膜炎及び乳頭筋の軽微な多巣性心筋炎で構成された。心臓の炎症は、ヒト以外の霊長類を含む通常使用される実験動物において自然発生性の変化として認められることが多い（Greaves, 2000）。重要な点は、カニクイザルにおける背景所見の最近のレビューにおいて、対照動物の約 50%の心筋に炎症性病巣がみられる可能性があることが示されたことである（Drevon-Gaillot et al, 2006）。さらに、壊死巣は、カリウム濃度の減少に伴い二次的に心臓に発生する可能性もあり（Takeuchi et al, 2008）、カリウム濃度の減少は一般に下痢を伴って認められる。同程度の心臓の病理所見は対照群 1 例でも認められたが、投与期間終了時の高用量デノスマブ群の動物を含め、他のサルではみられなかった。さらに、薬物誘発性の心臓病変が散在性に分布するのと異なり、このサルの心臓の変性は限定された領域にのみ分布していたことから、薬物による直接的な心筋毒性の症状と一致しなかった（Greaves, 2000）。したがって、心臓の炎症はデノスマブ投与に関連しないと解釈された。投与 289 日目に瀕死状態により安楽死させたサルでは、事前に消化管疾患を示唆する臨床徴候も認められた。病理組織学的検査では、陰窩微小膿瘍及び絨毛萎縮に加え、原虫性の急性腸炎が認められた。この種の病変から、既存の原虫腸内感染の急性増悪が示されたが、薬物誘発性の消化管毒性はみられなかった。腸内原虫はヒト以外の霊長類では珍しくなく、様々な身体的又は環境（ストレス）要因に関連して発症する疾患の臨床症状とともに認められる。さらに、重症度は低いものの、炎症又は陰窩微小膿瘍が、対照群を含む各投与群の複数のサルで認められた。このように、同程度の類似の病変が対照群のサルで認められたため、いずれの死亡例もデノスマブ投与に直接起因したとは考えられなかった。以上の結果に基づき、本試験の NOAEL は、最高用量である 50 mg/kg とされた。

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4. 遺伝毒性試験

デノスマブの遺伝毒性に関する評価は実施しなかった。バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価に関する既存の規制ガイドラインによると、通常実施される標準的な遺伝毒性試験の範囲と種類は、この種の製剤に対しては適切なものではない（「ICH S6 バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」）。デノスマブの分子量（約 150 kD）に基づくと、デノスマブは DNA 又は他の染色体構成要素と直接相互作用することが可能とは想定されない。さらに、デノスマブは、すべて天然アミノ酸で構成される遺伝子組換えたん白質であり、無機又は合成有機リンカー、あるいは懸念材料をもたらすようなその他の非たん白質成分は含まれていない。

5. がん原性試験（トキシコキネティクス評価を含む）

規制ガイドラインに従い、デノスマブのがん原性試験も実施しなかった。デノスマブはマウス又はげっ歯類の RANKL を認識しないため、この判断は適切であると考えられる。さらに、がん原性試験を実施しないという判断は、既存の規制ガイダンスに従ったものである。さらに、デノスマブを最大 50 mg/kg の用量で最長 16 ヵ月間投与した卵巣摘出サルにおいて過形成病変の肉眼的所見はみられず（試験報告書103981）、最大 50 mg/kg の用量で 12 ヵ月間投与した雌雄サルにおいて病理解剖学的又は病理組織学的所見はみられなかった。

6. 生殖発生毒性試験（用量設定試験及びトキシコキネティクス評価を含む）

デノスマブの雌受胎能試験、胚・胎児発生、出生前及び出生後の発生に関する試験をカニクイザルを用いて実施した。これらの試験の用量及び投与頻度は、投与期間を通じて適切な薬物曝露量を維持するよう選定した。雌受胎能試験及び胚・胎児発生に関する試験における高用量（12.5 mg/kg、週 1 回）の累積 1 ヵ月投与量は、サルの慢性試験（50 mg/kg、月 1 回）の 1 ヵ月投与量と同等であった。低用量（2.5 mg/kg、週 1 回）は、投与期間中の曝露量を維持するために必要な最低用量と考えられた。

6.1 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験

月経周期が規則的な性成熟した雌カニクイザルを用いて、デノスマブの受胎能への影響を評価した。0 mg/kg、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、又は 12.5 mg/kg を週 1 回、月経周期 2 回以上にわたり、交配後 4 週間まで皮下投与した。交配成立までに、さらに 2～3 回の月経周期を必要とした個体もあった。すべての動物で、全投与期間にわたり血中薬物曝露量が測定可能であった。初回投与後、平均 Cmax及び AUC0-tauに基づく曝露量は、2.5～12.5 mg/kg の用量範囲で用量比例的に増加した。週 1 回で平均 10 週間の投与後、12.5 mg/kg 群で有意な薬物の蓄積（>2 倍）が認められた。週 1 回で平均 17～20 週間の投与後にも、2.5 及び 12.5 mg/kg 群で有意な蓄積（～3 倍）が認められた。薬物曝露量の減少が、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、及び 12.5 mg/kg

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2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ 11 が高かった。この試験では抗薬物抗体測定を実施しなかったため、この仮説は確認できない。月経周期の長さは、対照群とデノスマブ投与群で、概ね同程度であった。対照群を含む雌の数例で周期の延長が認められたが通常 1 回又は 2 回の投与サイクルの延長のみであった。月経周期は、エストラジオール濃度のピークと同時又はエストラジオール濃度のピークにわずかに先行されて（通常 1 日）黄体化ホルモン濃度のピークが認められることを特徴とした。プロゲステロン濃度は、エストラジオール及び黄体化ホルモンのピーク濃度到達時に上昇し始め、通常 5～10 日後にプラトーに達し、その後低下する。血清中プロゲステロン、17-エストラジオール及び黄体化ホルモンの濃度及び経時パターンは、予測通り、対照群とデノスマブ投与群間で同程度であった。デノスマブは、月経周期、ホルモン濃度、又は受胎能に影響を及ぼさなかった。興味深いことに、高用量のデノスマブを投与した雌では、交配に成功した雌動物数が対照群よりも多かった。この試験の NOAEL は、試験の最高用量である 12.5 mg/kg と解釈された（試験報告書102843）。 12 ヵ月間反復投与試験（試験報告書102090）の一環として最終剖検時に安楽死させた雄の受胎能を評価した。フローサイトメトリーにより精巣の細胞ポピュレーションを精巣組織で評価した。精子運動性、精子濃度の評価、及び組織病理学的検査のため精巣上体尾部を処理した。精子に対する意味のある影響はなく、精巣毒性を示す病理組織学的所見はみられなかった。これらの試験のデータから、デノスマブは雄又は雌の受胎能に意義のある影響を起こさないことが示された。

6.2 胚・胎児発生に関する試験

デノスマブの胚・胎児毒性及び催奇形性の可能性を、器官形成期に投与した妊娠カニクイザルで評価した（試験報告書102842）。デノスマブを 0 mg/kg、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、又は 12.5 mg/kg の用量で週 1 回、妊娠 20～50 日の間皮下投与した。母体毒性はみられなかった。生存胎児について、体重又は器官重量、身体測定値、胎盤重量、あるいは病理組織学的検査で投与に関連した変化はみられなかった。胎児の外表及び内臓検査所見は、対照及びデノスマブ投与群で同程度であった。頭蓋骨、胸骨分節、椎骨、肋骨、及び足根骨の骨化における変異などの軽微な骨格異常が、デノスマブ投与群及び対照群の全胎児で認められた。これらの異常は、デノスマブ投与群と対照群で同程度の発生率で認められた。したがって、変異は薬物関連ではないと考えられた。これらの所見から、カニクイザルにおいて、デノスマブが発生毒性物質ではないことが示されている。この試験における NOEL は、試験での最高用量の 12.5 mg/kg であった。

6.3 出生前及び出生後の発生に関する試験

デノスマブを妊娠カニクイザルに器官形成期（妊娠 20～22 日）から分娩まで皮下投与（0 mg/kg 及び 50 mg/kg、最大 6 回）した結果、母動物及び出生児に投薬起因性の作用が認められた（試験報告書112197）。各群 29 例の妊娠動物を割り付け、対照群及びデノスマブ

(12)

2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ投与群でそれぞれ 22 例及び 16 例の出生児を得た。各群母動物と出生児の 6 ペアを分娩後／生後 1 日（あるいはごく近い日）に剖検し、残りの生存動物（対照群 11 ペア、デノスマブ投与群 4 ペア）を分娩後／生後 180±2 日に剖検した。対照群の出生児 1 例及びデノスマブ投与群の出生児 5 例が瀕死状態となり、途中解剖を実施した。生後 11 日にデノスマブ投与群の出生児 1 例が死亡した。母動物が拒絶した個体（対照群 1 例、デノスマブ投与群 2 例）を含めた場合、出生児死亡の発生は対照群で 9.1%（2/22）、デノスマブ投与群で 50.0%（8/16）であった（背景値：8.9%、101 例中 9 例、背景の範囲：0%～20.0%）。デノスマブ投与群における出生児死亡の増加は投薬関連の影響と判断した。母動物において、骨吸収及び形成のバイオマーカーの低下（骨代謝回転の低下を反映）、死産（分娩の予定時期における胎児死亡）の増加、分娩異常（1 例）、低 Ca 血症と一致した臨床症状を示した後の死産（1 例）が認められた。母動物の乳腺の発達は正常であった。妊娠期間中デノスマブに曝露された出生児では、出生後死亡の増加、体重増加の抑制、成長／発達の遅延、骨吸収及び形成のバイオマーカーの低下が認められた。生後 1 日解剖群あるいは出生後死亡／瀕死期解剖例では、（X 線不透過の増加を伴う）骨密度及び骨量の増加、骨の形状と顎骨長の変化、（一部の出生児で造血抑制を惹起する、骨髄腔減少を伴う）非増殖性骨化過剰、長骨における二次骨化中心拡大の遅延、（組織学的に認められた骨幹端の肥大と一致する）成長板の肥厚、及び（骨折を伴う）骨強度の低下が認められた。これらの出生児ではデノスマブ投与に起因した組織学的変化が骨（破骨細胞低形成、非増殖性骨化過剰、及び髄腔の減少）、歯（歯牙異形成、歯列不正、ただし、歯牙崩出には異常なし）、末梢リンパ節（大部分が欠損、検査対象リンパ節：腋窩、鼠径、顎下、及び腸間膜）、及び髄外造血（複数組織）に認められた。複数組織の感染が途中解剖例の出生児 3 例で検出された。新生児の筋緊張、及び神経行動評価に投薬関連の影響はみられなかった。デノスマブ投与群の母動物及び出生児の骨バイオマーカーは分娩後／出生 91 日で回復した。デノスマブの薬理作用からの回復は分娩後の薬物動態で確認された曝露の減少と直接関連していた。生後 1 日目で認められていた大部分の骨関連の変化は生後 180±2 日目では完全に回復した。しかし、いくつかの投与起因性の変化（末梢リンパ節の欠損・減少、髄外造血、歯牙異形成）は持続した。大腿骨の骨幹形状の変化及び骨力学特性の低下が認められたが、骨バイオマーカーは時間とともに回復したであろうことを示している。歯牙萌出には影響はなかった。生後 180 日群において軽度から中等度の鉱質沈着がデノスマブ投与群の出生児 1 例の複数の組織で認められた。投与 1 回目（妊娠 20―22 日）と投与 5 回目（妊娠 132 日）後の母動物の AUC26dayはそれぞれ 7400 g·day/mL と 8620 g·day/mL であった。半数の出生児の血清中濃度は母動物より高く、半数では低かった。出生児では測定可能な濃度のデノスマブが生後 91 日で 1 例のみ検出されたが、生後 180 日では検出される個体はなかった。デノスマブの血清中濃度に対して乳汁中濃度は低かった。

(13)

2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブ 13 14 例中 7 例でデノスマブに対する結合抗体が陽性であった（全例が抗薬物抗体陽性の母動物から出生）。中和抗体は母動物 3 例、出生児 1 例で検出された。母動物 3 例及び出生児 1 例のみで抗体産生が曝露並びに薬理作用に影響した。抗体産生が低かったこと、一貫した投薬起因性の作用から抗薬物抗体の産生が試験の完全性と解釈に影響しないことが示された。これらの試験データから、デノスマブを器官形成期から分娩までにわたって投与した場合、死産及び出生児死亡の増加、出生児の骨格及び末梢リンパ節に影響を与えることが示された。

6.4 新生児を用いた試験

本申請で求めている適応症に小児患者が含まれないため、幼若動物の試験は必要とされなかった。毒性試験プログラムで使用された対応する年齢のカニクイザルで、その年齢層又はそれ以上の年齢層における潜在的影響を評価できると考えられる。ラット新生児を用いた RANKL 阻害の作用を調べた多くの副次的薬理試験が行われている（モジュール2.6.2 第 3.7 項）。

7. 局所刺激性試験

局所刺激性を評価する正式な試験は実施しなかったが、反復投与試験の一環として注射部位の評価を行った。動物の注射部位に明らかな刺激性は認められなかった。

8. その他の毒性試験（実施している場合）

8.1 抗原性試験

デノスマブを投与したサルで発現した抗薬物抗体を検出するため、電気化学発光（ECL）免疫測定法を開発した。この免疫測定法における抗体検出の原理は、血清中抗体の二価の特性に基づくものである。ビオチン化及びルテニル化デノスマブに結合すると、抗体は電圧をかけた際に化学発光シグナルを放射する。結果として生じた発光強度は血清中抗デノスマブ抗体量に比例する。検体は、検体のシグナル対ノイズ比が閾値のシグナル対ノイズ値以上で、検体の投与後／投与前比が 2 より大きい場合、抗体陽性と考えられた。また、血清はデノスマブの中和活性を決定するためにバイオアッセイ（マウスマクロファージ細胞株における破骨細胞分化の表現型マーカーの mRNA 測定）にも用いた。デノスマブはサルで高い免疫原性を示した。3 項に記載のとおり、試験に供した全用量で結合抗体又は中和抗体が高頻度で発現した。結合抗体及び中和抗体の発現により、数例でデノスマブの血清中濃度が減少し、薬力学的反応（骨代謝マーカー）の減弱が認められた。しかし、抗体の発生に関連して毒性が増したとはみられず、デノスマブ曝露量の減少した動物もみられたものの予定の試験期間を通じて曝露は維持されたため、この結合抗体及び中和抗体の発現は全体的な試験の解釈に影響を及ぼさなかった。

8.2 免疫毒性試験

類似した分子を用いたげっ歯類の試験から、RANKL の阻害が免疫抑制には関連しないこ

(14)

2.6.6 毒性試験の概要文デノスマブとが示された。ノックアウトマウスモデルで証明されたとおり、RANKL はマウスの免疫系の発生に重要な役割を果たす。ノックアウトマウスはリンパ節を形成せず、脾臓 B 細胞及び T 細胞成熟においてわずかな障害を示す（Kong et al, 1999b）。しかし、完全な免疫系を有する成熟した動物の機能的反応性に、RANKL が重要な役割を果すことを示す根拠はない。デノスマブはげっ歯類 RANKL に対し薬理活性を有さない。そのため、デノスマブの生物学的作用について理解を深めるため、げっ歯類 RANKL に対する内因性アンタゴニスト（OPG）をサロゲート分子として用いた。免疫機能に関する RANKL の役割は、マウス及びラットにおいて広範に評価されてきた（Stolina et al, 2007, 2009, 2005, 2003）。具体的には、これらの試験の所見から、RANKL 拮抗作用は以下の点に関し有害作用を及ぼさないことが示された。 • オキサゾロン感作マウスモデルにおける接触過敏症 • 正常マウスあるいはキーホールリンペットヘモシアニン（T 細胞依存性抗原; KLH）又はニューモバックス（T 細胞非依存性抗原）免疫マウスにおける総免疫グロブリン生成 • KLH 免疫マウスから摘出したリンパ節の細胞増殖又はサイトカイン産生 • in vitro での T 細胞又は B 細胞の増殖 • リポ多糖類／ガラクトサミン誘発性死亡率

• Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) 感染に対する反応 • インフルエンザウイルス感染に対する反応前述のとおり、デノスマブを月 1 回、12 又は 16 ヵ月間投与したサルにおいて、リンパ球分画、血清中免疫グロブリン値、又は KLH に対する T 細胞依存性抗体反応に有意な差異はみられなかった（試験報告書102090及び103981）。総合データから、デノスマブは免疫毒性に対し意義のあるリスクを引き起こさないことが示されている。

8.3 毒性発現の機序に関する試験

デノスマブの毒性プロファイルは非常に限られているため、毒性発現の機序に関する試験は適切ではないと考えられた。

8.4 依存性試験

デノスマブは RANKL に特異的に結合し、薬物依存性との関連性が知られる受容体との交差反応は示されていない。したがって、デノスマブの依存性を評価する試験は適切ではないと考えられた。

8.5 不純物の毒性試験

(15)

15

(16)

8.6 その他の試験

組織交差反応性試験デノスマブの交差反応性をヒト、カニクイザル、ラット、及びウサギの選択した組織において評価した。蛍光標識デノスマブ（FITC-デノスマブ）を選択したヒト組織（選択した胎児組織を含む）の凍結切片に適用し、結合及び交差反応性を検出した（試験報告書101348）。2 濃度（1 及び 10 g/mL）を使用し、被験物質と凍結切片の反応性を証明するため間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いた。1/3 例のリンパ節において、旁皮質辺縁のリンパ球細胞膜上に陽性反応（弱～中）が認められた。評価を行った他の組織では、特異的な免疫反応はみられなかった。この結果は RANKL がリンパ組織で高発現することに一致する（Hofbauer et al, 1999）。続いて実施した試験で、デノスマブが、ヒトで RANKL を発現することが知られる組織について霊長類で交差反応するかどうかを検討した（試験報告書101758）。カニクイザルの脾臓、リンパ節、胸腺、扁桃、骨髄、及び骨を検査した。3/3 例のリンパ節において、旁皮質辺縁のリンパ球細胞膜上に陽性反応（弱～強）が認められた。リンパ節以外の組織では、交差反応性はみられなかった。さらに、カニクイザル、ラット、及びウサギの組織で、デノスマブが特異的に結合するか検討するため試験を実施した。デノスマブ結合は、カニクイザル及びウサギではリンパ節の皮質辺縁の細網状部分、脾臓の細動脈周囲リンパ鞘及びリンパ小節の周辺、並びに小腸及び大腸の消化管関連リンパ組織のリンパ小節周辺の細胞の細胞質内に陽性像として認められたが、ラットではみられなかった（試験報告書102700）。しかし、これらの陽性反応は細胞質にのみ認められたことから、ウサギでの陽性反応はその局在から生物学的に重要ではないと判断した。免疫反応はカニクイザル及びヒトでのみリンパ節（RANKL を発現することが知られている組織）に認められた。したがって、非臨床試験にサルを用いる妥当性が示された。本アッセイの感受性レベルでは、他に RANKL の発現を示す組織は特定されなかった。重要な点は、ヒト又はサルの検討した器官・組織においてリンパ球以外にデノスマブの結合がみられなかったことである。

(17)

9. 考察及び結論

毒性試験プログラムは、デノスマブの特異性から単一の動物種に限定されたが、それでも毒性プロファイルは十分に解析された。実施した試験においてデノスマブ投与に関連して認められた唯一の影響は、予測される薬力学的な作用に起因するものであり、有害所見とは考えられなかった。薬力学的作用は、特に 12 ヵ月間反復投与試験で明らかで、卵巣摘出を実施していない動物においても骨密度及び骨強度の明らかで持続的な増加が認められた。他の組織・器官、特に免疫系に影響はみられなかった。デノスマブは雌雄の生殖能に影響しなかったが、器官形成期から分娩まで投与した場合に発生毒性を示し、ごくまれに分娩異常が認められた。 12 ヵ月間試験における死亡は、同時に認められた感染により偶発的に発生した可能性が極めて高い。同じ用量群内の他のサルでは類似の臨床徴候はみられず、総合的な免疫毒性データから、問題となるような影響を確認できなかったため、これらの動物の死亡が免疫抑制に関連していた可能性も低い。全体として、デノスマブの毒性プロファイルから、この分子はカニクイザルにおいて良好な忍容性を示すこと、望ましい薬力学的作用を有すること、カニクイザルにおいて高い免疫原性を示すこと、薬理作用と関連しない全身性作用を引き起こさないこと、生殖発生毒性ポテンシャルを有することが示された。予定臨床用量及び治療スケジュールに対する安全域に関する考察はモジュール2.4 第 5 項及びモジュール2.6.4 第 8.2 項に示す。

(18)

10. 参考文献

Drevon-Gaillot E, Perron-Lepage MF, Clement C, Burnett R. A review of background findings in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) from three different geographical regions. Exp Toxicol Pathol. 2006;58:77-88.

Greaves P. Histopathology of preclinical toxicity studies: interpretation and relevance in drug safety evaluation. 2nd ed. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier; 2000.

Hofbauer LC, Osteoprotegerin ligand and osteoprotegerin: novel implications for osteoclast biology and bone metabolism. Eur J Endocrinol. 1999;141:195-210.

Kong Y-Y, Yoshida H, Sarosi I, et al. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph node organogenesis. Nature. 1999b;397:315-323.

Stolina M, Dwyer D, Ominsky MS, Corbin T, et al. Continuous RANKL inhibition in osteoprotegerin transgenic mice and rats suppresses bone resorption without impairing lymphorganogenesis or functional immune responses. J Immunol. 2007;179:7497-7505.

Stolina M, Schett G, Dwyer D, Vonderfecht S, et al. RANKL inhibition by osteoprotegerin prevents bone loss without affecting local or systemic inflammation parameters in two rat arthritis models: comparison with anti-TNFalpha or anti-IL-1 therapies. Arthritis Res Ther. 2009;11:R187.

Stolina M, Adamu S, Ominsky MS, et al. RANKL is a marker and mediator of local and systemic bone loss in two rat models of inflammatory arthritis. J Bone Min Res. 2005;20:1756-1765.

Stolina M, Guo J, Faggioni R, Brown H, Senaldi G. Regulatory effects of osteoprotegerin on cellular and humoral immune responses. Clin Immunol. 2003;109:347-354.

Takeuchi A, Shirakawa T, Toyoda Y, Tabata H, et al. Myocardial necrosis related to hydrochlorothiazide-induced hypokalemia in cynomolgus monkeys. J Toxicol Sci. 2008;33:657-666.

(19)

2.6.7 毒性試験概要表デノスマブ 1

1. 毒性試験：一覧表 ...2 2. トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験の一覧表 ...4 3. トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験成績の一覧 ...5 4. 毒性試験：被験物質（バッチ毎）一覧 ...6 5. 単回投与毒性試験 ...7 6. 反復投与毒性試験：重要な試験以外の試験...8 7. 反復投与毒性試験：重要な試験 ...9 8. In Vitro 遺伝毒性試験 ...23 9. In Vivo 遺伝毒性試験 ...24 10. がん原性試験...25 11. 生殖発生毒性試験：重要な試験以外の試験...26 12. 生殖発生毒性試験：受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 ...27 13. 生殖発生毒性試験：胚・胎児発生に関する試験 ...29 14. 生殖発生毒性試験：出生前及び出生後の発生並びに母体の機能に関する試験 ...32 15. 新生児を用いた試験 ...45 16. 局所刺激性試験...46 17. その他の毒性試験 ...47

(20)

2.6.7 毒性試験概要表デノスマブ

1. 毒性試験：一覧表

Table 1. Toxicology Overview Test Article: AMG 162

Type of Study Species and Strain Method of Administration Duration of Dosing Doses (mg/kg) a GLP

Compliance Testing Facility

Amgen Study No. (CRO Study No.) Location in CTD Repeated-dose Toxicity Cynomolgus monkey Subcutaneous or Intravenous

1 month Once weekly: 0 (SC), 0.1 (SC), 1.0 (SC), 10.0 (SC), 10.0 (IV)

Yes Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Kagoshima, Japan 101447 (SBL 39-50) 4.2.3.2.1 Cynomolgus monkey Subcutaneous 6 and 12 months Once monthly: 0, 1, 10, 50

Yes Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102090 (1052-011) 4.2.3.2.2 Female Fertility Cynomolgus monkey Subcutaneous Over 2 menstrual cycles before mating and for 20 days after mating Once weekly: 0, 2.5, 5, 12.5

Yes Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102843 (1052-013) 4.2.3.5.1.1 Embryo-fetal Development Cynomolgus monkey Subcutaneous Gestation days 20-50 Once weekly: 0, 2.5, 5, 12.5

Yes Covance Laboratories GmbH, Münster, Germany 102842 (1052-014) 4.2.3.5.2.1 Pre and Postnatal Development Cynomolgus monkey Subcutaneous Gestation days 20 -parturition Once monthly: 0, 50

Yes Charles River Laboratories Preclinical Services, Nevada Reno, NV 112197 (FIA00588) 4.2.3.5.3.1 Page 1 of 2 a_{Unless otherwise specified. The no observed adverse effect level is underlined, as applicable. GLP = Good Laboratory Practices; IV = intravenous; NA = not applicable; SC =}

(21)

3 Table 1. Toxicology Overview

Test Article: AMG 162 Type of Study Species and Strain Method of Administration Duration of Dosing Doses (mg/kg) a GLP

Compliance Testing Facility

Amgen Study No. (CRO Study No.)

Location in CTD Other Studies – Tissue Cross-reactivity Cynomolgus monkey, rat, rabbit In vitro NA 5 or 25 μg/mL

Yes Sierra Pathology Services, Sierra Biomedical, A Division of Charles River Laboratories, Inc., Sparks, NV 102700 (1407-01) 4.2.3.7.7.1 Cynomolgus monkey, human In vitro NA 1 or 10 μg/mL No Pathology Associates, A Charles River Company, Frederick, MD 101758 (IM 760) 4.2.3.7.7.2 Human In vitro NA 1 or 10 μg/mL Yes Pathology Associates, A Charles River Company, Frederick, MD 101348 (IM 693) 4.2.3.7.7.3 Page 2 of 2 a_{Unless otherwise specified. The no observed adverse effect level is underlined, as applicable. GLP = Good Laboratory Practices; IV = intravenous; NA = not applicable; SC =} subcutaneous.

(22)

2. トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験の一覧表

Table 2. Overview of Toxicokinetics Studies Test Article: AMG 162

Type of Study Test System

Method of Administration Doses (mg/kg) GLP Compliance CRO Study Number Repeated-dose Toxicity Cynomolgus monkey Subcutaneous or

Intravenous

Once weekly: 0 (SC), 0.1 (SC), 1.0 (SC), 10.0 (SC),

10.0 (IV)

Yes SBL 39-50

Repeated-dose Toxicity Cynomolgus monkey Subcutaneous Once monthly: 0, 1, 10, 50 Yes 1052-011 Female Fertility Cynomolgus monkey Subcutaneous Once weekly: 0, 2.5, 5, 12.5 Yes 1052-013 Embryo-fetal Development Cynomolgus monkey Subcutaneous Once weekly: 0, 2.5, 5, 12.5 Yes 1052-014 Pre and Postnatal Development

Safety Pharmacology Cynomolgus monkey Cynomolgus monkey Subcutaneous Subcutaneous Once monthly: 0, 50 0, 0.3, 3, 30 Yes Yes FIA00588 1129-01 GLP = Good Laboratory Practices; IV = intravenous; SC = subcutaneous

(23)

5

3. トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験成績の一覧

Table 3. Overview of Toxicokinetics Data Test Article: AMG 162

Mean (SD) Steady-State a Exposure in Cynomolgus Monkeys Exposure Margin b Based on: Dose c (mg/kg) Dose Frequency (µg/mL)Cmax AUC0-tau (µg·hr/mL) Corresponding d AUC0-4 weeks

(µg·hr/mL) Cmax AUC0-4 weeks 0.1 weekly e 11.3 (31.2) 349 (869) 1400 _1.6 _0.08 1 weekly e 27.5 (14.0) 3410 (2080) 13600 _4.0 _0.76 2.5 weekly f 58.8 (19.8) 8800 (3050) 35200 _8.5 _2.0 5 weekly f 114 ( 52) 15500 (6350) 62000 ₁₆ _3.4 10 weekly e 302 (151) 42000 (22700) 168000 ₄₄ _9.3 10 (IV) weekly e 663 (133) 68600 (23000) 274000 ₉₆ ₁₅ 10 monthly g 115 ( 37) 48200 (21100) 48200 ₁₇ _2.7 12.5 weekly f 282 ( 90) 41000 (10600) 164000 ₄₁ _9.1 50 monthly g 666 (156) 268000 (90000) 268000 ₉₆ ₁₅

a _{At end of dosing.}b_{Relative to mean Cmax and AUC0-4 week values [6.94 µg/mL and 752 µg·day/mL (18048 µg·hr/mL), respectively] at steady state for the 120 mg Q4W dose} regimen in patients with breast cancer and bone metastases in study 20040113 (rounded to 2 significant figures). c SC dosing except where indicated. dCalculated by multiplying AUC0-tau values for weekly and monthly dosing by 4 and 1, respectively. e_{Study 101447 (dosed for 4 weeks, combined male and female data).}f_{Study 102842 (dosed for 5 weeks,} gestation days 20 through 50, females only). g_{Study 102090 (dosed for 12 months, combined male and female data).}

SD = standard deviation; Cmax = maximum observed serum denosumab concentration; AUC0-tau = area under the concentration-time curve during the dosing interval; AUC0-4 weeks = area under the concentration-time curve over a 4-week period; IV = intravenous; SC = subcutaneous; Q4W = once every 4 weeks.

(24)

4. 毒性試験：被験物質（バッチ毎）一覧

Table 4. Toxicology: Drug Substance Test Article: AMG 162

Lot # Purity (%) Placebo Lot No.

CRO Study

Number Type of Study A0010170015 99.4 (SE-HPLC) A0010260000 SBL 39-50

1129-01

1-Month toxicity in cynomolgus monkeys Safety pharmacology in cynomolgus monkeys A0106290000 99.6 (SE-HPLC) A0108030000 1052-011 6/12-Month toxicity in cynomolgus monkeys

A0106290000 NA 1407-01 Tissue cross-reactivity

A0111300000 99.3 (SE-HPLC) A0108030000 1052-011 1052-013 1052-014

6/12-Month toxicity in cynomolgus monkeys Female fertility in cynomolgus monkeys

Embryo-fetal development in cynomolgus monkeys 049A114185 99.6 (SE-HPLC) 049A107097 FIA00588 Pre and postnatal development in cynomolgus

monkeys

092900a _NA _IM760

IM693

Tissue cross-reactivity Tissue cross-reactivity a _{Purity data not available. NA = not applicable.}

(25)

7

5. 単回投与毒性試験

Table 5. Single-dose Toxicity Test Article: AMG 162

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6. 反復投与毒性試験：重要な試験以外の試験

Table 6. Repeated dose Toxicity: Non-pivotal Studies Test Article: AMG 162

(27)

2.6.7毒性試験概要表デノスマブ

7 反復投与毒性試験: 重要な試験

Tab1e 7A. Repeated dose Toxicity: Pivota1 Studies TestArticle: AMG 162

Repeated-dose Toxicity Report Title: A 1-Month Study Eva1uating theEffect TestArticle: AMG 162 on Bone of AM G 162 AdministeredSubcutaneous1yor Intavenous1y in Cynom01gus Monkeys with a 3-Month Recovery Period Duration ofDosing: Onceweek1y for 1 month Duration ofPostdose: 3 months Intravenous Vehicle/Formu1ation: 10 m M Na acetate， 5% sorbit01， pH 5.2

Specia1 Features: Antibody Ana1ysis， Bone BiomarkersヲBoneMinera1Density No Observed Adverse Effect Level: 10 mglkg

Dose (mg/kg/dose) 0 (SC) Number of Anima1s M: 6 F: 6 Species/Strain: Monkey/Cynom01gus Initia1 Age: 3 to 5 years D山 ~Fir~Dose: . _ 2

掴

(ma

同

.

_ 2掴(白ma1e0 Method of Administration 01 (SC) 恥1:6 F: 6 Toxicokinetics: AUCO-168 (μg hr/mL) Day 1 Day 21 Binding Antibodies % (incidence) End of Dosing End of Recovery Noteworthy Findings Died or Sacrificed Moribund Body Weight Food Consumption NA NA 195 349

o

(0112)

o

(0112) 100 (12112) 100 ( 6/6) ハリハリハリハリ Amgen Study No. 101447 SNBL StudyNo. SBL 39-50 Subcutaneous or GLP Compliance: Yes 1.0 (SC) 10.0 (SC) M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 1800 20200 3410 42000 67 (8112) 33 (4112) 100(6/6) 100 (6/6)

。。。。

-f h u ) -_F V

一

T ﹃ i E A U -ハり -l -6 一 M 48700 68600 25 (3112) 67 (4/ 6) ハリハリ Page 1 of3 a Percent change from baseline. -No noteworthy findings; AUC = alea under仕lep1asma合ugconcen仕組on-timeCUlve; BCE = bonecollegen equivalentsヲ F = femaleに IV = intravenous; M = mal巴Sラ NA = not applicab1e; SC = subcutaneous.

*

pく0.05ヲ料 pく0.01comparedwi吐lcon仕01usingDUlillettラst-test 9

(28)

Table 7A. Repeated dose Toxicity: Pivotal Studies Test Article: AMG 162

Repeated-dose Toxicity Amgen Study No. 101447

Dose (mg/kg/dose) 0 (SC) 0.1 (SC) 1.0 (SC) 10.0 (SC) 10.0 (IV) Number of Animals M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 Clinical Observations - - - -Ophthalmoscopy - - - -Hematology - - - -Coagulation - - - -Serum Chemistry

Alkaline Phosphatase (IU/L) 539.2 262.8 363.0 138.5** 374.2 151.7** 300.7* 133.3** 297.5* 177.7* Ca (mg/dL) 10.73 9.85 10.45 9.80 9.27** 10.00 9.05** 9.97 9.50** 9.70

Blood Ca++ (mmol/L) - - -

-Urinalysis - - -

-Bone Metabolic Markers (Day 24)

N-telopeptide (nM BCE) 55.6 41.8 18.3 10.6 8.6

Osteocalcin (ng/mL) 42.2 30.9 26.5 24.8 22.4

Bone Mineral Density (mg/cm3, % change) a Tibia

Total 9.0 2.7 5.5 7.3 25.8* 5.7 22.3 5.0 18.3 3.5

Cortical 8.8 3.0 4.8 5.8 25.3* 2.8 19.5 6.3 16.5 4.3

Page 2 of 3 a _{Percent change from baseline. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collegen equivalents; F = females; IV} = intravenous; M = males; NA = not applicable; SC = subcutaneous. * p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test.

(29)

11 Table 7A. Repeated dose Toxicity: Pivotal Studies

Test Article: AMG 162

Dose (mg/kg/dose) 0 (SC) 0.1 (SC) 1.0 (SC) 10.0 (SC) 10.0 (IV) Number of Animals M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 M: 6 F: 6 Organ Weights - - - Thyroid Absolute Weight (Δ%)a) 0.307 g 0.350 g 29 40 29 48 57 28 13 97** Relative Weight (Δ%)a) 0.0760 g% 0.1057 g% 32 37 34 47 67 31 19 103** Gross Pathology - - - Ovary Cyst, bilateral 0 0 0 0 1 Histopathology - - - Ovary Cyst, oviduct 0 0 0 0 1

Postdose Evaluation (Recovery)

Number Evaluated 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Bone Metabolic Markers (Day 119)

N-telopeptide (nM BCE) 45.7 55.9 57.4 59.5 40.3

Osteocalcin (ng/ml) 46.8 32.4 40.9 36.6 25.7

Bone Mineral Density (mg/cm3, % change)b) Tibia

Total (Recovery Week 13) 7.0 -1.0 1.0 -1.0 22.0 -2.7 23.0 8.3 14.0 2.7 Cortical (Recovery Week 13) 4.0 2.0 2.7 1.0 18.0 -0.7 19.3 6.3 12.7 -0.3 Radius

Total (Recovery Week 4) -0.3 -1.3 3.0 -2.0 16.0* 1.3 13.7 5.7 17.0 4.0 Cortical (Recovery Week 4) -1.3 -1.0 2.3 0.7 13.7 0.7 12.0 4.0 15.0* 2.7

Page 3 of 3 - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collegen equivalents; F = females; IV = intravenous; M = males; NA = not applicable; SC = subcutaneous. * p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test.

a) Δ%: For controls, group means are shown. For treated groups, percent differences from controls are shown. Statistical significance is based on actual data (not on the percent differences), b) Percent change from baseline.

(30)

デノスマブ Tab1e 7B. Repeated dose Toxicity: Pivota1 Studies TestArticle: AMG 162 Repeated-doseToxicity Species/Strain Monkey /Cynomo1gus Initia1Age: 2.5to

面

rs Date ofFirstDose: . _ 2~ 2.6.7毒性試験概要表

Report Title A6112ふ10nthSubcutaneousToxicity TestArtic1e AMG 162

Study of A MG 162 in theCynomo1gus Monkey with an

Interim Killafter 6 Months and a 3ふ10nthRecovery

Period

Durationof Dosing Month1y for6 or 12 months Amgen Study No. 102090

Duration of Postdose 3 months CRO StudyNo. 1052-011

Method of Administration Subcutaneous

VehicleIFormu1ation 10 m M sodium acetate， 5% GLP Compliance Yes

sorbito1， pH 5.2

Specia1 Features ImmunophenotypingョAntibodyAna1ysis， Immunog1obulinLeve1s， Bone Biomarkers， Testicu1arTissueEva1uation of Sperm Motilityヲ

Bone Minera1 Density， and Biomechanics No ObservedAdverse Effect Leve1 50 mg/k Month1y Dose (mg/kg/dose)

o

(Contro1) 10 50 Number of Anima1s M:8 F: 8 M: 8 F: 8 M:8 F:8 孔1:8 F: 8 Toxicokinetics AUC(μg.hr/mL) Day 1 " N A 4100 61500 343000 Day 337" N A BQL 48200 268000 Antibody Ana1ysis% (incidence) Binding Antibodies 6 Month (Week 24)

。

(0116) 100 (16116) 50 (8116) 7 (1115) 12 Month (Week 52)

。

(0110) 100 (10110) 60 (6110) 22 (2/9) Recovery (Week 6

の

。

(0/4) 100 (4/4) 75σ/4) 67θ/3) Page1 of11 a Results basedon animals negative for binding antibodi巴s. b Data pr巴S巴ntedare for anima1s吐latw巴repositive for binding antibodies. In addition， 1むumaldos邑dat 10 mg/kg and 5 anima1s dosedat50 mglkgwerenegative for binding antibodies butpositive forneutralizing antibodi巴s.C Groupmean percentchange frombaselineto week 52. d Incidenceis pr巴sent巴d. *pく0.05，帥pく0.01comparedwithcon仕01usingDunnett'st-test. -No noteworthy findings; AUC = area under吐leplasma合ugconcentration-time curve;BCE = bone collag叩巴quivalents;BQL = below quantification limit;NA = notapplicabl巴 NTx =urineN・telopeptid巴;UCRT = urine creatinin巴

(31)

13 Table 7B. Repeated dose Toxicity: Pivotal Studies

Monthly Dose (mg/kg/dose) 0 (Control) 1 10 50

Number of Animals M: 8 F: 8 M: 8 F: 8 M: 8 F: 8 M: 8 F: 8

Antibody Analysis % (incidence) Neutralizing Antibodies b

6 Month (Week 24) 0 (0/16) 75 (12/16) 38 (6/16) 13 (2/15)

12 Month (Week 52) 0 (0/10) 70 ( 7/10) 60 (6/10) 22 (2/ 9) Recovery (Week 66) 0 (0/ 4) 75 ( 3/ 4) 75 (3/ 4) 67 (2/ 3) Noteworthy Findings

Died or Sacrificed Moribund 0 0 0 0 0 0 2 0

Body Weight - - - -Food Consumption - - - -Clinical Observations - - - -Ophthalmoscopy - - - -Electrocardiography - - - -Blood Pressure - - - -Hematology - - - -Coagulation - - - -Serum Chemistry - - - -Urinalysis - - - -Immunoglobin Values - - - -Immunophenotyping - - -

-Sperm Motility Evaluation - - -

-Testicular Tissue Composition - - -

-Gross Pathology - - -

-Organ Weights - - -

-Page 2 of 11 a

Results based on animals negative for binding antibodies. b Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. c_{Group mean percent change from baseline to week 52.}d_{Incidence is} presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

(32)

Table 7B. Repeated dose Toxicity: Pivotal Studies Test Article: AMG 162

Biomechanics - - -

-Bone Mineral Density (mg/cm3, % change) c

Tibia (total) -11.4 -1.9 -6.4 -4.2 -2.1 7.3 30.1 14.6

Radius (total) - 7.6 -3.7 3.7 -2.3 -0.5 18.9 11.8 21.8

Bone Mineral Content (mg, % change) c

Tibia (total) -4.1 2.6 -3.8 -7.6 2.0 21.0 66.0 30.3

Radius (total) -1.0 -4.6 7.0 -3.0 7.1 17.5 48.6 39.6

Page 3 of 11 a _{Results based on animals negative for binding antibodies.}b _{Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and} 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. cGroup mean percent change from baseline to week 52. d Incidence is presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

(33)

Bone Turnover Biomarkers Osteocalcin (ng/mL) Week 13 45.6 24.9 31.6 20.1 20.9* 7.9** 7.9** 5.9** Week 25 37.3 26.0 38.4 25.4 30.3 13.5* 7.6* 6.6** Week 37 60.0 21.8 46.0 27.3 31.1 14.3 9.6* 7.3 Week 53 58.0 27.9 47.4 25.2 36.8 16.4 17.4 6.8 Serum C-telopeptide (pM) Week 13 14211.8 13742.7 13832.5 14857.5 8965.5 6693.0* 4675.9** 5160.7** Week 25 20105.1 17494.6 25185.8 19203.2 17550.9 8582.6 9625.0 4411.1* Week 37 24618.1 15570.0 27180.3 18020.4 23738.0 9429.9 12681.5 3908.2 Week 53 22123.9 12375.5 22283.2 13989.7 19244.5 8145.4 3688.9* 3685.9 Urine N-Telopeptide (nM BCE

NTx/mM UCRT) Week 13 439.6 278.5 496.4 246.9 189.6 52.3* 22.7* 38.6** Week 25 359.2 228.9 370.5 334.9 192.8 113.9 83.7 37.2* Week 37 515.8 505.8 484.6 551.2 322.4 206.7 51.3* 99.3 Week 53 433.3 265.5 440.6 308.6 248.7 149.5 35.2 63.5 Page 4 of 11 a _{Results based on animals negative for binding antibodies.}b _{Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and} 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. cGroup mean percent change from baseline to week 52. d Incidence is presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

(34)

Histopathology (Interim, number evaluated) d

3 3 3 3 3 3 2 3

Femur

Epiphyseal growth plate, enlarged

Minimal 0 0 0 0 1 1 0 0 Moderate 0 0 0 0 2 0 0 0 Marked 0 0 0 0 0 0 1 0 Decreased chrondroclasis Minimal 0 0 0 0 1 1 0 0 Moderate 0 0 0 0 2 0 0 0 Marked 0 0 0 0 0 0 1 0 Decrease of osteoclast/ostesoblast 0/0 0/0 0/0 0/0 2/2 2/2 2/2 2/2 Page 5 of 11 a

Results based on animals negative for binding antibodies. b Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. c_{Group mean percent change from baseline to week 52.}d_{Incidence is} presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

(35)

Histopathology (Interim, continued, number evaluated) d

3 3 3 3 3 3 2 3

Left Tibia

Slight 0 0 0 0 0 1 0 0 Minimal 0 0 0 0 1 0 0 0 Moderate 0 0 0 0 2 1 1 3 Marked 0 0 0 0 0 0 1 0 Decreased chrondroclasis Slight 0 0 0 0 0 1 0 0 Minimal 0 0 0 0 1 0 0 0 Moderate 0 0 0 0 2 1 1 3 Marked 0 0 0 0 0 0 1 0 Decrease of osteoclast/ostesoblast 0/0 0/0 0/0 0/0 2/1 2/2 2/2 3/3 Page 6 of 11 a _{Results based on animals negative for binding antibodies.}b _{Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and} 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. c_{Group mean percent change from baseline to week 52.}d_{Incidence is} presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

(36)

Histopathology (Interim, continued, number evaluated) d

3 3 3 3 3 3 2 3

Sternum

Decreased chrondroclasis, minimal 0 0 0 0 0 0 1 0

Decrease of osteoclast/ostesoblast 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 1/1 2/2 2/2 Histopathology (Terminal, number

evaluated) d

3 3 3 3 3 3 3 3

Femur

Slight 0 0 0 0 0 0 1 1

Moderate 0 0 0 0 0 0 1 0

Marked 0 0 0 0 1 0 1 0

Page 7 of 11 a _{Results based on animals negative for binding antibodies.}b _{Data presented are for animals that were positive for binding antibodies. In addition, 1 animal dosed at 10 mg/kg and} 5 animals dosed at 50 mg/kg were negative for binding antibodies but positive for neutralizing antibodies. c_{Group mean percent change from baseline to week 52.}d_{Incidence is} presented. *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control using Dunnett’s t-test. - No noteworthy findings; AUC = area under the plasma drug concentration-time curve; BCE = bone collagen equivalents; BQL = below quantification limit; NA = not applicable. NTx = urine N-telopeptide; UCRT = urine creatinine.

デノスマブ 毒性試験の概要文 目次 1. まとめ 単回投与毒性試験 反復投与毒性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) サルの 1 ヵ月反復投与試験 サルの 6/12ヵ月反復投与試験 遺伝毒性試験...10

目次

1.

まとめ

2.

単回投与毒性試験

3.

反復投与毒性試験（トキシコキネティクス評価を含む）

3.1

サルの 1 ヵ月反復投与試験

3.2

サルの 6/12 ヵ月反復投与試験

4.

遺伝毒性試験

5.

がん原性試験（トキシコキネティクス評価を含む）

6.

生殖発生毒性試験（用量設定試験及びトキシコキネティクス評価を含む）

6.1

受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験

6.2

胚・胎児発生に関する試験

6.3

出生前及び出生後の発生に関する試験

6.4

新生児を用いた試験

7.

局所刺激性試験

8.

その他の毒性試験（実施している場合）

8.1

抗原性試験

8.2

免疫毒性試験

8.3

毒性発現の機序に関する試験

8.4

依存性試験

8.5

不純物の毒性試験

8.6

その他の試験

9.

考察及び結論

10. 参考文献

目次

1.

毒性試験： 一覧表

2.

トキシコキネティクス： トキシコキネティクス試験の一覧表

3.

トキシコキネティクス： トキシコキネティクス試験成績の一覧

4.

毒性試験： 被験物質（バッチ毎）一覧

5.

単回投与毒性試験

6.

反復投与毒性試験： 重要な試験以外の試験

7

反復投与毒性試験: 重要な試験

掴

同

.

o

o

。 。 。 。

一

*

面

o

。

。

の

。

デノスマブ毒性試験の概要文目次 1. まとめ単回投与毒性試験反復投与毒性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) サルの 1 ヵ月反復投与試験サルの 6/12ヵ月反復投与試験遺伝毒性試験...10

毒性試験：一覧表

トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験の一覧表

トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験成績の一覧

毒性試験：被験物質（バッチ毎）一覧

反復投与毒性試験：重要な試験以外の試験

。。。。